Enzyme Glucoamylase gvhd: pgs. Ts lê Văn Việt Mẫn



tải về 2.96 Mb.
trang2/6
Chuyển đổi dữ liệu06.06.2018
Kích2.96 Mb.
1   2   3   4   5   6

Khuẩn ty phân nhánh có vách ngăn, bào tử đính không nằm tron bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọc lớn hình cầu 5 – 6 x 20 – 30µm, đôi khi 6 – 10 x 60 – 70µm màu nâu đen



Hình 1.4: Nấm mốc Aspergillus Niger

    1. Đặc điểm sinh hoc của Aspergillus niger

Aspergillus niger sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6 – 80C và tối đa là 45 – 470C, tối ưu ở 28 – 350C, trong môi trường có độ ẩm tối thiểu là 23%. Độ ẩm môi trường thích hợp để lên men bán rắn của Aspergillus niger là 60 – 65%, nó chỉ sinh trưởng và phát triển khi có mặt O2 ở pH tối ưu là 4 – 6.5, cũng có những chủng Aspergillus niger sinh trưởng được ở pH 2. Sự thay đổi pH của môi trường nuôi cấy từ 3 đến 6.5 làm thay đổi đáng kể hình thái của Aspergillus niger.

    1. Sinh trưởng của nấm mốc A.Niger

Asp.niger có nhiều kiểu sinh sản khác nhau: Sinh sản sinh dưỡng, sinh sản vô tính bằng bào tử hoặc sinh sản hữu tính.

      1. Điều kiện sinh trưởng



  • Nhiệt độ

Nấm mốc có nhiệt độ phát triển tốt ưu là 28 – 320C, trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi sinh vật đồng hóa chất dinh dưỡng và thải ra một lượng nhiệt khá lớn. Do đó trong quá trình nuôi cấy cần phải có những trang thiết bị phù hợp để duy trì và ổn định nhiệt độ canh trường.


UI (Hoạt độ enzyme)

t0


Hình 1.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme glucoamylase

  • Độ ẩm

Độ ẩm tối ưu trong quá trình nuôi cấy nấm mốc là 65 – 70%. Tuỳ theo điều kiện khí hậu và điều kiện vô trùng của mỗi phòng thí nghiệm của mỗi quốc gia mà lựa chọn độ ẩm cho thích hợp, độ ẩm thường khống chế ở 50 – 60%, thường sử dụng 58 – 60%. Độ ẩm mà tăng quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50 – 55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như sự tạo Enzyme Glucoamylase. Trong điều kiện tiệt trùng tốt (môi trường trong bình tam giác, trong tủ ấm phòng thí nghiệm hoạt lực Glucoamylase cao nhất thu ở độ ẩm 65 – 68%). Cần nhớ rằng khi nuôi trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối (trên các khay), thì độ ẩm môi trường không được vượt quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ dễ bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ được độ ẩm cao (việc phòng ngừa và hạn chế sự hư hỏng của canh trường) trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm sợi lại còn có ý nghĩa to lớn hơn đối với sự tạo thành Enzyme.

  • pH

Khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn theo phương pháp bề mặt thì pH ít ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm mốc, thường người ta sử dụng pH tự nhiên vào khoảng 5.5 – 6.


UI (Hoạt độ enzyme)

pH


Hình 1.6:Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme glucoamylase

  • Cung cấp Oxy

Trong quá trình phát triển và tích tụ enzyme nấm mốc rất cần oxy, khi nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp bề mặt nấm mốc dễ dàng tiếp xúc với không khí qua hệ thống sợi tơ và micell vì thế đòi hỏi môi trường phải xốp giúp cho nấm mốc tạo nhiều hệ sợi và tích luỹ nhiều enzyme. Nếu môi trường dính bết, không đủ độ xốp, không khí sẽ ít tiếp xúc vi sinh vật xảy ra hô hấp yếm khí ảnh hưởng đến việc tích luỹ enzyme. Độ hoà tan của oxy vào môi trường nuôi cấy phụ thuộc rất nhiều yếu tố: nhiệt độ, nồng độ chất và phương pháp thổi khí, nhiệt độ cao thì khả năng hoà tan oxy kém, nồng độ chất tỷ lệ nghịch với khả năng hoà tan của oxy, ngược lại cũng có một số yếu tố làm tăng khả năng hoà tan của oxy: ete, rượu, acid hữu cơ…

      1. Nguồn cơ chất

  • Nguồn C

Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit
Đối với các hệ vi sinh vật sinh enzyme amylaza: Tinh bột, dextrin, maltoza vừa là chất cảm ứng vừa là nguồn cacbon tốt nhất để sinh tổng hợp amylaza. Khi nuôi cấy theo phương pháp bề mặt nếu dùng cám thì không cần bổ sung tinh bột, ngoài cám có thể dùng bột ngô, bột mì, bo bo. Cần chú ý trong đa số trường hợp, một số loại đường điển hình, nhất là glucose lại kìm hãm sinh tổng hợp các enzyme thủy phân nói chung (chẳng hạn theo cơ chế trấn áp phân giải do làm giàu lượng AMPV trong tế bào)
Ngoài nguồn gluxit là chủ yếu còn phải kể đến các nguồn cacbon khác như:
‒ Các axit béo phân tử lượng lớn (Oleic, stearic, miniotic). Ví dụ: axit oleic có tác dụng kích thích tổng hợp glucoamylaza lên 2.5 – 3.5 lần so với nồng độ thích hợp 2 – 3%.
‒ Etanol và glyxerin trong nhiều trường hợp nuôi cấy được dùng làm cacbon bổ sung.

  • Nguồn Nitơ

Ở nhiều loại nấm mốc, nguồn nitơ tốt nhất là NaNO3 và NH4NO3, nhưng khi nồng độ nitơ dưới 0.05% nấm mốc vẫn phát triển được nhưng sinh tổng hợp amylaza rất kém. Các muối amoni vô cơ, một số nguồn nitơ hữu cơ (gelatin, cazein, cao ngô) cho hiệu quả sinh tổng hợp amylaza thấp.

Trong thực tế, người ta thường dùng nguồn nitơ là các axit amin có nguồn gốc từ dịch thủy phân protein (dịch tự phân nấm men, nước chấm, cao ngô, dịch chiết malt), đây vừa là nguồn nitơ vừa là nguồn cacbon và chất cảm ứng sinh enzyme. Các axit amin có tác dụng tốt nhất trong những trường hợp này là asparagin, axit glutamic; D,L serin, histamin, alanin. Trong khi casein thậm chí là ức chế thì dịch thủy phân casein lại cảm ứng sinh tổng hợp amylaza lên gấp 2 lần so với ban đầu.


Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH4, H2PO4 là tốt cho nuôi cấy vi sinh vật hơn cả. Các muối amon và nitrat khác đều làm giảm hoạt lực enzyme.
Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt nhất đến quá trình sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật nói chung. Nhiều acid amin lại có tác dụng ức chế sinh tổng hợp enzyme như valin, axit glutamic, izolơxin, treonin.

  • Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sinh trưởng

Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động của vi sinh vật, đặc biệt là đối với các quá trình sinh tổng hợp các enzyme kim loại. Để sinh tổng hợp glucoamylaza, nồng độ MnSO4 thích hợp nhất là 0.05%. Nếu thiếu muối này và muối photphat kali thì vi sinh vật không thể sinh tổng hợp được dextrinaza. Hoạt lực glucoamylaza được nâng cao ở nồng độ KCl 0,05%
Ion Mg2+ có tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao.

Lưu huỳnh S với nguồn chủ yếu là các axit amin chứa S như metionin, cystein, sistin, và các muối sunphat (CuSO4). Các muối khoáng có Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Trong đa số trường hợp biotin (vitamin H) và một số vitamin cũng rất cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp enzyme.



    1. Tiêu chí chọn giống

Giống nấm mốc sử dụng phải đạt những chuẩn mực nhất định mới được phép sử dụng.Các yếu tố cơ bản đối với giống nấm mốc sử dụng lên men thu nhận chế phẩm glucoamylase gồm:

  • Giống nấm mốc phải có khả năng sinh tổng hợp enzyme glucoamylase mạnh, sản phẩm này phải có chất lượng và số lượng cao hơn hẳn các sản phẩm từ các giống nấm mốc khác.



Hình 1.7: So sánh hoạt tính enzyme glucoamylase sinh ra từ các giống nấm mốc khác nhau

  • Giống phải có khả năng sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm tại địa phương nơi nhà máy hoạt động, các phụ phẩm của các nhà máy.

  • Chế phẩm enzyme cần thu nhận do giống đang áp dụng trong sản xuất phải dễ dàng tách ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối của nấm mốc giống.

  • Giống nấm mốc sử dụng phải là chủng thuần khiết, không nhiễm các sinh vật lạ.

  • Giống phải có tính thích nghi cao, đặc biệt phải thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp, trong đó có sự ổn định về nhiệt độ, pH, độ ẩm…

  • Giống phải có tốc độ sinh sản và phát triển rất mạnh trong điều kiện môi trường công nghiệp. Tính chất này rất quan trọng vì khi nhiễm các vi sinh vật lạ thì giống dung trong sản xuất phải có khả năng lấn át sự phát triển của vi sinh vật lạ.

  • Tốc độ trao đổi chất mạnh để nhanh tạo ra sản phẩm mong muốn, giúp ta tăng nhiều chu kỳ sản xuất.

  • Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản, ít bị thoái hóa



  1. Môi trường lên men

Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của môi trường nuôi vi sinh vật tạo Glucoamylase cũng giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi vi sinh vật tạo enzyme khác là tính hoàn thiện. Hầu hết các vi sinh vật tạo glucoamylase đều hấp thụ carbon chủ yếu ở các dạng hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin…), hyđro ở dạng H2O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử.

Cấu tử chính của môi trường vi sinh vật tạo Glucoamylase bằng phương pháp lên men bề mặt là cám mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi vi sinh vật không cần bổ sung thêm các chất khác nữa. Cám mì có 16 – 22% tinh bột, 10 – 12% protein, trong đó các amino acid quan trọng như methionine (0,19%), cystine (0,3%), arginine (1%), lysine (6%), tryptophan (0,3%), 3 – 4% chất béo, 10,3% celulose, các nguyên tố trơ (Na – 0.09% , K – 1% , Ca – 0.16% , P – 0.94%) và các nguyên tố vi lượng cùng các chất khác. Cám gạo có khoảng 20% tinh bột 10 –15% chất béo, 10 – 14% protein, 8 – 16% celulose, các chất hoà tan không chứa nitơ (37 – 59%).



Bảng 1.2: Thành phần hóa học của cám mì

Thành phần

% Khối lượng

Độ ẩm

13

Tinh bột

16 – 22

Protein thô

10 – 12

Béo thô

3 – 4

Xơ thô

10 – 11

Canxi

0.16

Phospho tổng

0.94

Natri

0.09

K

1

Bảng 1.3: Thành phần hóa học của cám gạo

Thành phần

% Khối lượng

Tinh bột

20

Chất béo

10 – 15

Protein

10 – 14

Cellulose

8 – 16

Cấu tử hòa tan không chứa Nito

37 – 59

Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của enzyme. Cám không được chứa tinh bột dưới 20 – 30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay vị đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%... Tuy là phế liệu của công nghiệp xay xát, nhưng cám cũng tương đối đắt tiền, hơn nữa trong quá trình nuôi vi sinh vật, các chất dinh dưỡng không được sử dụng hết, vì thế có thể thay cám bằng một số cấu tử rẻ tiền hơn. Cấu tử này thường là mầm mạch (15 – 20%), trấu (2 – 5%), mùn cưa (5 – 10%)… Có thể dùng cặn bã canh trường rắn (sau khi cách ly Enzyme) là cấu tử chính của môi trường (Silova, Fenikxov) 1967, đảm bảo chế độ tiệt trùng. Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử vi sinh vật khác nên cần phải tiệt trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa vi sinh vật ngoại lai. Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1 – 5atm trong vòng 4 – 6 giờ, có thể thanh trùng bằng hơi nóng ở nhiệt độ 1200C trong 90 phút. Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin (40%) và 0,8% HCl kỹ thuật theo khối lượng môi trường.

Tiêu chuẩn chọn nguyên liệu: Tiêu chuẩn chất lượng cám mì, cám gạo theo qui định của Bộ Nông nghiệp – phát triển nông thôn.



  • Độ ẩm: < 12%

  • Không mùi chua mốc

  • Độc tố Aflatoxin: không quá 50 ppb

Tỉ lệ cám mì/Cám gạo = 7/3

Bảng 1.4: Thành phần dinh dưỡng của hỗn hợp nguyên liệu cám gạo – cám mì

Thành phần dinh dưỡng

% Khối lượng

Độ ẩm

11

Protein thô

16.5

Xơ thô

9.75

NDF (Hàm lượng chất xơ trung tính)

42

ADF (Hàm lượng xơ acid dễ tiêu hóa)

16

Hàm lượng tro và khoáng

4.75

Bảng 1.5: Chỉ tiêu nước sạch trong công nghiệp

  • Chỉ tiêu vật lí

  • Mùi vị

  • Độ trong (ống Dienert)

  • Màu sắc (thang màu Coban)

  • Tiêu chuẩn

  • Không mùi

  • 100 ml

  • 50

  • Chỉ tiêu hoá học

  • pH

  • Độ cặn cố định (đốt ở 600C)

  • Độ cứng toàn phần (độ Đức)

  • Độ cứng vĩnh viễn

  • CaO

  • MgO

  • Fe2O3

  • MnO

  • BO4-3

  • SO4-2

  • NH4+

  • NO2-

  • NO3-

  • Pb

  • As

  • Fe

  • Zn



  • 6 ÷ 8,5

  • 75 ÷ 150 mg/lít

  • Dưới 150

  • 70

  • 50 ÷ 100 mg/lít

  • 50 mg/lít

  • 0.3 mg/lít

  • 0.2 mg/lít

  • 2.5 mg/lít

  • 0.5 mg/lít

  • 0.3 mg/lít

  • Không có

  • Không có

  • 0.1 mg/lít

  • 0.05 mg/lít

  • 0.3 ÷ 0.5 mg/lít

  • 5.00 mg/lít

  • Chỉ tiêu vi sinh vật

  • Tổng số vi sinh vật hiếu khí

  • Chỉ số Coli

  • Vi sinh vật gây bệnh



  • Dưới 100 cfu/ml

  • Dưới 20 cfu/ml

  • Không có

Các chất bổ sung môi trường lên men bán rắn:

  • K2HPO4, MgSO4, FeSO4.7H2O, NaNO3

  • Chất độn: Mùn cưa

Bảng 1. 6: Hàm lượng các chất bổ sung trong nguyên liệu

Chất bổ sung

% (Khối lượng)

K2HPO4

0.001

MgSO4

0.005

NaNO3

0.9

FeSO4.7H2O

0.1

Mùn cưa

10

Bảng 1.7: Chỉ tiêu cho phép của MgSO4

Độ tinh khiết

> 99.5 %

Asen

< 3 ppm

Selen

< 30ppm

Chì

< 10 ppm

Bảng 1.8: Chỉ tiêu cho phép của KH2PO4

Độ tinh khiết

> 98 %

Asen

< 3 ppm

Flo

< 10 ppm

Clo

< 0.03%

Sulfate

<0.1 %

Sắt

<0.003 %

Chì

< 5 ppm



Bảng 1.9: Chỉ tiêu cho phép của FeSO4.7H2O

Độ tinh khiết

> 99.5 %

Asen

< 3 ppm

Thủy ngân

< 3 ppm

Chì

< 10 ppm



  1. Phương pháp nuôi cấy

Ở đây, ta sử dụng phương pháp nuôi cấy bề mặt

Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường rắn hoặc lỏng (vì vậy còn gọi là phương pháp nổi). Các môi trường rắn trước khi nuôi cấy vi sinh vật cần được làm ẩm. Thường dùng cám, đôi khi dùng gạo tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đường, khoai tây, lõi ngô…hoặc hỗn hợp những nguyên liệu này.

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật mà trong đó vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường hay phát triển trên hạt, trên môi trường bán rắn.

Nguyên liệu dùng để nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp này thường là môi trường cám trấu, cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê. Để làm tăng độ xốp của môi trường từ các nguyên liệu trên, người ta thường bổ sung vào các thành phần làm xốp như trấu, lõi ngô được làm nhỏ. Tuy nhiên, các thành phần trên là các thành phần chứa rất ít chất dinh dưỡng vì vậy cần phải bổ sung vào môi trường một lượng phụ liệu trong khoảng 15 – 20%. Mặc khác, để tăng cường quá trình sinh tổng hợp enzyme thì cần phải bổ sung vào môi trường nuôi vi sinh vật những chất cảm ứng để cảm ứng tổng hợp enzyme.




  1. QGroup 73uy trình công nghệ


Trộn


Group 63
Tiệt trùng

Nhân giống



Cấy giống

Lên men


Nghiền


Group 47

Li tâm
Group 34


Siêu lọc UF




Group 29

Đóng gói
AutoShape 51



Group 54



  1. Trộn

Mục đích công nghệ: chuẩn bị cho quá trình lên men

Quá trình trộn làm cho nguyên liệu phân tán đều vào nhau, đảm bảo thành phần dinh dưỡng ở mọi vị trí là gần như nhau để thích hợp cho vi sinh vật sử dụng.



Các biến đổi của nguyên liệu: do đây là quá trình phối trộn vật liệu rời nên trong quá trình phối trộn thường không tạo ra biến đổi nào đáng kể.

  • Vật lí: nhiệt độ môi trường tăng

  • Hóa học: thành phần hóa học của môi trường thay đổi

  • Hóa lí: không có biến đổi đáng kể.

  • Hóa sinh: phản ứng do enzyme xúc tác

  • Sinh học: Hỗn hợp cám mì, cám gạo là môi trường giàu dinh dưỡng thích hợp cho vi khuẩn, nấm mốc phát triển nên trong quá trình phối trộn có thể bị nhiễm vi sinh vật

Thiết bị: thiết bị phối trộn dạng thùng quay





1   2   3   4   5   6


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương