CẤy ghép tủy xưƠng đỒng loạI ĐIỀu trị BỆnh suy tủy trên mô HÌnh chuột trương Hải Nhung, Dương Thanh Thủy, Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc
tải về 244.32 Kb.
|
- Điều hướng trang này:
- Từ khóa
- 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1. Mẫu vật và vật liệu
- 2.3. Ph ươ ng pháp 2.3.1. Xây dựng mô hình suy tủy
- 2.3.1.1. Qui trình đánh giá cảm quan về biểu hiện sinh lí và bệnh lí bên ngoài
- 2.3.1.2 Phương pháp khảo sát bạch cầu tổng
- 2.3.2. Ghép tủy
- 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1. Tạo mô hình suy tủy
TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 13, SOÁ K1 - 2010 CẤY GHÉP TỦY XƯƠNG ĐỒNG LOẠI ĐIỀU TRỊ BỆNH SUY TỦY TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT Trương Hải Nhung, Dương Thanh Thủy, Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 08 tháng 01 năm 2009, hoàn chỉnh sửa chữa ngày 24 tháng 09 năm 2009) TÓM TẮT: Suy tủy xương là căn bệnh do suy giảm mạnh các chức năng tủy xương và khả năng sản sinh các tế bào máu. Theo Emmanuel C Besa và cs (2008), tỷ lệ mắc bệnh này ở Trung Quốc, Đông Nam Á cao hơn gấp 3-4 lần so với châu Âu và Mỹ. Theo thông tin của Bộ Y tế, ở Việt Nam, mức độ nguy hiểm của bệnh suy tủy xương đứng hàng thứ 3 trong các bệnh về máu. Việc tạo ra các mô hình động vật mắc bệnh suy tủy giúp hiểu sâu hơn về cơ chế bệnh, phục vụ cho các nghiên cứu tiền lâm sàng. Trên cơ sở ấy, nghiên cứu này nhằm xây dựng mô hình bệnh suy tủy trên chuột nhắt trắng, bằng việc sử dụng kết hợp Busulfan (BU) với Cyclophosphamide (CY), qua đó khảo sát khả năng điều trị cấy ghép tế bào tủy xương đồng loại trên mô hình suy tủy ở chuột. Kết quả nghiên cứu cho thấy có thể gây suy tủy trên chuột khi kết hợp hai hóa chất trên, với tỉ lệ chết do suy tủy trung bình 67%. Việc cấy ghép tủy xương đã cải thiện tỉ lệ sống của chuột suy tủy từ 33% lên đến 88%. Từ khóa: Suy tủy xương, mô hình động vật suy tủy xương, cấy ghép tủy xương chuột. 1. GIỚI THIỆU Busulfan hay Cyclophosphamide thường được sử dụng trong cấy ghép, chúng có vai trò ức chế miễn dịch, giúp cơ thể người bệnh tiếp nhận mô ghép tốt hơn. BU và CY là các hóa chất gây độc tế bào. Theo Botnick LE và cs, hai chất nói trên tác động mạnh đến các tế bào gốc tạo máu, từ đó dẫn đến tình trạng suy tủy cấp. Sự kết hợp BU với CY trên chuột đã được nhiều nghiên cứu chứng minh có hiệu quả gây suy tủy mạnh, thậm chí gây chết cho động vật với tỷ lệ cao và lượng bạch cầu giảm mạnh sau khi xử lí thuốc. [5; 7] Liệu pháp ghép tủy xương thường cho hiệu quả cao trong trị liệu các bệnh suy tủy, đặc biệt là các trường hợp nặng do di truyền. Ngoài tế bào bạch cầu trưởng thành, quần thể tế bào đơn nhân tủy xương còn có các tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc trung mô, vai trò của chúng rất quan trọng trong sự phục hồi tình trạng suy tủy.[2; 3; 7] Nghiên cứu này gồm hai nội dung: 1. Tạo mô hình chuột suy tủy bằng việc kết hợp giữa CY và BU, với liều lượng thích hợp; 2. Đánh giá hiệu quả điều trị suy tủy trên chuột bằng cấy ghép tủy xương đồng loại. 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1. Mẫu vật và vật liệu Chuột Mus musculus var. Albino cái trên 6 tuần tuổi (dùng để ghép); con đực dưới 4 tuần tuổi (dùng để thu tế bào) sạch bệnh, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. Cyclophosphamide (Endoxan), dạng bột của hẵng Baxter Oncology GmbH (Đức). Busulfan (Myleran), dạng viên của hẵng Heumann Pharma GmbH (90537 Feucht (Đức).
CY được khảo sát với hai chế độ: tiêm liên tục và không liên tục, mỗi chế độ tiêm được tiến hành với 3 liều khác nhau: 200 mg/kg; 250 mg/kg và 300 mg/kg. Mỗi con chuột được tiêm 50 mg/kg/1 lần/ngày, cho đến khi chúng nhận đủ liều khảo sát. Với chế độ tiêm liên tục, CY được tiêm vào các ngày liên tiếp cho đến khi đủ liều khảo sát (200mg/kg được chia thành 4 lần liên tiếp trong 4 ngày; 250 mg/kg cho 5 lần tiêm; tương tự đối với liều 300 mg/kg được chia thành 6 lần tiêm liên tục). Với chế độ tiêm không liên tục: liều CY 200 mg/kg được tiêm 2 ngày liên tục, nghỉ 4 ngày, sau đó tiêm tiếp 2 liều cuối. Liều CY 250 được tiêm 3 ngày liên tục, nghỉ 4 ngày, sau đó tiêm tiếp 2 liều cuối. Liều 300 mg/kg, tiêm 3 ngày liên tục, nghỉ 4 ngày, sau đó tiêm tiếp 3 liều còn lại. BU được sử dụng cho chuột uống 1 liều duy nhất (40 mg/kg) vào ngày đầu tiên của thí nghiệm, tức là ngày bắt đầu tiêm CY. Sau khi kết thúc quy trình xử lí thuốc, tiến hành đánh giá hiệu quả suy tủy của chuột qua các chỉ tiêu: trọng lượng cơ thể; biểu hiện cảm quan về sinh lí, bệnh lí; bạch cầu tổng số; tỉ lệ sống chết (ghi nhận vào các ngày N5, N7, N14, N28). Thí nghiệm được bố trí như sau: Thí nghiệm 1: 18 chuột cái được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, có 2 lô thử thuốc (uống BU) + tiêm CY nồng độ 250 mg/kg (tiêm liên tục và không liên tục). 1 lô đối chứng (tiêm và uống dung dịch sinh lí PBS với thể tích và thời gian tương ứng). Thí nghiệm 2: 18 chuột cái được chia thành 3 lô: có 2 lô thử thuốc (uống BU) + tiêm CY nồng độ 250 mg/kg (tiêm liên tục và không liên tục). 1 lô đối chứng (tiêm và uống dung dịch sinh lí PBS với thể tích và thời gian tương ứng). Thí nghiệm 3: 18 chuột cái được chia thành 3 lô: 2 lô thử thuốc (uống BU) + tiêm CY nồng độ 300 mg/kg (tiêm liên tục và không liên tục). 1 lô đối chứng (tiêm và uống dung dịch sinh lí PBS với thể tích và thời gian tương ứng). 2.3.1.1. Qui trình đánh giá cảm quan về biểu hiện sinh lí và bệnh lí bên ngoài Chuột thí nghiệm được cân 7 ngày/lần. Ghi nhận hình thái và biểu hiện sinh lí của chuột hằng ngày: sống/chết; gầy ốm, mắt (mù, viêm kết mạc), lông, dáng đi, mức độ linh hoạt và các biểu hiện bất thường khác. 2.3.1.2 Phương pháp khảo sát bạch cầu tổng Lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột vào các ngày N (ngày kết thúc tiêm thuốc), và vào các ngày N0, N5, N10 và N15. Trộn máu trong ống trộn bạch cầu với dung dịch ly giải hồng cầu và đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm Neubauer dưới kính hiển vi quang học. 2.3.2. Ghép tủy Chuột được ghép với 2 liều tế bào: 1 x 106 tế bào/con và 5 x 106 tế bào/con. Tế bào tủy xương được thu nhận từ chuột đực. Chuột bị giết và thu nhận chi sau, lấy xương đùi, sử dụng dung dịch PBS dội rửa vào tủy xương và thu nhận tế bào. Li tâm dịch tế bào trong 5 phút với tốc độ 2500 vòng/phút, thu huyền phù tế bào trong 500 µl PBS. Nhuộm tế bào với Trypan Blue (Cambrex) để phân biệt tế bào sống và chết, điều chỉnh mật độ tế bào sống về giá trị mong muốn. Huyền phù tế bào được ghép với liều duy nhất: tiêm vào tĩnh mạch đuôi của chuột ngay sau ngày kết thúc liều thuốc suy tủy cuối cùng. Hiệu quả phục hồi của chuột được đánh giá qua các chỉ tiêu đã trình bày ở mục 2.3.1. Mỗi liều tế bào ghép được tiến hành trên 8 con chuột, đối chứng là chuột suy tủy không được ghép tế bào. [2; 4] Các kết quả thống kê được xử lí bằng phần mềm Microsoft Excel (độ tin cậy 95%).
Kết quả được đánh giá dựa trên 4 chỉ tiêu, trong đó tỉ lệ chết quan trọng nhất. Kết quả quan sát hình thái, sinh lí: Chuột ở các lô thí nghiệm với liều và chế độ tiêm khác nhau đều có dấu hiệu suy yếu về hình thái và sinh lí: cơ thể gầy ốm, kém linh hoạt, ít ăn. Riêng chuột xử lí 250 mg CY có thêm biểu hiện rụng lông; một số chuột thuộc nhóm xử lí 300 mg CY bị mù mắt. Chuột ở nhóm đối chứng bình thường, không có các biểu hiện trên. Các kết quả bước đầu này cho thấy BU và CY có tác động biến đổi sinh lí, hình thái lên chuột, đặc biệt CY ở liều cao. Điều này phù hợp với khuyến cáo của nhà sản xuất về tác dụng của BU và CY. Kết quả theo dõi thể trọng: Hầu hết chuột sau khi bị xử lí thuốc đều giảm cân rõ rệt so với nhóm đối chứng. Trong thí nghiệm 1, chế độ tiêm không liên tục gây giảm cân hơn chế độ tiêm liên tục, trong khi đó ở thí nghiệm 2, kết quả cho ngược lại. Ở thí nghiệm 3, cả hai chế độ tiêm đều gây giảm cân mạnh. Rõ ràng, CY liều 250 mg/kg trở lên gây giảm cân mạnh hơn liều 200 mg/kg. Trọng lượng chuột thấp nhất ghi nhận được trong các lô thí nghiệm là 17-19 gram/con. Kết quả bạch cầu tổng: Chuột sau khi xử lí thuốc ở tất cả các lô thí nghiệm đều có hiện tượng giảm mạnh bạch cầu tổng. Mức giảm sau khi xử lí thuốc 1 ngày so với đối chứng đạt rất cao: từ 84% đến 94% (Bảng 1). Bảng 1. Sự khác biệt bạch cầu tổng giữa các lô thí nghiệm với lô đối chứng
(Độ tin cậyP <0,05) Kết quả của nghiên cứu cho thấy, giá trị bạch cầu tổng ở các lô thí nghiệm đều giảm mạnh so với lô đối chứng, và sự giảm này có ý nghĩa thống kê, cụ thể bạch cầu tổng ở các lô thí nghiệm vào ngày N0 đều giảm mạnh so với ngày N-. Từ các kết quả trên, có thể kết luận nghiên cứu này đã tạo ra dấu hiệu suy tuỷ, ít nhất với dòng tế bào bạch cầu của chuột. Các hóa chất sử dụng có ảnh hưởng dương tính. Kết quả về tỉ lệ chết: Sau khi xử lí thuốc, tất cả các lô thí nghiệm đều có chuột bị chết với tỉ lệ khá cao (33% đến 67%), chủ yếu vào khoảng 14 ngày. Theo Phepls T.R, (và nhiều tác giả khác), nếu trong khoảng 5 ngày sau điều trị bằng tác nhân ức chế miễn dịch mạnh (thuốc hoặc phóng xạ), chuột chết có thể là do các tác động phụ của thuốc gây hại lên các cơ quan khác, đặt biệt là tổn thương đường ruột quá trầm trọng làm chuột không chống chọi nổi và chết; chuột này có được ghép tế bào tủy xương thì tỉ lệ sống được sau khi ghép rất thấp, gần như không thể hồi phục được. Theo Millar JL và cs (Br J Cancer 1975;32:193-198), việc xử lí BU trên chuột CBA đạt tỉ lệ sống 0% vào ngày khảo sát thứ 30, và thời gian sống trung bình của chuột là 15,8 ngày mới đạt hiệu quả gây suy tủy. Biểu đồ 1 cho thấy, vào ngày N5 tỉ lệ chuột chết ở thí nghiệm 1 và 3 cao hơn nhiều so với thí nghiệm 2, như vậy nếu lấy mốc 5 ngày đầu khảo sát thì thí nghiệm 2 tốt hơn. Bước đầu cho thấy, sự kết hợp BU 40 mg/kg và CY 250 mg/kg hiệu quả hơn so với việc dùng BU 40 mg/kg kết hợp CY 200 mg/kg, và CY 300 mg/kg. Hơn nữa, trong thí nghiệm 1 và 2 vào ngày N14 và N28, lô không liên tục (tỉ lệ chết đều là 67%), cao hơn lô liên tục (thí nghiệm 1 là 33% và thí nghiệm 2 là 50%) nên chế độ tiêm không liên tục ở thí nghiệm 2 là chiếm ưu thế hơn. Trong thí nghiệm 3, tuy cả hai chế độ tiêm đều có tỉ lệ chết 67%, nhưng chế độ tiêm liên tục làm chuột chết nhiều trong 5 ngày đầu, do vậy chế độ tiêm không liên tục được lựa chọn. 
Каталог: site site -> KẾ hoạch xây dựng tcvn năM 2015 site -> BÁo cáo quy hoạch vùng sản xuất vải an toàn tỉnh bắc giang đẾn năM 2020 (Thuộc dự án nâng cao chất lượng, an toàn sản phẩm nông nghiệp và phát triển chương trình khí sinh học ) Cơ quan chủ trì site -> 1. Mục tiêu đào tạo: Mục tiêu chung site -> Unit 2 presonal information a, telephone numbers site -> ĐỀ CƯƠng ôn tập hki hóa họC 11 CƠ BẢn a. Trắc nghiệm chủ đề 1: SỰ ĐIỆn LI site -> KÕt qu¶ ®Ò tµi "nghiªn cøu trång rõng Tr¸m tr¾ng site -> Mẫu tkn1 CỘng hoà XÃ HỘi chủ nghĩa việt nam độc lập Tự do Hạnh phúc site -> CỘng hòa xã HỘi chủ nghĩa việt nam độc lập Tự do Hạnh phúc ĐĂng ký thất nghiệP site -> BỘ TÀi chính —— Số: 25/2015/tt-btc cộng hoà XÃ HỘi chủ nghĩa việt nam site -> CỘng hòa xã HỘi chủ nghĩa việt nam độc lập Tự do Hạnh phúc TỜ khai của ngưỜi hưỞng trợ CẤP tải về 244.32 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||