Bµi 1: thùc nghiÖm vÒ protein vµ amino acid I. C¸c ph¶n øng mµu



tải về 77.99 Kb.
Chuyển đổi dữ liệu19.09.2016
Kích77.99 Kb.
Bµi 1: thùc nghiÖm vÒ protein vµ amino acid
I. C¸c ph¶n øng mµu

Ph©n tö protein cã mét sè ph¶n øng hãa häc ®Æc tr­ng nh­ ph¶n øng Biure, ph¶n øng Xanthoprotein, ph¶n øng Pauli, ph¶n øng Xacaguchi…Trong sè c¸c ph¶n øng kÓ trªn cã ph¶n øng dïng ®Ó ph¸t hiÖn sù cã mÆt cña liªn kÕt peptide, cã ph¶n øng dïng ®Ó ph¸t hiÖn c¸c acid amin chøa nh©n th¬m trong ph©n tö protein…ChÝnh nhê nh÷ng ph¶n øng ®ã mµ ng­êi ta cã thÓ ®Þnh tÝnh vµ ®Þnh l­îng protein trong dung dÞch.


1. Ph¶n øng Biure

a. Nguyªn lý

Trong m«i tr­êng kiÒm, c¸c chÊt cã liªn kÕt pepitide sÏ t¸c dông víi Cu2+ t¹o thµnh phøc chÊt cã mµu tÝm hång. C­êng ®é mµu cña ph¶n øng phô thuéc vµo l­îng Cu2+ vµ sè l­îng c¸c liªn kÕt peptide cã trong ph©n tö protein. Ph¶n øng nµy gièng nh­ phøc hîp 2 ph©n tö ure víi 1 ion Cu2+ nªn cã tªn lµ ph¶n øng Biure.

C¬ chÕ ph¶n øng



b. TiÕn hµnh

+ èng 1: cho vµo èng nghiÖm khoảng 0,1g ure. Đun trªn ngän löa ®Ìn cån đến khi ure nãng ch¶y; ®Ó nguéi sẽ ®­îc biure.

+ èng 2: 1 ml lßng tr¾ng trøng

+ èng 3: 1 ml dung dÞch gelatin 1%

+ èng 4: khoảng 1 ml s÷a t­¬i

Cho thªm vµo mçi èng 1 ml NaOH 10%, 1-2 giät CuSO4 1%.

L¾c ®Òu, quan s¸t, so s¸nh vµ gi¶i thích kÕt qu¶.

c. øng dông

- Ph¸t hiÖn protein trong vËt phÈm

- Trong m«i tr­êng kiÒm m¹nh, phøc hîp mµu ë d­íi d¹ng anion. Ph¶n øng nµy t¹o phøc hîp cã mµu bÒn, æn ®Þnh, ®­îc dïng ®Ó ®Þnh l­îng protein.
2. Ph¶n øng Xantoprotein

a. Nguyªn lý

C¸c protein cã chøa amino acid m¹ch vßng nh­: phenylanaline, tyrosine, tryptophan, vv… d­íi t¸c dông cña HNO3 ®Æc, nh©n th¬m cña c¸c amino acid bÞ g¾n nitro sÏ t¹o thµnh dÉn xuÊt nitro cã mµu vµng. NÕu gÆp m«i tr­êng kiÒm m¹nh th× dÉn xuÊt nµy sÏ t¹o thµnh muèi cã cÊu t¹o d¹ng quinoid cã mµu vµng da cam.

C¬ chÕ ph¶n øng:



b. TiÕn hµnh

Cho vµo 3 èng nghiÖm

- èng 1: 1 ml dung dÞch lòng trắng trứng

- èng 2: khoảng 1 ml sữa tươi

- èng 3: 1 ml dung dÞch gelatin 1%

Cho vµo 3 èng nghiÖm, mçi èng 1 ml HNO3 ®Æc , ®un trªn ngän löa ®Ìn cån, ®Õn khi xuÊt hiÖn mµu vµng. Sau khi đÓ nguéi, cho tõ tõ tõng giät NaOH 20% (kho¶ng 1-2 ml) cho ®Õn khi èng nghiÖm xuÊt hiÖn mµu vµng da cam.

NhËn xÐt vµ gi¶i thÝch kÕt qu¶.

c. øng dông

- Ph¸t hiÖn protein trong vËt phÈm

- KiÓm tra chÊt l­îng protein
II. C¸c ph¶n øng sa l¾ng protein

Protein hßa tan trong n­íc thµnh dung dÞch keo ­a n­íc. Trong dung dÞch c¸c tiÓu phÇn protein cïng lo¹i tÝch ®iÖn cïng dÊu, xung quanh tiÓu phÇn protein cã líp vá thñy hãa (ph©n tö l­ìng cùc liªn kÕt víi nhãm ph©n cùc nh­ – OH, - COOH, - NH2, ...). Nhê hai yÕu tè trªn, protein tån t¹i d­íi d¹ng dung dÞch keo bÒn v÷ng. Protein sÏ kÕt tña nÕu lµm mÊt hai yÕu tè hßa tan trªn nh­ sau :



- Lµm mÊt ®iÖn tÝch cña tiÓu phÇn protein b»ng c¸ch :

+ §­a pH cña dung dÞch protein vÒ pH ®¼ng ®iÖn (pHi) cña protein ®ã, khi pH cña dung dÞch b»ng víi pHi cña protein, ®a sè c¸c protein ë d¹ng l­ìng cùc, kh«ng mang ®iÖn tÝch.

+ Thªm chÊt ®iÖn gi¶i NaCl, (NH4)2SO4…c¸c ion nµy sÏ trung hßa ®iÖn tÝch cña tiÓu phÇn protein.

- Lµm mÊt líp vë thñy hãa b»ng c¸ch :

+ G©y biÕn tÝnh protein, cÊu tróc cña protein sÏ bÞ ®¶o lén b»ng c¸ch ®un s«i, thªm muèi kim lo¹i nÆng, thªm acid, base m¹nh vµ c¸c t¸c nh©n lý häc...

+ Thªm c¸c chÊt hót n­íc nh­ r­îu etylic, tanin…

Nh÷ng biÕn ®æi nµy ®­îc ph©n lµm 2 lo¹i:

+ BiÕn ®æi thuËn nghÞch: tøc lµ dung dÞch keo cã thÓ trë l¹i tr¹ng th¸i ban ®Çu sau khi khö t¸c nh©n ®i. Thuéc lo¹i biÕn ®æi nµy gåm cã c¸c ph¶n øng: ph¶n øng diªm tÝch, t¸c dông nhÑ cña cån, axeton ë nhiÖt ®é thÊp...

+ BiÕn ®æi kh«ng thuËn nghÞch: protein bÞ biÕn ®æi hoµn toµn, bÞ hñy ho¹i, mµ râ nhÊt lµ mÊt tÝnh hßa tan trong n­íc. Thuéc lo¹i biÕn ®æi nµy gåm: ph¶n øng g©y sa l¾ng bëi c¸c muèi kim lo¹i nÆng, ph¶n øng cña c¸c alkaloit, acid hoÆc kiÒm m¹nh, ®un s«i...


1. Ph¶n øng diªm tÝch (ph­¬ng ph¸p dïng muèi)

a. Nguyªn lý

Diªm tÝch lµ ph­¬ng ph¸p dïng c¸c muèi nh­: NaCl, (NH4)2SO4... ®Ó kÕt tña protein. Nguyªn nh©n kÕt tña lµ do c¸c tiÓu phÇn protein bÞ trung hßa ®iÖn tÝch. C¸c protein kh¸c nhau sÏ tña ë nh÷ng nång ®é muèi kh¸c nhau. V× vËy cã thÓ t¸ch riªng c¸c protein ra khái hçn hîp. VÝ dô globulin cã trong l­îng ph©n tö lín h¬n albumin, trong n­íc globulin tÝch ®iÖn (-) Ýt h¬n albumin, globulin bÞ kÕt tña ë nång ®é amoni sulfat b¸n b·o hßa, cßn albumin kÕt tña ë nång ®é b·o hßa. Sù kÕt tña nµy thuËn nghÞch, khi gi¶m nång ®é muèi b»ng c¸ch pha lo·ng víi n­íc hay thÈm tÝch th× globuline vµ albumine sÏ hßa tan trë l¹i.



b. TiÕn hµnh

- èng 1: lÊy 3 ml lßng tr¾ng trøng, 3 ml dung dÞch (NH­4)2SO4 b·o hßa l¾c ®Òu ta ®­îc dung dÞch b¸n b·o hßa, ë nång ®é nµy globulin bÞ sa l¾ng, ®Ó 5 phót, läc sang èng nghiÖm 2.

- èng 2: Cho vào ống 2 bét (NH­4)2SO4, vừa cho vừa lắc, ®Õn khi b·o hßa. Ở nång ®é sulfate amon bão hòa, albumin sẽ sa l¾ng. Để 5 phút. Lọc sang èng nghiÖm 3.

- èng 3: thu được sẽ mang thử bằng ph¶n øng biure.



c. øng dông

- KÕt tña b»ng c¸ch nµy c¸c protein kh«ng bÞ biÕn tÝnh nghÜa lµ c¸c tÝnh chÊt lý hãa, sinh vËt häc kh«ng bÞ thay ®æi. Ng­êi ta th­êng dïng ph­¬ng ph¸p nµy ®Ó chiÕt suÊt c¸c protein ho¹t tÝnh.


2. Sa l¾ng b»ng cån

a. Nguyªn lý

Protein bÞ kÕt tña b«ng hoÆc vÈn trong dung m«i h÷u c¬ nh­ : cån, aceton, eter,... Ph¶n øng tña do protein bÞ mÊt líp vá thñy hãa, tña cµng dÔ nÕu cã thªm c¸c chÊt ®iÖn gi¶i NaCl. KÕt tña b»ng cån cã thÓ lµ kÕt tña thuËn nghÞch nÕu tiÕn hµnh ë nhiÖt ®é thÊp (O0 ®Õn – 150C) vµ tña ®­îc t¸ch khái cån mét c¸ch nhanh chãng.



b. TiÕn hµnh

- èng 1 : 1 ml cån 96o

- èng 2: 1 ml cån 96o, thªm vµo 1-2 giät NaCl b·o hßa

Cho vµo mçi èng nghiÖm 1 ml dung dÞch lßng tr¾ng trøng.

- èng 3: 1ml cån 96o, 1ml dung dÞch gelatin 1%.

NhËn xÐt vµ gi¶i thÝch kÕt qu¶.



c. øng dông

- Dïng cån s¸t trïng khi tiªm hoÆc phÉu thuËt

- Dïng ®Ó t¸ch chiÕt enzyme
3. Sa l¾ng bëi nhiÖt ®é cao

a. Nguyªn lý

Protein khi ®un nãng sÏ bÞ x¸o trén vÒ mÆt ph©n tö, mÊt líp vá thñy hãa nªn mÊt tÝnh hßa tan vµ bÞ ®«ng vãn. HiÖn t­îng nµy x¶y ra m¹nh ë ®iÓm ®¼ng ®iÖn. NÕu sù biÕn tÝnh nµy x¶y ra ë pH kh¸c nhau (trong m«i tr­êng kiÒm m¹nh, hoÆc acid m¹nh), ph©n tö protein vÉn ë tr¹ng th¸i tÝch ®iÖn nªn kh«ng bÞ ®«ng vãn mµ ë d¹ng dung dÞch.



b. TiÕn hµnh

- LÊy 5 èng nghiÖm, cho vµo mçi èng 2 ml dung dÞch lßng tr¾ng trøng.

+ èng 1: ®un s«i vµ theo dâi sù kÕt tña dÇn dÇn protein.

+ èng 2: thªm 1 giät acetic acid 1% ®Ó t¹o ®iÓm ®¼ng ®iÖn, ®un s«i.

+ èng 3: thªm 0,5 ml acetic acid 10%, ®un s«i.

+ èng 4: thªm 0,5 ml NaOH 10%, ®un s«i.

+ èng 5: thªm 0,5 ml acetic acid 10%, 3-4 giät NaCl b·o hßa, ®un s«i.

NhËn xÐt vµ gi¶i thÝch kÕt qu¶.



c. øng dông

- Dïng nhiÖt ®é ®Ó hÊp, sÊy tiÖt trïng…c¸c dông cô.



Bµi 2: thùc nghiÖm vÒ enzyme
1. Thuû ph©n tinh bét bëi amylase

a. Nguyªn lý

Tinh bét lµ polysaccharide, gåm nhiÒu glucose liªn kÕt víi nhau bëi liªn kÕt  - 1,4 glycoside vµ -1,6 glycoside, v× vËy tinh bét kh«ng cã nhãm aldehyde tù do ®Ó thÓ hiÖn c¸c ph¶n øng ®Æc hiÖu cña nhiÒu lo¹i ®­êng ®¬n vµ ®­êng kÐp, nh­ ph¶n øng Tromer. Amylase cña n­íc bät cã kh¶ n¨ng c¾t c¸c m¹ch nèi vµ biÕn ®a ®­êng thµnh nh÷ng chÊt cã ph©n tö nhá h¬n (d¹ng dextrin) cho ®Õn d¹ng ®­êng kÐp maltose. N­íc bät cßn chøa mét Ýt mantase thuû ph©n maltose thµnh glucose. Nhê sù cã mÆt cña nhãm aldehyde tù do nªn glucose cho ph¶n øng tromer dương tính.




b. TiÕn hµnh

- Sóc miÖng b»ng n­íc cÊt. NgËm mét Ýt n­íc cÊt khoảng 1-3 phót, khÏ cö ®éng l­ìi ®Ó trén ®Òu n­íc bät víi n­íc cÊt, råi cho qua phÔu läc vµo èng nghiÖm  được dd chứa amylase.

- Nhá lªn phiÕn sø hai d·y dung dÞch lugol 1% : một dãy TN và 1 ĐC.

- LÊy hai èng nghiÖm

+ èng A: cho 3 ml tinh bét 1%, 2 ml dung dịch amylase (èng TN)

+ èng B: cho 3 ml tinh bét 1%, 2 ml n­íc cÊt (èng ĐC)

L¾c ®Òu hai ống, nhá vài giọt từ ống TN vào 1 lỗ ở dãy TN, vài giọt từ ống ĐC vào 1 lỗ ở dãy ĐC. Sau khoảng 2 phút lại nhỏ vào lỗ tiếp theo. Quan s¸t sù ®æi mµu vµ nhËn xÐt.

- PhÇn cßn l¹i cña 2 èng thö b»ng ph¶n øng Tromer. Nhận xét kÕt qu¶.


2. ¶nh h­ëng cña nhiÖt ®é

a. Nguyªn lý

PhÇn lín c¸c enzyme cã ho¹t lùc m¹nh ë th©n nhiÖt. NÕu nhiÖt ®é qu¸ thÊp th× enzym sÏ ho¹t ®éng rÊt yÕu, ngù¬c l¹i nÕu nhiÖt ®é cao th× enzyme sÏ bÞ tª liÖt vµ bÞ huû ho¹i.



b. TiÕn hµnh

LÊy 3 èng nghiÖm

+ èng 1: cho 1 ml dung dÞch amylase, ng©m vµo chËu n­íc ®¸ 15 phót.

+ èng 2: cho 1 ml dung dÞch amylase, ®un s«i , ®Ó nguéi

+ èng 3: cho 1 ml dung dÞch amylase

Sau ®ã cho mçi èng 1 ml dung dÞch tinh bét 1% l¾c ®Òu, ®Ó yªn trong 5-10 phót råi thö b»ng ph¶n øng Tromer hoặc dd lugol 1%. Quan s¸t mµu cña c¸c èng vµ gi¶i thÝch kÕt qu¶.


3. T¸c dông ®Æc hiÖu

a. Nguyªn lý

Amylase vµ sucrase lµ hai enzyme thñy ph©n liªn kÕt glycoside, nh­ng amylase chØ thñy ph©n liªn kÕt , 1-4 glycoside cña tinh bét, cßn sucrase chØ thñy ph©n liªn kÕt , 1-2 glycoside cña sucrose.



b. TiÕn hµnh

LÊy 4 èng nghiÖm

+ èng 1: cho 1 ml dung dÞch tinh bét 1%, 1 ml dung dÞch amylase

+ èng 2: cho 1 ml dung dÞch sucrose 1%, 1 ml dung dÞch amylase

+ èng 3: cho 1 ml dung dÞch sucrose 1%, 1 ml dung dÞch sucrase

+ èng 4: cho 1 ml dung dÞch tinh bét 1%, 1 ml dung dÞch sucrase

L¾c ®Òu råi thö b»ng ph¶n øng Tromer, quan s¸t mµu cña c¸c èng nghiÖm vµ gi¶i thÝch kÕt qu¶.
4. ¶nh h­ëng cña pH

a. Nguyªn lý

V× cã bản chất protein, nªn enzyme rÊt mÉn c¶m víi pH cña m«i tr­êng. Mçi lo¹i enzyme cã mét pH tèi ­u trong ho¹t ®éng cña mình, vÝ dô pepsin cã ho¹t lùc m¹nh ë pH 1,5-2,5. pH m«i tr­êng cµng gÇn pH tèi ­u, tèc ®é ph¶n øng cµng cao, nghÜa lµ enzyme ho¹t ®éng cµng m¹nh. Do ®ã sù thay ®æi pH dï nhá còng ¶nh h­ëng ®Õn ho¹t ®é cña enzyme, do ¶nh h­ëng ®Õn tr¹ng th¸i ion hãa cña enzyme.



b. C¸ch tiÕn hµnh

LÊy thËt chÝnh x¸c vµo c¸c èng nghiÖm ®¸nh sè tõ 1- 8 theo chØ dÉn d­íi ®©y:




Sè èng

pH (ml)

1

2

3

4

5

6

7

8

5,4

1






















5,8




1



















6,2







1
















6,6










1













6,8













1










7,2
















1







7,6



















1




8






















1

Tinh bét 1%

1 ml

1ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Amylase

0,5ml

0,5ml

0,5ml

0,5ml

0,5ml

0,5ml

0,5ml

0,5ml

L¾c ®Òu, ®Ó 10 phót råi thö b»ng ph¶n øng Tromer hoặc dung dịch Lugol 1% cho biÕt kÕt qu¶ vµ nhËn xÐt.








Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương