Bệnh lở mồm long móng (fmd) là bệnh truyền lây mạnh nhất của thú có vú và có khả năng gây ra tổn thất kinh tế nặng nề trên chăn nuôi gia súc móng guốc mẫn cảm

Bệnh lở mồm long móng (FMD) do virus thuộc giống Aphthovirus, họ Picornaviridae. Có bảy chủng huyết thanh của virus FMD, đặt tên là O, A, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3 và Asia 1, gây nhiễm cho thú móng guốc. Bệnh nhiễm ở bất kỳ chủng huyết thanh nào cũng không cho ra miễn dịch đối với chủng huyết thanh khác. Bên trong các chủng huyết thanh, nhiều dòng có thể được nhận diện bằng các xét nghiệm sinh hóa và miễn dịch học.

Ở Châu Phi, virus FMD được duy trì bởi bò và trâu rừng Châu Phi (Syncerus caffer) và chúng là những ký chủ thường xuyên nhất. Có bằng chứng cho thấy mặc dù các loài thú thuần dưỡng và hoang dã khác cũng bị nhiễm, nhưng chúng không thể duy trì bệnh nhiễm quá vài tháng nếu không có mặt của trâu rừng Châu Phi.

Ở bất cứ nơi nào trên thế giới, bò thường là nguồn tàng trữ chính của virus FMD, tuy nhiên trong một số hoàn cảnh, virus thể hiện thích nghi đặc trưng đối với heo nhà, cừu và dê. Điều này có thể do những virus thích nghi này có khả năng biến đổi khả năng thích nghi và gây nhiễm đến các loài khác nếu có cơ hội. Tuy nhiên, dòng virus FMD Cathay thích nghi với heo trở nên không gây nhiễm cho thú nhai lại lớn trên thực địa hay thực nghiệm, và cần đến các tế bào có nguồn gốc từ heo để phân lập ban đầu. Loài hoang dã bên ngoài Châu Phi, trước kia, không có khả năng duy trì virus FMD. Bằng chứng cho thấy rằng bệnh nhiễm ở hươu trước kia đã xảy ra do tiếp xúc, trực tiếp hay gián tiếp, với thú vật thuần dưỡng bị nhiễm.

Với các loài thú thuần dưỡng, bò, heo, cừu, dê và trâu đều mẫn cảm với FMD (30). Ngoài ra, nhiều loài móng guốc hoang dã, như hươu, linh dương và heo rừng có thể trở nên bị nhiễm, mặc dù ngoại trừ trâu rừng Châu Phi, chúng đều không thể hiện vai trò quan trọng trong dịch tễ học của FMD. Các dòng virus FMD mà gây nhiễm cho bò đã được phân lập từ heo hoang dã và hươu. Để chẩn đoán FMD trên các loài hoang dã, người ta có thể áp dụng các phương pháp tương tự như mô tả đối với các thú vật nuôi trang trại.

Bệnh nhiễm của thú vật mẫn cảm với virus FMD dẫn đến thể hiện mụn nước ở chân, trong và quanh xoang miệng, và trên tuyến vú của thú cái. Các bệnh tích vành móng có thể làm thành một vành không phát triển mà dần dần mọc xuống phía dưới của móng mà có thể sử dụng để ước tính thời gian từ khi bệnh nhiễm xảy ra. Trong bệnh nhiễm nặng nề ở móng, móng có thể sút ra. Viêm vú (mastitis) là hậu quả thường có của FMD ở bò sữa. Các mụn nước cũng có thể hiện diện ở các vị trí khác, như bên trong lỗ mũi và các điểm chịu sức ép của bàn chân – nhất là ở heo. Mức độ nặng nề của các dấu hiệu lâm sàng khác nhau theo các dòng virus, liều lượng phơi nhiễm, lứa tuổi và giống của thú vật, loài ký chủ và mức độ miễn dịch của chúng (44). Các dấu hiệu có thể từ nhẹ hay không thể hiện bệnh nhiễm, đến nặng nề. Một số trường hợp có thể gây tử vong. Tỷ lệ tử vong do viêm cơ tim đa điểm (multifocal myocarditis) thường xảy ra nhất ở thú non: viêm cơ (myositis) cũng có thể xuất hiện ở những vị trí khác.

Ở những cơ sở mà có lịch sử về chết đột ngột ở gia súc móng guốc non, kiểm tra chặt chẽ thú vật trưởng thành có thể thường phát hiện sự hiện diện của các bệnh tích mụn nước nếu có tham gia của FMD. Sự hiện diện của mụn nước ở các trường hợp tử vong có khác nhau.

Ở những thú vật có lịch sử về bệnh mụn nước, việc phát hiện virus FMD trong các mẫu của dịch mụn nước, mô biểu bì, mẫu hầu họng-thanh quản (oesophageal-pharyngeal – OP), sữa hay máu là đủ để thiết lập một chẩn đoán. Các chẩn đoán cũng có thể thiết lập được bằng phân lập virus FMD từ máu, tim hay các phủ tạng kháng của các trường hợp tử vong. Cơ tim viêm có thể thấy được từ đại thể (gọi là “tim vằn cọp – tiger heart”) trong một số trường hợp tử vong.

Virus FMD có thể sinh sôi và được tiết xuất ra từ đường hô hấp của thú vật. Việc tiết xuất theo đường không khí của virus xảy ra trong giai đoạn cấp tính của bệnh nhiễm. Virus FMD có thể hiện diện trong tất cả các tiết dịch và xuất dịch của thú vật bị nhiễm cấp tính bao gồm tiết xuất qua đường hô hấp. Quá trình truyền lây thường ảnh hưởng bởi trực tiếp tiếp xúc giữa các thú bị nhiễm với thú mẫn cảm, hoặc hiếm hơn, phơi nhiễm của thú mẫn cảm với các xuất dịch và tiết dịch của thú vật bị nhiễm cấp tính. Sau khi hồi phục từ giai đoạn cấp tính của bệnh nhiễm, virus gây nhiễm biến mất khỏi mọi xuất dịch và tiết dịch, ngoại trừ dịch OP ở một số thú nhai lại có thể tiếp tục tìm thấy virus sống. Các thú vật mà virus tồn tại dai dẳng trong OP đến hơn 28 ngày sau bệnh nhiễm, thì được gọi là thú vật mang trùng. Heo không là thú vật mang trùng. Bằng chứng mà cho thấy rằng, đặc biệt ở trâu rừng Châu Phi, thú vật mang trùng có khả năng, dù hiếm có, truyền lây bệnh đến các thú vật mẫn cảm qua tiếp xúc trực tiếp: cơ chế tham gia này chưa được rõ. Giai đoạn mang trùng thường không kéo dài quá 6 tháng, tuy nhiên một số ít có thể mang trùng đến 3 năm. Ở trâu rừng Châu Phi, các cá thể thú đã cho thấy tàng trữ virus trong ít nhất 5 năm, nhưng đây không là khả năng sống lâu của virus. Bên trong đàn trâu rừng, virus có thể duy trì đến 24 năm hay dài hơn. Ở đây không có thông tin về độ dài của giai đoạn mang trùng trên các loài trâu nhà khác, trâu nước ở Đông Nam Á. Trâu nhà, cừu và dê không thường mang trùng đối với virus FMD quá vài tháng.

Do bản chất lây lan mạnh và tầm quan trọng đối với kinh tế của FMD, các chẩn đoán phòng thí nghiệm và nhận diện chủng huyết thanh của virus phải được thực hiện trong một cơ sở mà hội đủ các yêu cầu cho các mầm bệnh Khu trú Nhóm 4 như đã nêu trong Chương 1.1.2 An toàn sinh học và bảo vệ sinh học trong phỏng thí nghiệm vi sinh thú y và cơ sở chăn nuôi thú vật. Các quốc gia thiếu điều kiện tiếp cận đến phòng thí nghiệm chuyên môn quốc gia hay vùng phải gởi các mẫu đến Phòng thí nghiệm Tham chiếu của OIE. Các cơ sở sản xuất vaccin cũng phải hội đủ các yêu cầu của mầm bệnh Khu trú Nhóm 4.

Chẩn đoán và các tác nhân thử hiện này đã sẵn có dưới dạng bộ kit hay thành từng phần riêng biệt từ các Phòng thí nghiệm Tham chiếu của OIE đối với FMD. Việc sử dụng các kháng nguyên bất hoạt trong xét nghiệm hấp phụ miễn dịch kết hợp enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay – ELISA), làm đối chứng trong xét nghiệm phát hiện kháng nguyên hay để phản ứng với huyết thanh xét nghiệm trong ELISA cạnh tranh (competitive ELISA) khối thể lỏng (liquid-phase blocking) hay khối thể rắn (solid-phase), làm giảm nguy cơ đối với bệnh, so với việc sử dụng virus sống. Các tác nhân thử được cung cấp dạng đông khô hay trong glycerol hay không glycerine hóa (non-glycerinated) mà đông lạnh và có thể duy trì ổn định ở các nhiệt độ, lần lượt, từ +1^oC đến +8^oC, - 30^oC đến -5^oC và -90^oC đến -50^oC, trong nhiều năm. Cơ quan Năng lượng Nguyên tử Quốc tế (International Atomic Energy Agency) đã xuất bản một hướng dẫn mà bao gồm các khuyến cáo xét nghiệm và các giao thức kiểm tra chất lượng.

B. CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN

Với các chẩn đoán phòng thí nghiệm, mô tốt nhất là biểu bì hay dịch mụn nước. Một cách lý tưởng, ít nhất 1 g mô biểu bì phải thu thập được từ vùng có mụn nước chưa vỡ hay mới vỡ, thường từ lưỡi, màng nhày miệng hay mụn nước ở chân. Để tránh thương tích cho người thu thập mẫu, cũng như vì lý do nhân đạo với thú vật, khuyên rằng thú vật phải được gây mê trước khi thực hiện lấy mẫu.

Các mẫu biểu bì phải được đặt vào môi trường vận chuyển gồm các lượng bằng nhau của glycerol và đệm phosphate 0,04 M, pH 7,2-7,6, thích hợp là pha thêm chất kháng sinh (penicillin [1000 đơn vị quốc tế (IU)], neomycin sulphate [100 IU], polymyxin B sulphate [50 IU], mycostatin [100 IU]). Nếu không sẵn có đệm phosphate 0,04 M, môi trường nuôi cấy mô hay đệm muối phosphate (phosphate buffered saline – PBS) có thể thay thế, nhưng quan trọng là pH cuối cùng của hỗn hợp glycerol/đệm trong khoảng pH 7,2-7,6. Virus FMD cực kỳ mỏng manh trong pH thấp và đệm cho môi trường vận chuyển là một tiêu chí cho lấy mẫu thành công. Các mẫu phải được giữ trong tủ lạnh hay trong nước đá cho đến khi đến được phòng thí nghiệm.

Khi mô biểu bì không sẵn có từ thú nhai lại, thí dụ như trong các trường hợp bệnh tiến triển tốt hay đang hồi phục bệnh, hay trường hợp nghi ngờ bệnh nhiễm mà không thể hiện các dấu hiệu lâm sàng, các mẫu của dịch OP có thể được thu thập bằng các phương pháp dùng ống thông sinh thiết (hút đờm) (hay ở heo dùng tăm bông ngoáy hầu họng) để gởi đến phòng thí nghiệm cho phân lập virus hay xét nghiệm bằng phản ứng chuỗi phân tử với enzyme giải mã đảo ngược (reverse-transcription polymerase chain reaction – RT-PCR). Tình trạng virus huyết (viraemia) cũng có thể phát hiện được bằng kiểm tra các mẫu huyết thanh với xét nghiệm RT-PCR hay phân lập virus. Để thu thập tăm bông ngoáy hầu họng trên heo, con thú phải được cho vào lồng gỗ và thò cổ ra ngoài. Đặt một cây tăm bông trong một dụng cụ thích hợp, như kìm kẹp mạch máu, sau đó đưa tăm bông vào sâu trong miệng, đến tận họng.

Trước khi thu thập các mẫu OP từ bò hay thú nhai lại cỡ lớn (như trâu), 2 ml dịch vận chuyển (cấu thành từ đệm phosphate 0,08 M chứa 0,01% albumin huyết thanh bò, 0,002% đỏ phenol, các kháng sinh [1000 đơn vị quốc tế/ml penicillin, 100 đơn vị quốc tế /ml mycostatin, 100 đơn vị quốc tế /ml neomycin, và 50 đơn vị quốc tế /ml polymyxin], điều chỉnh pH đến 7,2) phải được cho vào một vật chứa 5 ml có khả năng chịu được đông lạnh bằng băng CO₂ (đá khô) hay nitrogen lỏng (39).

Một mẫu OP được thu thập bằng cách cho ống thông theo lưỡi vào đến vùng hầu họng và sau đó thụt mạnh ống về phía sau và phía trước 5-10 lần giữa phần đầu của thực quản và phần sau của hầu họng. Mục đích là để thu thập dịch hầu họng và đặc biệt là các tế bào biểu bì của vùng này, bao gồm tế bào ở phần gần của thực quản, vách của hầu họng, tế bào hạch hạnh nhân và bề mặt của khẩu cái mềm. Nếu mẫu không chứa đủ lượng bợn tế bào thì phải lặp lại thao tác.

Sau khi thu thập dịch OP bằng ống thông sinh thiết, các chất chứa phải được đổ vào một chai cổ rộng trong suốt, có dung tích khoảng 20 ml. Chất dịch đem kiểm tra phải chứa chất liệu tế bào nhìn thấy được. Sau đó 2 ml mẫu này được thêm vào 2 ml dịch vận chuyển, đảm bảo rằng có chất liệu tế bào; hỗn hợp này được lắc nhẹ nhàng và phải có pH cuối cùng khoảng 7,6. Các mẫu mà bị vấy nhiễm bởi chất chứa dạ cỏ có thể không thích hợp cho nuôi cấy. Các mẫu mà thấy có chứa máu là không hoàn hảo. Có thể thực hiện lấy mẫu lại sau khi miệng và họng của con thú được súc xả bằng nước hay bằng PBS. Khi lấy mẫu từ nhiều con thú, thì phải rửa sạch và sát trùng ống thông giữa các lần lấy mẫu. Việc rửa và sát trùng thực hiện bằng cách rửa ống thông bằng nước uống được, sau đó ngâm vào một chất sát trùng thích hợp (như 0,5% acid citric trong nước uống [w/v]) sau đó xả sạch chất sát trùng bằng nước uống được trước khi lấy mẫu con thú tiếp theo.

Mẫu OP lấy từ thú nhai lại nhỏ thu thập bằng cách cho 2 ml dịch vận chuyển vào một chai cổ rộng dung tích khoảng 20 ml, và sau khi lấy mẫu, rửa xả ống thông sinh thiết trong dịch vận chuyển này để xả ra mẫu OP. Sau đó dịch chứa mẫu này được chuyển sang vật chứa dung tích khoảng 5 ml để vận chuyển. Vật chứa nhỏ này phải có khả năng chịu đựng đông lạnh của băng CO₂ hay nitrogen lỏng (39).

Các mẫu dịch OP phải được làm lạnh hay đông lạnh ngay sau khi thu thập. Nếu mẫu phải vận chuyển lâu hơn vài giờ, thì thích hợp là đông lạnh mẫu bằng đặt vào hoặc là băng CO₂ hay nitrogen lỏng. Trước khi đông lạnh, các vật chứa phải cẩn thận niêm kín bằng nắp vặn kín khí hay silicone. Điều này đặc biệt quan trọng vì khi sử dụng băng CO₂, do CO₂ chui vào mẫu OP sẽ làm giảm pH của mẫu, làm bất hoạt mọi virus có thể có trong mẫu. Các vật chứa bằng thủy tinh không thể sử dụng được vì nguy cơ sẽ nổ vỡ khi giải đông nếu nitrogen lỏng rò rỉ vào bên trong. Các mẫu phải đến phòng thí nghiệm thích hợp là trong tình trạng đông lạnh bền, hoặc nếu không thể thực hiện được, thì phải trong ướp lạnh.

Các cảnh báo chuyên môn là cần thiết khi gởi chất liệu mẫu dễ hư hỏng có nghi ngờ FMD, đến hoặc là trong nước hay giữa các quốc gia. Hiệp hội Vận tải Hàng không Quốc tế (International Air Transport Association – IATA), các Quy định về Hàng hóa Nguy hiểm (Dangerous Goods Regulations – DGR) đã đặt ra yêu cầu về đóng gói và gởi các mẫu chẩn đoán theo bấy kỳ phương cách thương mại nào. Những yêu cầu này đã được nêu vắn tắt trong Chương 1.1.1 Thu thập và gởi các mẫu chẩn đoán.

Một loạt các dạng mẫu bao gồm biểu bì, các mẫu OP và huyết thanh có thể được kiểm tra bằng phân lập virus hay bằng RT-PCR. Ngược lại, ELISA thì thích hợp để kiểm tra các huyễn dịch biểu bì (epithelial suspensions), các dịch mụn nước hay các phù nổi của tế bào nuôi cấy (cell culture supernatants), nhưng cũng đủ nhạy để kiểm tra trực tiếp các mẫu OP hay huyết thanh.

Mẫu biểu bì phải lấy từ PBS/glycerol, được thấm khô trong giấy thấm để giảm lượng glycerol, vốn độc với tế bào nuôi cấy, sau đó được cân lượng. Chuẩn bị một huyễn dịch bằng xay nhuyễn mẫu trong cát vô trùng bằng bộ chày cối vô trùng, với một lượng nhỏ môi trường nuôi cấy mô và các chất kháng sinh. Môi trường sẽ được thêm vào cho đến khi có thể tích cuối cùng gấp chín lần thể tích mẫu biểu bì ban đầu, cho ra huyễn dịch 10%. Dịch này được gạn bằng ly tâm nghiêng ở 2000 g trong 10 phút. Sau khi được gạn ra, chất lắng là giá thể của mẫu thực địa có nghi ngờ chứa virus FMD được đem cấy vào các tế bào nuôi cấy hay truyền vào chuột con chưa cai sữa. Các hệ thống tế bào nuôi cấy mẫn cảm bao gồm các tế bào sơ cấp (primary cells) tuyến ức bò (bê) và các tế bào sơ cấp của thận heo, bê hay cừu non. Các lớp tế bào đã được thiết lập, như các tế bào BHK-21 (thận chuột hamster non – baby hamster kidney) và IBRS-2, cũng có thể được sử dụng, nhưng thường kém mẫn cảm hơn so với các tế bào sơ cấp trong phát hiện các hàm lượng có khả năng gây nhiễm thấp (19). Tính mẫn cảm của bất kỳ tế bào nào được sử dụng cũng phải được thử nghiệm bằng chế phẩm chuẩn của virus FMD. Việc sử dụng các tế bào IB-RS-2 giúp phân biệt bệnh mụn nước của heo (swine vesicular disease – SVD) với FMD (do virus SVD chỉ phát triển được trên dạng tế bào này) và thường chủ yếu dùng cho phân lập các dòng chỉ sinh sôi trên heo (procinophilic strains), như dòng O Cathay. Tế bào nuôi cấy phải được kiểm tra về tác động gây bệnh tích tế bào (cytopathic effect – CPE) trong 48 giờ. Nếu không phát hiện thấy tác động gây bệnh tích tế bào, các tế bào này phải đem đông lạnh và giải đông, để đem cấy vào các môi trường nuôi cấy tươi và được kiểm tra về tác động gây bệnh tích tế bào trong 48 giờ nữa. Chuột non chưa cai sữa là một thay thế cho tế bào nuôi cấy và chuột này phải ở lứa tuổi từ 2-7 ngày và được chọn lọc từ cùng dòng giống. Một số virus thực địa có thể cần đến vài lượt cấy truyền trước khi chúng có thể trở nên thích nghi với chuột (58). Trong trường hợp của dịch OP, xử lý trước với thể tích tương đương chloro-fluoro-carbons có thể cải thiện tỷ lệ phát hiện virus bằng phóng thích virus ra khỏi phức hợp miễn dịch.

Phương pháp thích hợp cho phát hiện kháng nguyên virus của FMD và nhận diện chủng huyết thanh của virus là ELISA (28, 53). Đây là một xét nghiệm chồng lớp gián tiếp (indirect sandwich test) với các hàng khác nhau trong các phiến nhiều giếng được tráng kháng huyết thanh của thỏ đối với từng chủng huyết thanh của bảy chủng huyết thanh virus FMD. Những huyết thanh này gọi là “huyết thanh bắt giữ - capture sera”. Huyễn dịch mẫu xét nghiệm được cho vào từng hàng, và cũng gồm các các đối chứng thích hợp. Tiếp theo cho vào kháng huyết thanh của chuột lang (guinea-pig) đối với từng chủng của virus FMD, sau đó là huyết thanh thỏ kháng với huyết thanh của chuột lang đã được kết hợp với một enzyme. Việc rửa được thực hiện giữa từng giai đoạn để loại bỏ các tác nhân thử không kết bám được. Một phản ứng màu lúc cho chất nền enzyme và chất màu cho thấy phản ứng dương tính. Với các phản ứng dương tính mạnh sẽ nhận thấy bằng mắt thường, nhưng các kết quả cũng có thể đọc bằng quang phổ kế (spectrophotometrical) ở độ dài sóng thích hợp. Trong trường hợp này, một hấp phụ quang phổ lớn hơn 0,1 quan phổ nền cho thấy đó là phản ứng dương tính; chủng huyết thanh của virus FMD cũng có thể nhận diện được. Các giá trị gần với 0,1 sẽ được xác nhận bằng xét nghiệm lại hay bằng khuyếch đại kháng nguyên qua cấy truyền trên mô nuôi cấy và xét nghiệm dịch phù nổi một khi tác động gây bệnh tích tế bào đã phát triển. Một giao thức thích hợp được nêu dưới đây. Các giao thức khác hiện hành thường có định dạng và tiêu chí diễn giải kết quả hơi khác biệt (3, 6).

Tùy theo loài bị nhiễm và nguồn gốc địa lý của mẫu, có thể thực hiện song song xét nghiệm đối với virus SVD hay virus viêm miệng mụn nước (vesicular stomatitis – VS). Lý tưởng là một chẩn đoán phân biệt đầy đủ sẽ được thực hiện đối với tất cả các tình trạng mụn nước.

Kháng huyết thanh của thỏ đối với kháng nguyên 146S của từng chủng của bảy chủng huyết thanh virus FMD (cộng với virus SVD hay VS nếu cần) được sử dụng như là bẫy kháng thể ở một hàm lượng tối ưu đã định trong đệm carbonate/bicarbonate, pH 9,6.

Các kháng nguyên đối chứng đã được sửa soạn từ những dòng được chọn của từng chủng huyết thanh trong bảy chủng huyết thanh virus FMD (cộng với virus SVD hay virus VS nếu thích hợp), được nuôi cấy trong các tế bào đơn lớp BHK-21 (đối với các virus SVD hay VS dùng tế bào IB-RS-2). Các dịch phù nổi chưa tinh lọc được sử dụng và được chuẩn độ trên các phiến ELISA. Độ pha loãng tốt nhất là độ pha loãng mà cho ra hấp phụ ở vùng dải cao của đường biểu diễn hiệu giá (mật độ quang học khoảng 2,0), sao cho các độ pha loãng gấp năm lần của kháng nguyên đối chứng được sử dụng trong xét nghiệm cho ra thêm hai mật độ quang học thấp hơn với đường biểu diễn hiệu giá sẽ có được. PBS chứa 0,05% Tween 20 và chỉ thị màu đỏ phenol được sử dụng làm tác nhân pha loãng (PBST).

Kháng huyết thanh của chuột lang (guinea-pig) đã được chuẩn bị bằng cấy truyền vào chuột lang kháng nguyên 146S của một trong bảy chủng huyết thanh virus FMD (cộng với virus SVD nếu cần) và được đóng khối sẵn bằng huyết thanh bò bình thường (norman bovine serum – NBS), được sử dụng để phát hiện kháng thể. Hàm lượng tối ưu xác định trước được chuẩn bị trong PBS có chứa 0,05% Tween 20 và 5% sữa tách béo (nonfat skimmed milk) (PBSTM).

Globulin miễn dịch của kháng huyết thanh thỏ (hay cừu) kháng với huyết thanh của chuột lang, đã được kết hợp với enzyme peroxidase của cây cải ngựa (horseradish peroxidase) và đã được đóng khối sẵn với NBS, được sử dụng ở một hàm lượng tối ưu đã định trong PBSTM. Một thay thế cho kháng huyết thanh của chuột lang hay thỏ, là có thể dùng các kháng thể đơn giá (monoclonal antibodies – MAbs) thích hợp để tráng lên các phiến ELISA để bắt giữ kháng thể hay dùng kết hợp peroxidase (peroxidase-conjugated) để phát hiện kháng thể.

o Phương pháp xét nghiệm

1. 
   Các phiến ELISA được tráng mỗi giếng 50 µl khuyết thanh thỏ kháng virus trong đệm 0,05 M carbonate/bicarbonate, pH 9,6. Các hàng A đến H lần lượt cho vào các kháng huyết thanh với các chủng O, A, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3, Asia 1 và SVD virus hay VS virus (tùy chọn).
   
2. 
   Để qua đêm ở 4^oC trong nơi thuận lợi hay đặt vào máy lắc quay vòng (orbital shaker) ở tốc độ 100-200 vòng/phút trong buồng ủ 37^oC trong 1 giờ.
   
3. 
   Huyễn dịch mẫu xét nghiệm (với 10% huyễn dịch của mẫu hay dịch phù nổi không pha loãng của tế bào nuôi cấy đã qua lọc).
   
4. 
   Các phiến ELISA đã được rửa năm lần trong PBS.
   
5. 
   Trên từng phiến, cho vào các giếng của các cột 4, 8 và 12 mỗi giếng 50 µl PBST, thêm 50 µl PBST vào các giếng 1, 2 và 3 của các hàng từ A đến H của phiến. Ở giếng 1 của hàng A của phiến 1, thêm 12,5 µl kháng nguyên đối chứng type O, giếng 1 của hàng B thêm 12,5 µl kháng nguyên đối chứng type A; tiếp tục như vậy đối với các kháng nguyên đối chứng của các types C, SAT 1, SAT 2, SAT 3 và SVDV hay VS (nếu thích hợp) theo thứ tự từ giếng 1 của các hàng từ C đến H. Trộn hỗn hợp trong giếng 1 của hàng A đến H và chuyển 12,5 µl từ giếng 1 sang giếng 2 (từ hàng A đến hàng H), trộn và chuyển 12,5 µl từ giếng 2 sang giếng 3, trộn và bỏ đi 12,5 µl từ giếng 3 (từ hàng A đến hàng H) (điều này tạo nên một chuỗi độ pha loãng gấp 4 lần của từng kháng nguyên đối chứng). Ở đây chỉ cần thay các đầu hút của máy hút tự động (micropipette) giữa các lần hút kháng nguyên khác nhau. Phần còn lại của phiến sẽ được đổ vào các mẫu xét nghiệm. Thêm 50 µl của một mẫu vào các giếng 5, 6 và 7 của các hàng từ A đến H, mẫu thứ nhì thêm vào lượng tương đương vào các cột 9, 10 và 11, từ các hàng A đến H.
   

Chia 50 µl PBST vào các giếng (các hàng từ A đến H) của các cốt 1, 8 và 12 (các cột đệm đối chứng). Lưu ý rằng các kháng nguyên đối chứng không cần thiết trên những phiến này. Những mẫu xét nghiệm này có thể thêm vào với thể tích 50 µl trong các hàng từ A đến H lần lượt vào các cột 1, 2, 3; 5, 6, 7; 9, 10, 11.

6. 
   Đậy nắp và đặt phiến vào máy lắc quay vòng ở 37oC trong 1 giờ.
   
7. 
   Rửa các phiến bằng ngâm nhập vào PBS – rửa ba lần như nêu trên và trút kiệt dịch rửa còn dư. Thấm khô phiến.
   
8. 
   Chuyển 50 µl từng độ pha loãng của huyết thanh chuột lang vào từng giếng của phiến theo thứ tự, thí dụ lấy từ các hàng lần lượt A đến H kháng huyết thanh đối với các chủng huyết thanh O, A, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3, Asia 1 và SVD virus hay VS virus (tùy chọn).
   
9. 
   Đậy nắp các phiến và đặt trở vào máy lắc quay vòng. Ủ ở 37^oC trong 1 giờ.
   
10. 
    Các phiến này được rửa tiếp ba lần nữa, và 50 µl của globulin miễn dịch kháng chuột lang kết hợp với enzyme peroxidase của cây cải ngựa (horseradish peroxidase) được cho vào từng giếng. Các phiến này được ủ ở 37^oC trong 1 giờ trong máy lắc quay vòng.
    
11. 
    Các phiến này lại được rửa ba lần nữa và cho vào từng giếng 50 µl dung dịch chất nền, chứa 0,05% H₂O₂ cộng với orthophenylene diamine hay một chất màu thích hợp khác.
    
12. 
    Phản ứng được làm ngưng sau 15 phút bằng thêm vào 50 µl acid sulphuric 1,25 M. Các phiến này được đọc ở 492 nm trong một quan phổ kế được kết nối với máy vi tính.