Fucoidan chiết xuất từ Sargassum sp và fucus vesiculosus làm giảm khả năng tồn tại của các tế bào ung thư phổi và các tế bào ung thư hắc tố da ác tính trong ống nghiệm và kích hoạt các tế bào miễn dịch diệt tự nhiên (NK)

Nghiên cứu này cung cấp sự thể hiện rõ rằng fucoidan thô tác động hiệu ứng hoạt tính sinh học vào mô hình tế bào ung thư phổi và da trong ống nghiệm và gây ra sự tăng cường kích hoạt các tế bào miễn dịch diệt tự nhiên (NK) trên cơ thể chuột thí nghiệm.

Các mục tiêu chủ yếu của công việc hiện tại do đó để xác định xem liệu fucoidan thô có thể ức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư da và phổi, và nếu như vậy, để mô tả các nhân tố góp phần đằng sau tác dụng này. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định rằng fucoidan thô gây cản trở tăng trưởng trong ống nghiệm của ung thư phổi Lewis và các tế bào khối u hắc tố da ác tính B16 bằng gây quá trình tự chết của các tế bào ung thư này (apoptosis). Hơn nữa, các hoạt động chống khối u của fucoidan thô dường như được liên kết với một phản ứng miễn dịch, nâng cao, như mô tả bởi sự gia tăng trong hoạt động của tế bào miễn dịch diệt tự nhiên (NK) ở chuột.

Bảng 1. Thành phần Monosaccharide phát hiện bởi HPAEC-PAD từ các mẫu thủy phân TFA Sargassum sp. fucoidan (MTA), và fucoidan thương mại (SIG) từ F. vesiculosus.

Mẫu	Thành phần Monosaccharide trong mg/g DW
	Fuc*	Rha	Ara	Gal*	Glc	Xyl*	Man*	GluA*	Sul
MTA	31.4 ± 2.0	1.6 ± 0.1	0.2 ± 0.1	13.9 ±0.8	4.2 ± 0.1	4.2 ± 0.3	5.7 ± 0.5	122.8 ± 7.0	384.4 ± 26.2
SIG	138.7 ± 5.5	2.0 ± 0.6	2.8 ± 0.2	27.9 ± 1.4	2.5 ± 1.8	12.8 ± 1.6	0.2 ± 0.4	18.5 ± 1.9	341.6 ± 45.4

Monosaccharide thành phần: Fuc, fucose; RHA, rhamnose, Ara, arabinose, Gal, galactose, GLC, glucose; Xyl, xylose, Man, mannose; GluA, axit glucuronic; Sul, Sulfate.

* Đáng chú ý là khác nhau tại P ≤ 0,05, số lần lặp lại = 4.
Đầy đủ kích thước bảng


3.2. Fucoidan thô ức chế tế bào ung thư da và phổi phát triển trong ống nghiệm
Các tế bào trong ống nghiệm được đánh giá ảnh hưởng của nồng độ khác nhau (0-1,0 mg / ml) fucoidan thô MTA và SIG trên sự tăng trưởng của tế bào Ung thư biểu mô phổi Lewis (LLC) và u hắc tố da B16 (MC) được thực hiện thông qua đo lường khả năng phát triển tế bào bằng cách sử dụng một khảo nghiệm MTT. Sự tăng trưởng của các tế bào LLC và MC đã bị ảnh hưởng một cách phụ thuộc vào liều lượng bổ sung fucoidan thô MTA và SIG, dựa trên 3 × 104 tế bào trên mật độ tốt sau 24 giờ ủ bệnh (Hình 1a và b). Fucoidan MTA và SIG thực hiện tương tự và làm giảm số tế bào LLC phát triển trong một dạng phụ thuộc vào liều, với tế bào có khả năng phát triển giảm đến 40 ± 7% và 36 ± 14% sau khi bổ sung 1,0 mg / ml MTA và SIG, tương ứng (hình 1a). Giảm mạnh mẽ ở số lượng tế bào cũng được ghi nhận cho các tế bào MC, kết quả giảm chỉ còn 56 ± 5% và 50 ± 5% các tế bào có khả năng phát triển khi thêm 0,1 và 0,2 mg / ml fucoidan MTA , tương ứng. Như vậy, giảm sức sống của tế bào gây ra bởi fucoidan MTA là rõ nét hơn đáng kể (P ≤ 0,05) so với giảm tế bào gây ra bởi fucoidan SIG, đặc biệt là ở cấp độ tăng thêm fucoidan thấp (Hình 1b). Ở mức liều 0,4-1,0 mg / ml, khả năng tồn tại tế bào của các tế bào MC đã được giảm xuống còn ~ 10-55% (mức thấp nhất tế bào có thể tồn tại phát triển ở liều lượng fucoidan cao hơn), nhưng không có sự khác biệt đáng kể đã được quan sát trong những tác động của MTA và SIG (Hình 1b). Nó cũng có thể được quan sát từ hình. 1 rằng fucoidan thể hiện hiệu quả hơn trong việc giảm số lượng tế bào sống của MC hơn so với các tế bào LLC một cách phụ thuộc vào liều, với ví dụ như, chỉ có 32 ± 2% tế bào MC có khả năng phát triển (Hình 1b) và 57 ± 7% tế bào LCC có khả năng phát triển (hình 1a). ở nồng độ fucoidan SIG là 0,6 mg / ml.

Hình 1. Trong ống nghiệm, phân tích các hoạt động trực tiếp vào các tế bào ung thư phổi và u hắc tố da ác tính của fucoidan thô có nguồn gốc từ Sargassum sp. (MTA) và fucoidan thương mại (SIG) có nguồn gốc từ F. vesiculosus. (A) Fucoidan hoạt động trên tế bào Ung thư biểu mô phổi Lewis, và (b) hoạt động fucoidan trên các tế bào u hắc tố da B16. Trên đây mật độ tế bào là 3 × 104 tế bào. Dữ liệu được hiển thị như là giá trị trung bình ± s.d. Mức ý nghĩa P ≤ 0,05, n = 4.

Xem hình ảnh thu nhỏ

Xem hình ảnh thu nhỏ

Xem hình ảnh thu nhỏ

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các fucoidan thô chiết xuất từ Sargassum sp. trên sàng thông qua một bước duy nhất chiết xuất sử dụng 0,03 M HCl ở 90 ° C cho 4 h, và fucoidan thô thương mại thu được từ F. vesiculosus. Chúng tôi ghi nhận rằng thành phần hóa học của các loài rong biển đặc sắc khác nhau. Đặc biệt, các nội dung +fucose, galactose và acid glucuronic là khác nhau khá nhiều, trong khi không có sự khác biệt lưu ý trong nội dung sulfate (Bảng 1). Mức độ liều lượng thấp của fucoidan MTA gây ra giảm đáng kể sự gia tăng của tế bào khối u hắc tố da ác tính B16 hơn fucoidan SIG, nhưng nói chung các xét nghiệm tế bào phổ biến cho thấy hiệu ứng họat tính sinh học gần như tương tự của fucoidan MTA và SIG với tế bào ung thư phổi Lewis và tế bào u hắc tố da B16 (Hình 1). Những dữ liệu này chỉ ra rằng họat tính sinh học fucoidan thô đối với các dòng tế bào có thể liên quan đến các nhóm sulfate hiện diện trong cấu trúc fucoidan hơn là sự hiện diện của một lượng đáng kể fucose. Các quan sát tương tự đã được báo cáo của Yamamoto et al. [17] đối với ảnh hưởng của hàm lượng fucose của fucoidan trên sự ức chế tăng trưởng của các tế bào Bướu thịt-180; Yamamoto et al. [17] từ đó đã phát hiện ra rằng sulfat hơn là hàm lượng fucose của fucoidan thô gây ra những hoạt động chống khối u.

Hàm lượng sulfate của fucoidan MTA và SIG là 38,4% và 34,2%, tương ứng (Bảng 1). Những kết quả này đồng nhất với các tác giả Koyanagi et al. [18] đã báo cáo rằng tinh khiết fucoidan từ F. vesiculosus có chứa sulfat 32,6% là hoạt chất chống angiogenic (tạo mạch khối U) mạnh và rằng oversulfation fucoidan có thể đã tăng cường các hoạt động chống hình thành mạch và chống khối u của fucoidan. Ngoài ra, các hoạt động chống đông máu của polysaccharides sulfate đã được báo cáo có liên quan đến mức độ sulfat [19]. Ngược lại, Cumashi et al. [20] nghiên cứu chín fucoidans khác nhau, cả đã tinh chế và thấy rằng không phải nội dung của fucose, sulfate, cũng không phải đặc điểm cấu trúc khác của mạch polysaccharide gây ảnh hưởng đáng kể hiệu quả của hoạt động sinh học của fucoidan. Những kết luận mâu thuẫn về các hoạt động sinh học của fucoidan đã mở đường cho thăm dò tiếp theo của chủ đề này. Trong khi nghiên cứu hiện nay là quá sớm để làm sáng tỏ mối quan hệ giữa các thành phần của fucoidan thô và các hoạt động sinh học của nó, nó đã chỉ ra rằng fucoidan thô tác động đáng kể tác dụng chống tăng sinh trên cả hai loại các tế bào ung thư phổi và da.

Trong quá khứ, hầu hết các nghiên cứu chống ung thư của fucoidan đã sử dụng loại tinh khiết, và cho thấy tác dụng ức chế liên quan đến di căn [20], sự hình thành mạch [18] và ức chế sự tăng trưởng trong một loạt các tế bào ung thư [21] và [22]. Tuy nhiên, khả năng của fucoidan thô để ức chế tế bào ung thư cũng đã được ghi nhận trước đây dựa trên các nghiên cứu khác nhau trong in vivo và nghiên cứu in vitro, bao gồm cả sự ức chế tăng trưởng của tế bào bướu thịt sarcoma -180 cấy ghép dưới da chuột thực nghiệm [17] và gây ra apoptosis HCT-15 tế bào ung thư đại tràng [23] . Tuy nhiên, kiến ​​thức của chúng ta về các tác động của fucoidan thô trên phổi và ung thư da là hạn chế, do đó, nghiên cứu chi tiết phải được thực hiện để làm sáng tỏ các cơ chế cơ bản đằng sau các hiệu ứng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằng fucoidan thô ức chế hiệu quả tế bào ung thư phổi Lewis và u hắc tố da B16 ở nồng độ từ 0,1 đến 1,0 mg / ml (Hình 1). Chúng tôi cũng kiểm tra xem sự ức chế khối u quan sát từ fucoidan thô là do hoạt động chống khối u hoặc khả năng gây độc trực tiếp. Nhìn chung, trong hoạt động gây độc tế bào in vitro của fucoidan chống lại tế bào ung thư phổi Lewis và u hắc tố da B16 tăng trong một kiểu phụ thuộc vào liều lượng (Hình 1). Như vậy, nó có thể kết luận rằng fucoidan thô thể hiện một tác dụng yếu, trực tiếp gây độc tế bào chống lại các tế bào gây ung thư này. Hơn nữa, sự vắng mặt của việc giảm cân và bạc nhược ở những con chuột được tiêm màng bụng với fucoidan MTA và SIG (dữ liệu không hiển thị) cho thấy sự ức chế sự tăng trưởng tế bào của LLC và MC là do, ít nhất là một phần, hoạt động chống khối u của nó.

Fucoidan thô và một số chất chiết xuất từ ​​rong biển có hoạt động miễn dịch, chẳng hạn như tăng cường hoạt động của tế bào NK các hoạt động chống khối u [9] và [24]. Các tế bào NK xuất hiện để đại diện cho một dòng đầu tiên của hệ thống phòng thủ chống lại sự lây lan của các tế bào máu gây ra di căn khối u. Hoạt động của các tế bào NK bình thường cũng là nhân tố quan trọng trong việc giám sát miễn dịch chống lại khối u [25]. Chúng tôi nghiên cứu hoạt động của tế bào NK trong sự hiện diện và vắng mặt của fucoidan thô MTA và SIG trong chuột đực C57BL/6J. Các kích hoạt xác định được của các tế bào NK chống lại các tế bào mục tiêu YAC-1 (dòng tế bào ung thư hạch lympho T chuột nhạy cảm với các tế bào NK) đã được cải thiện đáng kể trong các con chuột sau 4 ngày của tiêm màng bụng với fucoidan thô (Hình 3). Fucoidan thô do đó tác dụng chống khối u hoạt động thông qua sự tăng cường của các phản ứng miễn dịch. Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng fucoidan từ Undaria pinnatifida tăng cường đáp ứng miễn dịch và các hoạt động như là một immunopotentiator trong các con chuột mang khối u, dẫn đến hiệu quả chống khối u [16]. Các tế bào miễn dịch NK tham gia sản xuất một số các cytokine, chẳng hạn như interferon-γ (IFN-γ), sản phẩm trực tiếp bởi các tế bào miễn dịch T được kích thích bởi interleukin-12 (IL-12) [26]. Nó đã được báo cáo rằng sự kích thích IL-12 một mình sản xuất chỉ tăng thêm trung bình của khả năng gây độc tế bào NK. Tuy nhiên, IL-12 khi cùng tổng hợp sức mạnh với interleukin-2 (IL-2) sẽ làm tăng hoạt tính xúc tác của tế bào lympho chống lại mục tiêu tự thân [27]. Do đó, kích thích với IL-2 và IL-12 thúc đẩy sự tăng tiết của IFN-γ, cơ chế đằng sau fucoidan tăng cường kích hoạt tế bào NK có thể là tương tự (Hình 3).

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng fucoidan gây ra apoptosis trong tế bào ung thư đại tràng của con người HT-29 [7], các tế bào ung thư vú MCF-7 [28], và tế bào ung thư hạch của con người HS-Sultan [6]. Trong nghiên cứu này, fucoidan thô tác dụng hoạt động thông qua ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư phổi Lewis và tế bào u hắc tố B16. Như vậy, chúng tôi đã nghiên cứu liệu fucoidan thô có tác dụng hoạt động gây apoptosis. Việc nhuộm tế bào với các chất nền DAB cho thấy thay đổi hình thái học của các tế bào khối u ác tính B16, như được chỉ ra bởi một màu sắc cường độ cao màu nâu sẫm bên trong nhân tế bào (Hình 2). Một sự thay đổi hình thái riêng biệt của các tế bào tự hủy diệt, bao gồm sửa đổi, bổ sung các the Cytoskeleton mà kết quả trong vỡ màng tế bào, co nhiễm sắc thể và sự gãy đứt của ADN [26]. Trong nghiên cứu hiện tại, fucoidan thô đã được hiển thị để tạo ra apoptosis, báo cáo trước đó đã gợi ý rằng fucoidan gây ra apoptosis qua sự kích hoạt của caspase-3 trong nhân tế bào HS-Sultan [6], thông qua con đường phụ thuộc caspase-8 trong tế bào MCF-7 [28] và thông qua kích hoạt các caspases qua cả cái chết qua trung gian thụ thể và con đường tự hủy hoại ty thể qua trung gian [7]. Các cơ chế chi tiết của lộ trình kích hoạt rõ ràng xứng đáng điều tra thêm.

Lời cảm ơn

Tài liệu tham khảo

[1] T.V. Alekseyenko, S.Y. Zhanayeva, A.A. Venediktova, T.N. Zvyagintseva, T.A. Kuznetsova, N.N. Besednova, T.A. Korolenko
Bull. Exp. Biol. Med, 143 (2007), trang 730-732

[2] H. Maruyama, Tamauchi H., M. Iizuka, T. Nakano

[3] I.D. Makarenkova, P.G. Deriabin, D.K. L'Đài Tiếng nói Việt Nam, T.N. Zviagintseva, N.N. Besednova

4] Z. Zhu, Zhang Q., L. Chen, S. Ren, P. Xu, Y. Tang, D. Luo

[5] M.A. Rahman, A.R. Amin, D.M. Shin

[6] Y. Asia, Y. Miyakawa, T. Nakazato, H. Shibata, K. Saito, Y. Ikeda, M. Kizaki

[7] E.J. Kim, S.Y. Park, J.Y. Lee, J.H. Park

[8] A.D Holtkamp, ​​S. Kelly R. Ulber, S. Lang

[9] M. Takahashi

[10] W.A.P. Black, E.T. Dewar, F.N. Woodward

[11] A. Arnous, A. Meyer

[14] H. Iso, Y. Kubota

[15] J. Teas, M.L. Harbison, R.S. Gelman

[16] H. Maruyama, Tamauchi H., M. Hashimoto, T. Nakano

[17] I. Yamamoto, Takahashi M., T. Suzuki, H. Seino, H. Mori

[18] S. Koyanagi, N. Tanigawa, H. Nakagawa, S. Soeda, H. Shimeno

[19] L. Chevolot, A. Foucault, F. Chaubet, Kervarec N., C. Sinquin, Fisher, C. Boisson-Vidal

[20] A. Cumashi, NA Ushakova, ME Preobrazhenskaya, A. D'Incecco, A. Piccoli, L. Totani, N. Tinari, GE Morozevich, A.E. Berman, M.I. Bilan, A.I. Usov, N.E. Ustyuzhanina, A.A. Grachev, C.J. Sanderson, M. Kelly, G.A. Rabinovich, S. Iacobelli, N.E. Nifantiev

[21] N.Y Lee, S.P. Ermakova, T.N. Zvyagintseva, K.W. Kang, Z. Dong, H.S. Choi

[22] T. Teruya, T. Konishi, S. Uechi, H. Tamaki, M. Tako

[23] J.H. Hyun, Kim S.C., J.I. Kang, M.K. Kim, H.J. Boo, J.M. Kwon, Y.S. Koh, J.W. Hyun, D.B. Park, E.S. Yoo, H.K. Kang

[24] B.E. Shan, Y. Yoshida, E. Kuroda, U. Yamashita

[25] T.L. Whiteside, R.B. Herberman

Clin. Immunol. Immunopathol., 53 (1989), trang. 1–23
[26] T.J. Kindt, R.A. Goldsby, B.A. Osborne

W.H. Freeman and Company (Ed.), Cell-Mediated Cytotoxic Responses, Kuby Immunology, New York (2007), trang. 360–363

J. Immunol., 151 (1994), trang. 1697–1706

J. Agric. Food Chem., 57 (2009), trang. 8677–8682