DẦu thầu dầu bằng nấm men yarrowia lipolytica luận văn thạc sĩ khoa họC

Con người biết đến chất thơm và sử dụng chúng từ hàng nghìn năm nay. Nó làm tăng chất lượng của nhiều sản phẩm, đặc biệt là thực phẩm. Khi đời sống ngày càng phát triển, xã hội càng văn minh thì các chất thơm được sản xuất và sử dụng ngày càng đa dạng và phong phú về cả số lượng lẫn chất lượng.

Trong số các cấu tử tạo hương như este, andehyde, lactone, alcohol..... thì lactone là hợp chất khá phổ biến và là cấu tử hương thơm chính trong một số loại hoa quả, thảo mộc như đào, mận, dừa, dâu tây... Trong các lactone thì γ-decalactone (C₁₀H₁₈O₂) là có giá trị nhất, được nghiên cứu nhiều nhất. Chất này tồn tại trong tự nhiên ở mức độ vi lượng, song là thành phần chủ đạo tạo nên hương thơm cho nhiều loại quả. γ- decalacton có thể được tổng hợp bằng con đường sinh tổng hợp từ dầu thực vật nhờ quá trình chuyển hoá của vi sinh vật.

Trong các loại dầu thực vật, dầu thầu dầu (castor oil), là một loại nguyên liệu phù hợp cho quá trình tổng hợp γ-decalactone. Quá trình thuỷ phân dầu thầu dầu sẽ tạo ra axit ricinoleic, đây là “cơ chất” để một số nấm men chuyển hóa thành chất thơm, nhờ quá trình β-oxi hóa.

Một số nấm men chuyển hóa chất béo (oleaginous yeasts) như Yarrowia lipolytica, Rhodotorula sp., Candida sp., Lipomyces sp., Trichosporon sp.,…. có khả năng sử dụng, chuyển hóa axít béo và các hợp chất kị nước. Trong số đó nấm men Yarrowia lipolytica là loài được nghiên cứu nhiều nhất. Vấn đề nâng cao sự chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học cũng như các nhà sản xuất. Nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu ở nước ta sẵn có, rẻ tiền nhưng việc sử dụng nó cho việc nghiên cứu sinh tổng hợp chất thơm nhờ vi sinh vật chưa được quan tâm nghiên cứu nhiều. Vì những lẽ trên đây, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica”.

2. Lựa chọn điều kiện thích hợp cho quá trình lên men đó trong các nồi lên men dung tích 5L và 50L.

3. Tìm các điều kiện tách chiết và thu nhận chất thơm –decalactone từ dịch lên men.


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Nấm men Yarrowia lipolytica

Nấm men Yarrowia lipolytica thuộc về nhóm các loài nấm men có khả năng chuyển hóa chất béo, hay còn gọi là nấm men ưa béo (oleaginous yeasts). Trong đó còn có các loài khác như Rhodotorula sp., Candida sp., Lipomyces sp., Trichosporon sp. Chúng có khả năng chuyển hóa chất béo, dầu và các hợp chất hydrocacbon kị nước [11].

Nấm men này được phân lập lần đầu tiên từ bơ thực vật ở Hà Lan năm 1928, lúc đầu có tên gọi là Torula lipolytica, sau đó được đổi thành Candida lipolytica và đến nay là Yarrowia lipolytica. Nó thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, có khả tạo rất nhiều sản phẩm khác nhau, và đã được đánh giá là nhóm nấm men không có khả năng gây bệnh. Nhiều quy trình sản xuất cơ bản nhờ nấm men này được cấp phép ứng dụng bởi Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA). Hơn nữa, Yarrowia lipolytica cũng được sử dụng làm công cụ trong các nghiên cứu về sự bài tiết protein, sự hình thành của peroxisome, về tính lưỡng hình của nấm men, về sự phân hủy các hợp chất kỵ nước, cũng như trong nhiều các lĩnh vực khác [16][18].

Ngoài việc sử dụng các cơ chất thông thường như các đường hexose, pentose, thì Yarrowia lipolytica còn có thể sử dụng hiệu quả các cơ chất kỵ nước như ankan, hydrocacbon thơm, chất béo… Việc sử dụng các cơ chất đặc biệt này có liên quan đến cơ chế bám dính của cơ chất kỵ nước vào màng tế bào và cơ chế vận chuyển các chất qua màng tế bào bằng các chất mang. Khi đó, những giọt nhỏ cơ chất kỵ nước bám dính lên bề mặt tế bào (hình 1.1), tế bào tự thay đổi bề mặt như tạo bề mặt gồ gề lồi lõm, và giảm độ dày thành tế bào. Sau đó chúng được vận chuyển chủ động thông qua các kênh vận chuyển điện tử dày đặc trên màng tế bào [16].

Dưới đây (hình 1.1) là ảnh hiển vi của tế bào Yarrowia lipolytica trong môi trường methy ricinoleate, minh họa cho hiện tượng vừa trình bày.




Hình 1.1 Tế bào Yarrowia lipolytica sinh trưởng trong môi trường chứa methy ricinoleate [16].

Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào, nếu là chất béo, trước hết chúng sẽ chịu tác động của enzyme lipotic (lipase) để bị thủy phân thành glycerol và axít béo; tiếp đó các cơ chất kỵ nước này sẽ được hydroxy hóa nhờ hệ ezyme có tên là cytochrome P450 monoxidase khu trú trong lưới nội chất, rồi tiếp tục chịu tác động của hệ enzyme oxidase chuyển thành andehyde béo; tiếp đó là quá trình oxi hóa andehyde béo được xúc tác bởi aldehyde dehydrogenase [10].

Nấm men Yarrowia lipolytica sống hiếu khí bắt buộc, sự sinh trưởng và trao đổi chất của nó phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, đặc biệt là lượng oxy trong môi trường nuôi cấy. Trong quá trình nuôi cấy, nhu cầu oxy cho sự sinh trưởng và trao đổi chất của nấm men này phụ thuộc vào nồng độ ion sắt có trong môi trường [12]. Ngoài việc khuấy lắc, có nhiều phương pháp được áp dụng nhằm tăng hàm lượng oxy trong môi trường nuôi cấy như sục khí nén, đặc biệt là bổ sung chất mang perfluorocarbons (PFC) đã hòa tan oxy vào bình lên men trong giai đoạn sau của quá trình nuôi cấy khi mà lượng oxy ban đầu đã được sử dụng đáng kể. Theo các nghiên cứu, khi tăng nồng độ oxy trong môi trường lên men từ 10 đến 20% thì sản lượng chất đã chuyển hóa tăng rõ rệt (từ 10-80%); việc tăng nồng độ oxy lên trên 20% không làm tăng thêm lượng sản phẩm [12].

Chất thơm là những chất có khả năng bay hơi một phần hay toàn phần trong không khí, được cơ quan khứu giác cảm nhận mùi khi chúng lan truyền hay khuyếch tán trong không khí với độ bay hơi vừa đủ và ở một khoảng cách nhất định [2]. Các chất thơm có thể là một hợp chất hay hỗn hợp nhiều chất, có thể là chất rắn hay chất lỏng hoặc chất khí.

Đến nay, người ta đã xác định được khoảng 7.000 chất bay hơi trong thực phẩm và có khoảng hơn 8.000 chất bay hơi được tìm thấy trong mỹ phẩm và dược phẩm. Các hợp chất thơm này chủ yếu thuộc các nhóm chất aldehit, xeton, ancol, các axit hữu cơ, este, lactone…

Dựa vào nguồn gốc người ta chia chất thơm thành 3 loại: chất thơm tự nhiên; chất thơm tổng hợp hoàn toàn (không có trong tự nhiên); và chất thơm tổng hợp giống hợp chất tự nhiên [2].

Chất thơm tự nhiên được chiết tách từ nguyên liệu thiên nhiên có nguồn gốc thực vật (tinh dầu, nhựa dầu thơm) hoặc động vật (xạ hương). Trong khi đó chất thơm tổng hợp được tạo ra bằng con đường hoá học, có mùi giống các chất thơm của tự nhiên hoặc các chất thơm mới chưa có trong tự nhiên. Trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm, người ta chỉ được phép sử dụng các chất thơm có nguồn gốc tự nhiên và các chất thơm tổng hợp giống hợp chất tự nhiên. Các chất thơm tổng hợp hoàn toàn nếu được sử dụng phải được kiểm tra chặt chẽ về độ tinh khiết và liều lượng sử dụng trong sản phẩm cuối cùng.

Để sản xuất các chất thơm từ cơ chất tự nhiên người ta sử dụng enzyme hoặc vi sinh vật. Các chất thơm được tạo thành theo cách này được gọi là “hợp chất tự nhiên” bởi chúng được tạo ra từ các sản phẩm nông nghiệp thông qua hoạt tính sinh học tự nhiên (enzyme và vi sinh vật) và nhờ đó, tỷ lệ các đồng phân (isomers) và đồng vị (isotops) của các chất thơm này có thể so sánh được với sản phẩm chiết xuất từ tự nhiên, không như các chất được tổng hợp bằng quá trình hóa học.

Trong thực phẩm, lipit được khử hoặc biến đổi nhờ các enzyme có sẵn trong nguyên liệu thô hoặc enzyme được tạo ra do quá trình sinh trưởng trong môi trường thực phẩm của vi sinh vật .

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về chất thơm trong thực phẩm nhưng chỉ có một số ít chất thơm được nghiên cứu để sản xuất bằng con đường sinh học. Trong số đó được quan tâm nhiều nhất là các chất thơm họ lactone như -decalactone và các chất thơm từ carotenoit.

Các chất thơm có sức hấp dẫn đặc biệt bởi nó liên quan đến hương vị và tạo nên giá trị cảm quan cho thực phẩm. Trong đa số trường hợp, chất thơm đem lại cho người sử dụng thực phẩm cảm giác ngon miệng. Chất thơm trong thực phẩm có thể có sẵn từ nguyên liệu ban đầu, hay có thể được hình thành trong quá trình chế biến, hoặc được thêm vào thực phẩm như chất phụ gia với mục đích tăng giá trị cảm quan trong thực phẩm. Hiện nay ngành công nghiệp chế biến thực phẩm có nhu cầu rất lớn về các chất phụ gia tạo hương. Trong quá trình chế biến thực phẩm và đồ uống, các chất thơm có trong nguyên liệu ban đầu thường xuyên bị mất đi, khiến các nhà công nghệ phải nghĩ tới phương án thêm chất phụ gia. Mặt khác các sản phẩm như nước ngọt, rượu mùi, sữa chua,… luôn cần sự có mặt của các chất thơm. Ngoài công nghiệp chế biến thực phẩm và đồ uống thì công nghiệp mỹ phẩm, chất tẩy rửa và công nghiệp dược là các ngành có nhu cầu lớn sử dụng các chất phụ gia tạo hương [2].

1.2.2. Chất thơm -decalactone

Trong số các cấu tử thơm như andehit, este, lactone,…thì lactone là hợp chất khá phổ biến. Các lactone là cấu tử tạo hương thơm chính của của nhiều loại quả như đào, dừa, dâu tây và của rất nhiều thực phẩm chế biến từ thịt, các sản phẩm sữa, các loại caramel [6].

Các lactone được tìm thấy nhiều trong tự nhiên, trong số đó -decalactone (C₁₀H₁₈O₂) có giá trị nhất và cũng được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Chất này tồn tại trong tự nhiên ở mức độ vi lượng, là thành phần chủ yếu tạo nên hương thơm cho nhiều loại hoa quả. -decalactone có mùi thơm của quả đào, mùi hương của bơ sữa, có cường độ mùi rất mạnh, và là phần chính của rất nhiều tổ hợp hương thơm được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm. Hợp chất này là một este nội phân tử của axit 4 hydroxy-decanoic, axit này trong điều kiện pH từ 1 đến 2 sẽ đóng vòng để tạo -decalactone.

Chất thơm -decalactone ở điều kiện thường là một chất lỏng trong suốt không màu, hoặc có màu vàng rơm rất nhạt, rất dễ bay hơi tạo mùi thơm dễ chịu; hầu như không tan trong nước nhưng tan rất tốt trong các dung môi hữu cơ như rượu, dầu, ete, diethyl ether, etyl axetat…

• 
  Công thức phân tử ­C₁₀H₁₈O₂ (M =170).
  
• 
  Công thức cấu tạo
  

• 
  Nhiệt độ sôi: 218 ^oC
  
• 
  Tỷ trọng : 0,952
  

-decalactone không có độc tính và có thể sử dụng trực tiếp trong thực phẩm. Năm 1974, Ủy ban hợp tác Châu Âu đã đưa -decalactone vào danh sách những hợp chất thơm tổng hợp được sử dụng trong thực phẩm ở mức độ cao nhất (từ 5-20 ppm). Tuy nhiên trong thực tế, nồng độ lactone này được sử dụng trong thực phẩm cũng không quá 3 ppm và trong nước hoa từ 20-400 ppm [23]. Trên thế giới, -decalactone được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, làm chất tạo hương cho thực phẩm, kẹo cao su, kem đánh răng, đồ uống, nước hoa, sản phẩm làm mềm vải, các chế phẩm dùng cho tóc…

γ-decalactone có mặt trong một số loại quả nhưng với hàm lượng rất ít. Bởi vậy người ta đã tìm cách sản xuất chất thơm này với một lượng dồi dào nhờ vi sinh vật. Tùy loại vi sinh vật mà chất này được tạo thành theo một trong hai con đường, đó là tổng hợp sinh học (biosynthetic) và chuyển hoá sinh học (biotranformation). Con đường chuyển hóa sinh học là con đường chính được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất chất thơm vì có khả năng cho năng xuất cao hơn tổng hợp sinh học [12].

Quá trình chuyển hóa axit ricinloneic thành chất thơm γ-decalactone nhờ vi sinh vật thực chất là quá trình β-oxy hóa, nhờ hoạt động của các acyl coenzyme A oxidase, diễn ra trong ty thể và các peroxisome. Quá trình β-oxy hóa nói trên bao gồm 4 giai đoạn [24]:

1. 
   Phản ứng khử hydro tạo liên kết đôi giữa 2 nguyên tử carbon ở vị trí  và  (C-2 và C-3), tạo enoyl-CoA. Phản ứng do enzyme acyl-CoA dehydrogenase xúc tác với sự tham gia của FAD.
   
2. 
   Phản ứng hydrate hóa gắn H₂O vào liên kết đôi tạo ra -hydroxyacyl-CoA, được xúc tác bởi enzyme enoyl-CoA hydratase.
   
3. 
   Phản ứng khử hydro đối với -hydroxy acyl-CoA, do enzyme -hydroxy acyl-CoA dehydrogenase xúc tác, tạo ra  -keto acyl-CoA và biến đổi NAD⁺ thành NADH.
   
4. 
   Phản ứng tách acetyl-CoA và tạo acyl-CoA mới ngắn hơn 2 nguyên tử C được xúc tác bởi enzyme acyl-CoA acetyl transferase (còn gọi là thiolase).
   

Trên sơ đồ, axít ricinoleic bị cắt dần thành từng mạch 2 cacbon, tạo ra acetyl CoA, chất này sau đó sẽ biến đổi qua chu trình axit citric và chuỗi hô hấp tế bào, tạo năng lượng ATP cung cấp cho hoạt động sống của vi sinh vật. Quá trình này tạo ra sản phẩm trung gian là axit 4 - hydroxy decanoic, axít này sẽ đóng vòng để tạo ra - decalactone, β- oxy hóa là con đường chính trong công nghiệp để tổng hợp -decalactone và các lactone khác vì cho năng suất cao [24][36][39].

Nguồn axit ricinoleic để vi sinh vật sử dụng chuyển hóa thành - decalactone là dầu thầu dầu. Cây, quả và dầu thầu dầu thương phẩm được minh họa ở hình 1.3 a và b. Dầu thầu dầu có tên thương phẩm tiếng Anh là castor oil (hình 1.3 c), được tách ra từ hạt cây thầu dầu (Ricinus communis) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), bộ Ba mảnh vỏ (Ephorbiales), bằng phương pháp ép lạnh, ép nóng hoặc trích ly.

a.Cây thầu dầu	b.Quả thầu dầu	c.Dầu thầu dầu

Hạt thầu dầu chứa khoảng 50-60% dầu. Dầu thầu dầu là một chất lỏng sền sệt, không màu hoặc hơi vàng, mùi vị nhạt. Dầu thầu dầu chứa nhiều glyxerit như stearin, cholesterin, palmitin nhưng chủ yếu là ricinolein và một ít axít béo như linoleic, stearic. Ricinolein bị thủy phân tạo thành ricinoleic acid {một axit rượu béo có công thức phân tử C₁₈H₃₄O₃ và danh pháp IUPAC [R,Z]-12 hydroxy-9-octadecenoic acid (hình 1.4 )}.

Axit này cấu tạo từ bộ khung 18 nguyên tử cacbon với một liên kết đôi ở giữa nguyên tử cacbon số 9 và số 10, một nhóm hydroxyl gắn với nguyên tử cacbon số 12. Cấu trúc hóa học này khá tương đồng với 4- hydroxy decanoic mà dạng lactone của nó là - decalactone. Đặc điểm này cho phép ta có ý tưởng về việc sinh chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm [4].

Thành phần hóa học của dầu thầu dầu ở các nước như Việt Nam, Ấn Độ, Braxin (bảng 1.1),…có sự khác biệt, tuy nhiên thành phần chính vẫn là axit ricinoleic chiếm tới 83-90,4%. Hiện nay dầu thầu dầu là một trong những dầu công nghiệp quan trọng nhất được sử dụng trực tiếp (ở dạng liên kết glyxerit) hoặc gián tiếp (qua các biến đổi hóa học) trong rất nhiều lĩnh vực công nghiệp và đời sống. Đặc biệt, dầu thầu dầu là nguồn nguyên liệu cho việc tổng hợp các hợp chất thơm dạng lactone .

Bảng 1.1. Thành phần axít hữu cơ trong dầu thầu dầu [17].

Axit	Dầu Việt Nam (%)	Dầu Braxin (%)	Dầu Ấn Độ (%)
Ricinoleic	86,36	83- 90	87,4- 90,4
Linoleic		3,19- 5,98	2,9- 4,0
Oleic		2,96- 5,64	2,5- 4,0
Stearic		0,68- 1,84	0,9- 1,3
Palmitic		0,87- 2,35	0,8- 1,3
Dihydrostearic			0,5- 0,8

1.3.2. Các chủng nấm men có khả năng chuyển hóa axit ricinoleic thành chất thơm γ- decalactone

Những loài vi sinh vật có khả năng chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm - decalactone bao gồm vi khuẩn, nấm mốc và nấm men. Tuy nhiên sản lượng và hiệu suất tổng hợp - decalactone của vi khuẩn và nấm mốc rất thấp, do đó các nghiên cứu ứng dụng chủ yếu tập trung vào nhóm nấm men chuyển hóa chất béo. Một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa chất béo được nêu trong bảng 1.2.