®¹i häc quèc gia hµ néi tr­êng ®¹i häc khoa häc tù nhiªn



tải về 1.49 Mb.
trang8/10
Chuyển đổi dữ liệu06.06.2018
Kích1.49 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

60 61 62



63 64



65 66

CHƯƠNG II

NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nhiêm vụ nghiên cứu

Luận văn này nghiên cứu thành phần hoá học của cây Alpinia pinnanensis T. L. Wu et Senjen (Alpinia pinnanensis T. L. Wu et S. J. Chen) (Zingiberaceae) được thu thập ở Lào Cai.

Nhiệm vụ được đề ra cho nghiên cứu trong luận văn này gồm có:

1. Xây dựng quy trình chiết các hợp chất hữu cơ thiên nhiên có từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis;

2. Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) các phần chiết để định tính các phần chiết và xác định các hệ dung môi thích hợp cho phân tách sắc ký cột;

3. Phân tách các phần chiết và phân lập các hợp chất thành phần chính bằng các phương pháp sắc ký điều chế;

4. Xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập bằng các phương pháp phổ hiện đại.

5. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phenolic nhận được.



2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp xử lý mẫu và chiết

Mẫu thực vật sau khi được thu hái được rửa sạch, thái nhỏ và phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy ở 40oC và xay thành bột mịn. Bột nguyên liệu thực vật được ngâm chiết với dung môi axeton ở nhiệt độ phòng. Phần chiết axeton nhận được được phân bố chọn lọc bằng phương pháp chiết hai pha lỏng lần lượt vào các dung môi có độ phân cực tăng dần, n-hexan, điclometan và etyl axetat.

2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

Sắc ký lớp mỏng (TLC) được sử dụng để phân tích định tính các phần chiết, định hướng phân tách các phần chiết, đặc trưng các hợp chất và kiểm tra độ sạch của các hợp chất phân lập.

Sắc ký cột được thực hiện trên chất hấp phụ silica gel theo cơ chế sắc ký hấp phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất thiên nhiên.

Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi.

Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp suất không khí nén.

Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được sử dụng để tinh chế lượng nhỏ (< 15 mg) chất hữu cơ.

Phương pháp kết tinh để tinh chế các chất rắn.

2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc

Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp phổ:

Phổ hồng ngoại (IR);

Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS);

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (­1H-NMR);

Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT.



2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa

Các hợp chất phenolic được phân lập đã được đánh giá hoạt tính chống oxi hóa in vitro theo phương pháp quét gốc tự do DPPH của S. G. Olga et al. (2003).

Thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa được thực hiện tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam.

CHƯƠNG III

PHẦN THỰC NGHIỆM

3.1 Thiết bị và hoá chất



- Các phương pháp sắc ký

Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với lớp silica gel dày 0,2 mm trên nền nhôm. Phát hiện vệt chất bằng dung dịch vanilin/H2SO4 đặc 1% sau đó hơ nóng bản mỏng ở 1200 và đèn tử ngoại ở bước sóng λ = 254 nm.



Sắc ký cột thường (CC)

Sắc ký cột thường được thực hiện dưới trọng lực của dung môi. Chất hấp phụ cho sắc ký cột là silica gel cỡ hạt 63-200 µm (Merck, Darmstadt, CHLB Đức).



Sắc ký cột nhanh (FC)

Phân tách sắc ký cột nhanh được thực hiện dưới áp suất nén. Chất hấp phụ cho FC là silica gel Merck (cỡ hạt 63-200 μm và 63-100 μm) (Merck, Darmstadt, CHLB Đức).

Các cột sắc ký thủy tinh (Sigma-Aldrich) có đường kính khác nhau được sử dụng tùy theo khối lượng mẫu cần phân tách.

Sắc ký cột tinh chế (Mini-C)

Phân tách sắc ký cột tinh chế được sử dụng để tinh chế các hợp chất hữu cơ. Cột Pasteur pippet (0,7 cm i. d. × 10 cm) được nhồi silica gel Merck (cỡ hạt 15-40 μm) (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) được sử dụng cho Mini-C.

Kỹ thuật nhồi cột ướt và đưa mẫu lên cột tẩm trên silica gel hoặc đưa mẫu trực tiếp đã được sử dụng cho các phương pháp sắc ký FC, CC và Mini-C.

- Các phương pháp phổ

Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS)

Phổ EI-MS được đo trên thiết bị HEWLETT PACKARD 5989-MS Engine và Waters Autospec Premier.



Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Các phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được ghi trên thiết bị Bruker Avance 500 với tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero (δ = 0). Độ chuyển dịch hoá học δ được biểu thị bằng ppm. Tính bội của các tín hiệu 13C được xác định trên cơ sở các phổ DEPT 90 và DEPT 135.

3.2 Nguyên liệu thực vật

Thân rễ tươi cây Alpinia pinnanensis T. L. Wu et S. J. Chen (Zingiberaceae) (20 kg) đã được nhà thực vật học, ThS. Nguyễn Quốc Bình (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) thu thập vào tháng 11 năm 2007 tại xã Liêm Phú, Văn Bàn, Lào Cai.

Mẫu sau đó được rửa sạch, thái lát mỏng, phơi khô trong bóng râm và sấy khô ở 40oC. Mẫu khô (1,6 kg) được xay thành bột mịn.

3.3 Điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis

Mẫu bột khô thân rễ cây Alpinia pinnanensis (1,6 kg) được ngâm chiết trong dung môi axeton ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày tiến hành lọc, thu được dịch chiết axeton đầu tiên. Tiến hành lặp lại quá trình ngâm mẫu trong axeton thêm 4 lần nữa. Cuối cùng lọc bỏ bã thực vật thu được dịch chiết axeton. Dịch chiết sau 5 lần ngâm chiết được gộp lại và được cất loại kiệt dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ từ 40 – 50oC để tránh làm biến chất cho đến khi thu được phần chiết axeton là một cặn tương đối sệt.

Hoà loãng phần chiết axeton này trong nước cất và lần lượt chiết dịch nước nhận được với các dung môi n-hexan, điclometan và etyl axetat. Các dịch chiết nhận được được làm khan bằng Na2SO4 sau đó được cất loại kiệt dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 50oC, thu được các phần chiết tương ứng ký hiệu là AP1 (phần chiết n-hexan), AP2 (phần chiết điclometan) và AP3 (phần chiết etyl axetat).

Quy trình điều chế các phần chiết được nêu trên Sơ đồ 1, Mục 4.2; Chương 4: Kết quả và Thảo luận.

Xác định khối lượng các phần chiết và tính hiệu suất so với lượng mẫu khô ban đầu. Kết quả được trình bày ở Bảng 2.



Bảng 2: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis

STT

Phần chiết

Ký hiệu

Khối lượng (g)

Hiệu suất chiết (%)

1

n-Hexan

AP1

21,1

1,32

2

Điclometan

AP2

49,2

3,01

3

Etyl axetat

AP3

3,8

0,23



3.4 Phân tích thành phần các phần chiết bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) trên nền nhôm. Tuỳ từng phần chiết mà lựa chọn trong các hệ dung môi triển khai khác nhau để cho các sắc ký đồ phân giải tốt các hợp chất trong các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis.

3.4.1 Phần chiết n-hexan (AP1)

Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết n-hexan (AP1) được thực hiện với các hệ dung môi triển khai n-hexan-axeton (tỷ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1, v/v). Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.

Các kết quả phân tích TLC phần chiết n-hexan được trình bày ở Bảng 3, Mục 4.3.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận.

3.4.2 Phần chiết điclometan (AP2)

Phần chiết điclometan (AP2) được phân tích TLC với các hệ dung môi n-hexan-axeton (tỷ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1, v/v). Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.

Các kết quả phân tích TLC được phần chiết điclometan trình bày trên Bảng 4, Mục 4.4.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận.

3.4.3 Phần chiết etyl axetat (AP3)

Phần chiết etyl axetat (AP3) được phân tích với TLC với các hệ 3 dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic với các tỷ lệ 20:19:1, 20:15:1 và 20:19:0,5, hệ etyl axetat-axit fomic-nước với tỷ lệ 30:2:3, và hệ etyl axetat-metanol-nước với tỷ lệ 30:5:4. Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1% và FeCl3 5%.

Các kết quả phân tích TLC được trình bày trên Bảng 5, Mục 4.5.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận.

3.5 Phân tách sắc ký các phần chiết và phân lập các hợp chất

3.5.1 Phân tách phần chiết n-hexan (AP1)

Phần chiết n-hexan AP1 (10 g) được hoà tan trong CH2Cl2 sau đó được hấp phụ trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 µm). Khuấy đều cho đến khi silica gel hấp phụ đều hết dung dịch mẫu cho đến khi khô đều.

Cho silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 µm) vào n-hexan và khuấy đều cho đến khi hết bọt khí. Sau đó đổ silica gel ở dạng bột nhão vào cột sắc ký (Φ = 3 cm i.d.) đến chiều cao 30 cm. Cho dung môi n-hexan đi qua cột nhiều lần để nén đều cột đến khi lớp silica gel hoàn toàn ổn định.

Đưa mẫu đã tẩm trên silica gel lên cột CC. Rửa giải cột sắc ký gradient bằng hệ dung môi n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1 (v/v). Các phân đoạn được thu theo 50 ml/phân đoạn. Kiểm tra quá trình rửa giải sắc ký bằng TLC, kết quả thu được 24 nhóm phân đoạn được ký hiệu từ AP1.1 đến AP1.24­.

Các nhóm phân đoạn AP1.11 (150 mg) và AP1.12 (670 mg) được rửa nhiều lần bằng n-hexan cho chất AP1.11 (101 mg) và AP1.12 (203 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.

Nhóm phân đoạn AP1.15 (44 mg) được rửa bằng n-hexan cho chất AP1.15 (25 mg) dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng nhạt.

Nhóm phân đoạn AP1.18 (1,1 g) được phân tách sắc ký CC (2 cm i.d. x 20 cm) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 µm) với hệ dung môi gradient n-hexan-axeton 6:1 đến 1:1 cho chất AP1.18.3 (321 mg) dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt.

Nhóm phân đoạn AP1.20 (1,13 g) được cho chạy sắc ký cột CC (2 cm i.d. x 25 cm) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-100 µm), hệ dung môi gradient n-hexan-axeton 7:1 và 5:1 cho năm nhóm phân đoạn chính sau các phân tích TLC từ AP1.20.1 đến AP­­1.20.5. Các nhóm phân đoạn AP1.20.3AP1.20.4 được gộp lại và phân tách CC (2 cm i.d. x 20 cm) với gradient n-hexan-axeton 7:1, 5:1 và 3:1 (silica gel Merck cỡ hạt 40-63 µm). Kết quả thu được chất AP1.20.3.2 (356 mg) dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng ánh.

Nhóm phân đoạn AP1.22 (190 mg) được rửa bằng axeton cho chất AP1.22 (23 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.



3.5.2 Phân tách phần chiết điclometan (AP2)

Phần chiết điclometan AP­2 (4,1 g) được hoà tan trong một lượng vừa đủ CH2Cl2 và được tẩm trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 µm) cho một hỗn hợp bột mịn màu vàng.

Nhồi cột ướt silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 µm) vào cột phân tách CC (Φ = 3 cm i.d.) đến chiều cao 30 cm. Đưa phần chiết tẩm silica gel lên cột, rửa giải gradient bằng hệ dung môi n-hexan-axeton 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1 (v/v), thu các phân đoạn theo 50 ml/phân đoạn. Kiểm tra quá trình phân tách bằng TLC. Kết quả thu được 21 nhóm phân đoạn được ký hiệu từ AP2.1 đến AP2.21.

Nhóm phân đoạn AP2.11 (200 mg) ở dạng gel được chạy CC (2 cm i.d. x 20 cm) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-100 µm) với hệ dung môi n-hexan-axeton 6:1, thu được chất AP2.11.3 dưới dạng gel màu vàng. Tinh chế tiếp AP2.11.3 với cột CC (1,5 cm i.d. x 20 cm) với hệ điclometan-axeton 25:1, thu được chất AP2.11.3.3 (83 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.

Nhóm phân đoạn AP2.16 (150 mg) được kết tinh trong hệ dung môi n-hexan-axeton cho chất AP2.16 (135 mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng.

Nhóm phân đoạn AP2.17 (18,7mg) và AP2.18 (18,7mg) được rửa bằng CH2Cl2 cho các chất AP2.17 (15,6 mg) và AP­2.18 (3,1 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.

3.5.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (AP3)

Phần chiết etyl axetat AP3 (3,8 g) được hoà tan vừa đủ trong metanol và được tẩm với silica gel (Merck, cỡ hạt 63-100 µm) cho một chất bột mịn màu vàng.

Nhồi silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt vào cột tách CC (Φ = 2,5 cm i.d.) đến chiều cao 30 cm.

Đưa mẫu tẩm silica gel lên cột, rửa giải gradient bằng hệ 3 dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic, thu các phân đoạn theo 20 ml/phân đoạn cho 13 nhóm phân đoạn chính được ký hiệu từ AP3.1 đến AP3.13.

Chất AP3.4 (87 mg) được tách ra từ nhóm phân đoạn AP3.4 (96 mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng.

Nhóm phân đoạn AP3.13 (0,67 g) được rửa bằng n-hexan và axeton cho chất AP3.13 (63 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.

3.6 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất được phân lập

β-Sitosterol (AP­1.11)

Bột vô định hình màu trắng.

Rf = 0,24 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 9:1, v/v).

Hiện màu tím với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.

IR (KBr): υmax cm-1 3427, 1637, 1461, 1379, 1056.

6β-Hiđroxistigmast-4-en-3-on (AP1.15)

Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 200-202oC.

Rf = 0,21 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v).

Hiện màu vàng chanh với thuốc thử vanilin/H2SO đặc 1%.

EI-MS: m/z (%) 428 (M+., C29H48O2, 37,8), 413 (6,7), 227 (18,5), 152 (57,9), 81 (41,2), 69 (45,4), 55 (100).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm): δ 0,74 (3H, s, H3-18), 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, H3-26), 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, H3-27), 0,85 (3H, t, J = 7,5 Hz, H3-29), 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H3-21), 1,38 (3H, s, H3-19), 2,37 (1H, dt, J = 17,0 Hz, 3,0 Hz, H-2a), 2,51 (1H, ddd, J = 17,0 Hz, 15,0 Hz, 5,0 Hz, H-2b), 4,35 (1H, dd, J = 2,5 Hz, 2,0 Hz, H-6), 5,81 (1H, s, H-4).

13C-NMR/DEPT (125 MHz, CDCl3, ppm): δ 11,9 (q, C-18), 12,0 (q, C-29), 18,7 (q, C-21), 19,1 (q, C-26), 19,5 (q, C-27), 19,8 (q, C-19), 20,9 (t, C-11), 23,1 (t, C-28), 24,2 (t, C-15), 26,1 (t, C-23), 28,2 (t, C-16), 29,2 (d, C-25), 29,8 (d, C-8), 33,9 (t, C-22), 34,3 (t, C-7), 36,1 (d, C-20), 37,1 (t, C-1), 38,0 (s, C-10), 38,6 (t, C-2), 39,6 (t, C-12), 42,5 (s, C-13), 45,9 (d, C-24), 53,7 (d, C-9), 55,9 (d,C-17), 56,1 (d, C-14), 73,3 (d, C-6), 126,3 (d, C-4), 168,6 (s, C-5), 200,2 (s, C-3).

trans-3S,5S-Đihidroxi-1,7-điphenyl-1-hepten (AP1.18.3)

Tinh thể hình kim màu vàng nhạt, đ.n.c. 75-77oC.

Rf = 0,23 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 4:1, v/v).

Hiện màu xanh lam với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.

EI-MS: m/z (%) 282, (M+., C19H22O2, <1), 264 (10,1), 135 (21), 133 (37,8), 104 (68,9), 91 (100), 77 (27,3), 55 (36,1).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm): δ 1,7-1,9 (4H, m, 2H-4, 2H-6), 2,67-2,83 (2H, m, 2H-7), 2,83 (1H, brs, OH), 2,95 (1H, brs, OH), 3,96 (1H, quintet, J = 6,5 Hz, H-5), 4,54 (1H, q, J = 6,5 Hz, H-3), 6,21 (1H, dd, J = 6,5 Hz, 16 Hz, H-2), 6,58 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-1), 7,17-7,37 (10H, m, H-2′, H-3′, H-4′, H-5′, H-6′, H-2′′, H-3′′, H-4′′, H5′′, H-6′′).

13C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm ): δ 31,7 (t, C-7), 39,7 (t, C-6), 43,5 (t, C-4), 71,6 (d, C-5), 73,6 (d, C-3), 125,9 (d, C-4′), 126,5 (d, C-2′, C-6’′), 127,8 (d, C-4′′), 128,4 (d, C-3′, C-5′), 128,5 (d, C-3′′, C-5′′), 128,6 (d, C-2′′, C-6′′), 130,2 (d, C-2), 131,9 (d, C-1), 136,6 (s, C-1′′), 141,9 (s, C-1′).

Alpinentin (AP1.22 = AP3.13)

Bột vô định hình màu trắng.

Rf = 0,21 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc-HCOOH 15:15:1, v/v).

Hiện màu vàng với thuốc thử vanilin/HSO4 đặc 1%.

EI-MS: m/z (%) 270 (M+., C16H14O4, 63,9), 269 (26,9), 193 (54,5), 166 (100), 138 (56,3), 123 (19,3), 104 (54,7), 77 (28,3).

Cardamomin (AP3.4 = AP1.20.3.2 = AP2.16)

Bột vô định hình màu vàng.

Rf = 0,14 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v).

Hiện màu vàng chanh với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.

EI-MS: m/z (%) 270 (M+., C16H14O4, 63,9), 269 (54,7), 193 (100), 167 (34,4), 152 (46,8), 138 (15,1), 124 (12,8), 103 (31,1), 77 (45,4), 69 (37,8).

1H-NMR (DMSO-d6): δ 3,88 (3H, s, 6′-CH3), 5,93 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-3′), 6,03 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5′), 7,42-7,48 (3H, m, H-3, H-4, H-5), 7,65 (1H, d, J = 16,0 Hz, Hα), 7,71 (2H, dd, J = 8,0 Hz, 2,5 Hz, H-2, H-6), 7,82 (1H, d, J = 16,0 Hz, Hβ), 13,7 (1H, s, 5-OH).

13C-NMR/DEPT (DMSO-d6): δ 55,9 (q, 6′-OCH3), 91,7 (d, C-3′), 95,8 (d, C-5′), 127,5 (d, Cα), 128,2 (d, C-2, C-6), 128,9 (d, C-3, C-5), 130,1 (d, C-4), 134,9 (s, C-1), 141,6 (d, C-8), 162,6 (s, C-6′), 164,9 (s, C-4′), 166,1 (s, C-2′), 191,6 (C=O).

β-Sitosterol 3-O-β-D-glucopyranozit (AP2.18)

Bột vô định hình màu trắng.

Rf = 0,55 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 1:1, v/v).

Hiện màu vàng với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.

EI-MS: m/z (%) 414 (46,7), 396 (68,0), 381 (20,7), 329 (23,3), 303 (27,3), 255 (29,3), 213 (33,3), 145 (41,3), 135 (100), 107 (41,3).

3.7 Thử hoạt tính chống oxi hóa: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH

Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của S. G. Olga và cộng sự (2003). Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazin (DPPH ) có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hòa. Khi cho các chất thử nghiệm vào dung dịch này, nếu chất có khả năng quét các gốc tự do sẽ có khả năng làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dung dịch thử nghiệm so với đối chứng, khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng λ = 515 nm. Các mẫu có hoạt tính quét gốc tự do SC ≥ 50% sẽ được thử nghiệm để xác định giá trị SC50.

Xác định giá trị SC50 (μg/ml);

Mẫu được pha theo 5 thang nồng độ. Giá trị SC50 được xác định bằng chương trình Table Curve thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa bởi chất khử.

CHƯƠNG IV

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Đối tượng nghiên cứu

Thân rễ tươi cây Alpinia pinnanensis T. L. Wu et Senjen (T. L. Wu et S. J Chen) (Zingiberaceae) đã được nhà thực vật học, ThS. Nguyễn Quốc Bình (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) thu thập vào tháng 11 năm 2007 ở xã Liêm Phú, Văn Bàn, Lào Cai.

Mẫu tươi được xử lý và được sấy khô ở 40oC, sau đó nghiền nhỏ thành bột mịn.



4.2 Điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis

Phương pháp chiết có ảnh hưởng rất lớn đến việc phân tách lớp chất. Trong nghiên cứu này, một quy trình chiết chọn lọc với các dung môi có độ phân cực tăng dần đã được xây dựng.

Mẫu sấy khô được nghiền nhỏ và ngâm chiết với dung môi axeton ở nhiệt độ phòng (4 lần, mỗi lần trong ba ngày). Dịch chiết axeton nhận được sau khi cất loại dung môi được pha với nước cất và chiết lần lượt được với n-hexan, điclometan và etyl axetat. Cất loại kiệt dung môi các dịch chiết, ta thu được các phần chiết tương ứng, kí hiệu là AP1, AP2 AP3.

Quy trình điều chế các phần chiết n-hexan (AP1), điclometan (AP2) và etyl axetat (AP3) được nêu trên Sơ đồ 1.


1. Phơi khô, sấy ở 45-50oC

2. Xay thành bột mịn



Thân rễ tươi

(20 kg)


Bột khô xay mịn

(1,6 kg)





1. Ngâm chiết với axeton ở nhiệt độ phòng

2. Cất loại axeton dưới áp suất giảm

3. Hoà phần chiết axeton bằng nước cất

Dịch nước





1. Chiết bằng n-hexan

2. Làm khan bằng Na2SO4

3. Lọc loại bỏ Na2SO4

4. Cất loại n-hexan





1. Chiết bằng điclometan

2. Làm khan bằng Na2SO4

3. Lọc loại bỏ Na2SO4

4. Cất loại điclometan



Phần chiết n-hexan

(AP1, 21,1 g, 1,32%)

Phần chiết điclometan

(AP2, 49,2 g, 3,01%)

1. Chiết với etyl axetat

2. Làm khan bằng Na2SO4

3. Lọc loại bỏ Na2SO4

4. Cất loại etyl axetat



Dịch nước



Phần chiết etyl axetat (AP3, 3,8 g, 0,23%)


Sơ đồ 1: Quy trình chiết các hợp chất hữu cơ

từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis

4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của phần chiết n-hexan (AP1)

4.3.1 Phân tích phần chiết n-hexan(AP1)

Phân tích TLC sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel DC Alufolien 60 F254 (Merck), hệ dung môi n-hexan-axeton. Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.



Kết quả phân tích TLC với các hệ dung môi phân giải tốt được trình bày ở Bảng 3.

Bảng 3: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (AP1)

Hệ dung môi

n-hexan-axeton

STT

Rf

Dạng vệt

Hiện màu

19:1

1

0,81

tròn

xanh

2

0,23

tròn

tím

9:1

1

0,95

dẹp

tím

2

0,88

dẹp

xanh

3

0,33

tròn to

tím

4

0,06

tròn nhỏ

vàng

6:1

1

0,98

dẹp

tím

2

0,94

tròn to

xanh nhạt

3

0,60

tròn nhỏ

tím

4

0,50

tròn

tím

5

0,33

tròn

tím

6

0,15

tròn

vàng

3:1

1

0,95

dẹp

tím

2

0,88

dẹp

xanh nhạt

3

0,66

tròn

tím

4

0,55

tròn

tím

5

0,44

tròn

cam

6

0,40

tròn

xanh

7

0,32

tròn

vàng

8

0,20

tròn

tím nhạt

1:1

1

0,92

dẹp

tím

2

0,90

dẹp

xanh

3

0,60

tròn

tím



4.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan(AP1)

Phần chiết n-hexan (AP1) được phân tách bằng sắc ký cột (CC) gradient trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 µm) với các hệ dung môi rửa giải n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1.

Phân tách hệ thống đã phân bố các nhóm hợp chất trong AP1 theo độ phân cực, từ AP1.1 đến AP1.8 (n-hexan-axeton 19:1, hiệu suất phân lập 37,8 %), từ AP1.9 đến AP1.12 (n-hexan-axeton 9:1, hiệu suất phân lập 6,0 %), từ AP1.13 đến AP1.15 (n-hexan-axeton 6:1, hiệu suất phân lập 5,1 %), từ AP1.16 đến AP1.20 (n-hexan-axeton 3:1, hiệu suất phân lập 44,6 %) và từ AP1.21 đến AP1.24 (n-hexan-axeton 1:1, hiệu suất phân lập 8,0 %).

Các phân đoạn AP1.1, AP1.2, AP1.3 AP1.4 chứa chủ yếu là các hợp chất dễ bay hơi từ thân rễ cây A. pinnanensis.

Nhóm phân đoạn AP1.11AP1.12 được rửa bằng n-hexan cho các chất AP1.11AP1.12 dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Các hợp chất đã được phân tích định tính bằng các phương pháp TLC so sánh và co-TLC cho thấy sự đồng nhất với mẫu chuẩn β-sitosterol. Như vậy β-sitosterol đã được phân lập với tổng hiệu suất là 1,3 % so với phần chiết n-hexan AP1.

Nhóm phân đoạn AP1.15 được rửa bằng n-hexan cho hợp chất AP1.15 dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng.

Nhóm phân đoạn AP1.18 được phân tách bằng CC (gradient, n-hexan-axeton 6:1, 5:1 và 3:1) cho chất AP1.18.3 dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt.

Nhóm phân đoạn AP1.20 được phân tách bằng CC (gradient, n-hexan-axeton 7:1, 5:1 và 3:1) cho chất AP1.20.3.2 dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng ánh.

Nhóm phân đoạn AP1.22 được rửa bằng axeton cho chất AP1.22 dưới dạng bột vô định hình màu trắng.

Tổng cộng, 5 chất AP1.11 (= AP1.12), AP1.15, AP1.18.3, AP1.20.3.2 AP1.22 đã được phân lập từ phần chiết n-hexan (AP1).

Quá trình phân tách sắc ký phần chiết n-hexan (AP1) được trình bày trên Sơ đồ 2.


AP1

(10 g)

CC gradient, silica gel



n-hexan-axeton (19:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1)

19:1 9:1 6:1 3:1 1:1


AP1.9

(0,64 g)



AP1.13

(0,39 g)


AP1.16

(0,93 g)



AP1.21

(0,33 g)




AP1.1

(1,10 g)
AP1.2

(0,51 g)
AP1.3

(0,62 g)
AP1.4

(6,4 mg)
AP1.5

(0,68 g)
AP1.6

(22 mg)
AP1.7

(0,38 g)
AP1.8

(1,38 g)


AP1.14

(78 mg)


AP1.10

(0,38 g)



AP1.17

(0,94 g)


AP1.22

(0,19 g)


b


AP1.11

(0,15 g)


AP1.15

(44 mg)



AP1.18

(1,14 g)


AP1.23

(0,16 g)

b a


AP1.12

(0,67 g)



AP1.19

(0,33 g)



AP1.24

(0,13 g)

b


AP1.15

(25 mg)

AP1.20

(1,13 g)


AP1.11

(101 mg)


AP1.22

(23 mg)



AP1.18.3

(321 mg)


b


AP1.12

(203 mg)


2 x a


AP1.20.3.2

(356 mg)


a: CC gradient, silica gel

b: Rửa bằng n-hexan

Sơ đồ 2: Quá trình phân tách sắc ký phần chiết n-hexan (AP1)



4.4 Nghiên cứu thành phần hóa học của phần chiết điclometan (AP2)

4.4.1 Phân tích phần chiết điclometan (AP2)

Phân tích TLC sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel DC Alufolien 60 F254 (Merck), hệ dung môi n-hexan-axeton. Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.

Kết quả phân tích TLC với các hệ dung môi phân giải tốt được trình bày ở Bảng 4.

Bảng 4: Phân tích TLC phần chiết điclometan (AP2)

Hệ dung môi

n-hexan-axeton

STT

Rf

Dạng vệt

Hiện màu

19:1

1

0,05

tròn nhỏ

vàng đậm

9:1

1

0,31

tròn

xanh

2

0,06

tròn

tím

6:1

1

0,12

tròn

tím đậm

2

0,07

tròn

tím

3:1

1

0,95

dẹp

vàng đậm

2

0,45

tròn

vàng cam

3

0,40

tròn

xanh nhạt

1:1

1

0,92

tròn

xanh đậm

2

0,80

tròn

tím



4.4.2 Phân tách phần chiết điclometan (AP2)

Phần chiết điclometan (AP2) được phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 µm) với hệ dung môi n-hexan-axeton 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1.

Phân tách hệ thống đã phân bố các nhóm hợp chất trong AP2 theo độ phân cực, từ AP2.1 đến AP2.4 (n-hexan-axeton 9:1, hiệu suất phân lập 3,8 %), từ AP2.5 đến AP2.10 (n-hexan-axeton 6:1, hiệu suất phân lập 12,1 %), từ AP2.11 đến AP2.14 (n-hexan-axeton 3:1, hiệu suất phân lập 54,6 %) và từ AP2.15 đến AP2.2 (n-hexan-axeton 1:1, hiệu suất phân lập 9,5 %).

Nhóm phân đoạn AP2.11 được phân tách bằng sắc ký cột CC (n-hexan-axeton 6:1) cho chất AP2.11.3 dưới dạng gel màu vàng. Tinh chế tiếp AP2.11.3 bằng sắc ký cột Mini-C cho chất AP2.11.3.3 dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt.

Nhóm phân đoạn AP2.16 được kết tinh trong hệ dung môi n-hexan-axeton cho chất AP2.16 dưới dạng bột vô định hình màu vàng.

Các nhóm phân đoạn AP2.17AP2.18 được rửa bằng CH2Cl2 cho các chất AP2.17 AP2.18 dưới dạng bột vô định hình màu trắng.

Tổng cộng, 3 chất AP2.11.3.3, AP2.16 AP2.17 (= AP2.18) đã được phân lập từ phần chiết điclometan (AP2).

Quá trình phân tách phần chiết điclometan (AP2) được trình bày trên Sơ đồ 3.


AP2

(4,1 g)


CC gradient, silica gel

n-hexan-axeton(9:1, 6:1, 3:1, 1:1)

9:1 6:1 3:1 1:1


AP2.1 (1-3)

(7 mg)



AP2.5 (11-13)

(46 mg)



AP2.16 (21-24)

(2,93 g)



AP2.20 (34-35)

(15 mg)

c


AP2.2 (4-7)

(7 mg)


AP2.6 (14)

(62 mg)



AP2.13 (25-27)

(22 mg)



AP2.17 (36)

(23 mg)

b


AP2.3 (8-9)

(23 mg)


AP2.7 (15)

(10 mg)



AP2.14 (28-30)

(42 mg)



AP2.18 (37)

(54 mg)



AP2.4 (10)

(11 mg)



AP2.11 (16-18)

(0,2 g)



AP2.15 (31-33)

(15 mg)



AP2.19 (38-39)

(9 mg)



2 x a

AP2.9 (19)

(64 mg)



AP2.21 (40-43)

(32 mg)



AP2.10 (20)

(21 mg)



AP2.16

(135 mg)


AP2.11.3.3

(83 mg)



AP2.17 = AP1.18

(18,7 mg)





a: CC gradient, silica gel

b: Rửa bằng n-hexan (CH2Cl2)

c : Kết tinh (n-hexan-axeton)

Sơ đồ 3: Quá trình phân tách phần chiết điclometan (AP2)



4.5 Nghiên cứu thành phần hóa học phần chiết etyl axetat (AP3)

4.5.1 Phân tích TLC phần chiết etyl axetat (AP3)

Phân tích TLC sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel DC Alufolien 60 F254 (Merck) với hệ 3 dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic và etyl axetat-metanol-nước. Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.



Kết quả phân tích TLC được trình bày ở Bảng 5.

Bảng 5: Phân tích TLC phần chiết etyl axetat (AP3)

Hệ dung môi

n-hexan-EtOAc-HCOOH

STT

Rf

Dạng vệt

Hiện màu

20:19:1

1

0,50

tròn

vàng

2

0,46

dẹp

xanh lam

3

0,32

tròn

vàng

20:19:0,5

1

0,70

tròn

vàng

2

0,65

tròn

xanh nhạt

3

0,42

tròn nhỏ

vàng

4

0,12

tròn nhỏ

tím nhạt

20:15:1

1

0.45

tròn

vàng

2

0,40

tròn

xanh nhạt

3

0,28

tròn nhỏ

vàng

4

0,20

tròn

vàng nhạt

5

0,09

tròn

tím nhạt

30:2:3

1

0,68

tròn to

vàng

2

0,55

tròn nhỏ

tím

30:2:1

1

0,75

vệt tròn

vàng



4.5.2 Phân tách phần chiết etyl axetat (AP3)

Phần chiết etyl axetat (AP3) được phân tách sắc ký cột gradient CC trên chất hấp phụ silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 µm) với hệ dung môi n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:0,5 và 20:15:1.

Phân tách hệ thống đã phân bố các nhóm hợp chất trong AP3 theo độ phân cực, từ AP3.1 đến AP3.7 (n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:0,5, hiệu suất phân lập 15,8 %) và từ AP3.8 đến AP3.13 (n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:15:1, hiệu suất phân lập 25,8 %).

Nhóm phân đoạn AP3.4 được rửa bằng etyl axetat cho chất AP3.4 dưới dạng bột vô định hình màu vàng.

Nhóm phân đoạn AP3.13 được rửa bằng n-hexan và axeton cho chất AP3.13 dưới dạng bột vô định hình màu trắng và tan được trong MeOH.

Tổng cộng, 2 chất AP3.4AP3.13 đã được phân lập từ phần chiết etyl axetat (AP3).

Quá trình phân tách được trình bày trên Sơ đồ 4.


AP3

(3,8 g)

CC gradient, silica gel



n-hexan-EtOAc-HCOOH (20:19:0,5, 20:15:1)

20:15:1 20:19:0,5


AP3.1 (1-2)

(25 mg)



AP3.8 (15-18)

(81 mg)



AP3.2 (3)

(41 mg)


AP3.9 (19-22)

(54 mg)



AP3.3 (4-5)

(0,17 mg)



AP3.10 (23-26)

(30 mg)


AP3.4 (6-7)

(96 mg)



AP3.4

(87 mg)


AP3.11 (27-29)

(55 mg)


a


AP3.5 (8-9)

(89 mg)



AP3.12 (30-32)

(86 mg)



AP3.6 (10-11)

(97 mg)



AP3.13 (33-50)

(0,67 g)



AP3.13

(63 mg)


b


AP3.7 (12-14)

(86 mg)


a: Rửa bằng etyl axetat

b: Rửa bằng n-hexan và axeton


Sơ đồ 4: Quá trình phân tách phần chiết etyl axetat (AP3)

4.6 Xác định cấu trúc của các hợp chất được phân lập

Từ phần chiết n-hexan (AP1) các hợp chất β-sitosterol (AP1.11 AP1.12), 6β-hiđroxistigmast-4-en-3-on (AP1.15) trans-3S,5S-đihiđroxi-1,7-điphenyl-1-hepten (AP1.18.3), cardamomin (AP1.20.3.2) và alpinentin (AP1.22) đã được xác định cấu trúc.

Từ phần chiết điclometan (AP2) các hợp chất trans-3S,5S-đihiđroxi-1,7-điphenyl-1-hepten (AP2.11.3.3), cardamomin (AP2.16) và β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranozit (AP2.17 AP2.18) đã được xác định cấu trúc.

Từ phần chiết etyl axetat (AP3) các hợp chất cardamomin (AP3.4) và alpinentin (AP3.13.3) đã được xác định cấu trúc.

β-Sitosterol (AP1.11)

Hợp chất AP1.11 đã được phân lập từ phần chiết n-hexan (AP1) (hiệu suất phân lập 10,1 mg/g phần chiết AP1) dưới dạng bột vô định hình màu trắng bằng sắc ký cột CC trên silica gel và kết tinh lại trong n-hexan. Hợp chất này cho giá trị Rf = 0,24 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 9:1, v/v).





AP1.11

Hợp chất này đã được nhận dạng là β-sitosterol trên cơ sở phân tích TLC, co-TLC và IR với mẫu chuẩn của chúng tôi.

Phổ hồng ngoại của AP1.11 cho các đỉnh hấp thụ của nhóm hiđroxi ở υmax 3427 cm-1, nối đôi C=C ở υmax 1637 cm-1, nhóm metylen ở υmax 1461 cm-1và nhóm C-O ở υmax 1379 cm-1­.

β-Sitosterol là một phytosterol xuất hiện phổ biến trong thực vật và được sử dụng làm chất giảm lượng cholesterol trong máu.

6β-Hiđroxistigmast-4-en-3-on (AP1.15)

Hợp chất AP1.15 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim, màu trắng, đ.n.c. 200-202oC từ phần chiết n-hexan AP1 (hiệu suất phân lập 2,5 mg/g phần chiết AP1). Hợp chất này cho giá trị Rf = 0,21 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v).







1   2   3   4   5   6   7   8   9   10


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương