BỘ NÔng nghiệp và phát triển nông thôN 10tcn tiêu chuẩn ngàNH



tải về 51.81 Kb.
Chuyển đổi dữ liệu15.08.2016
Kích51.81 Kb.



BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

__________________

10TCN TIÊU CHUẨN NGÀNH

10 TCN 739-2006



SỮA TƯƠI-XÁC ĐỊNH TETRACYCLINE

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Hà Nội - 2006




TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 739-2006



SỮA TƯƠI-XÁC ĐỊNH TETRACYCLINE

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

(freshmilk - determination of Tetracycline)
(Ban hành kèm theo Quyết định số QĐ/BNN-KHCN

ngày tháng 6 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn)



1.Đối tượng và phạm vi áp dụng
Qui trình này áp dụng để xác định dư lượng Tetracycline trong sữa tươi.

Giới hạn phát hiện của phương pháp là: 50g/l.


2.Giải thích thuật ngữ
Dư lượng Tetracycline trong sữa tươi: Lượng Tetracycline còn tồn dư trong sữa tươi chưa biến đổi thành dạng khác.
3. Nguyên tắc

Tetracycline được chiết ra từ mẫu bằng dung môi thích hợp, sau đó được làm sạch và đưa vào phân tích sắc ký. Tetracycline được tách ra trên pha tĩnh của cột C18 và được phát hiện bởi detector UV- Vis.


4. Hoá chất và thuốc thử
Hoá chất và thuốc thử phải đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho sắc ký.

4.1. Acetonitrile;

4.2. Methanol;

4.3. Dung dịch axit trichloroacetic 1g/ml trong nước ;

4.4. Dung dịch axít oxalic 0,01M nước cất; lọc bằng phễu với màng lọc kích thước lỗ 0,45 m bằng chân không (5.20);

4.5. Dung dịch axit oxalic 0,01M trong methanol ;

4.6. Dung dịch axít citric 0.1M trong nước ;

4.7. Dung dịch disodium photphat 0.2M trong nước ;

4.8. Disodium Ethylene Diamine Tetraacetate Dihydrat (EDTA);

4.9. Dung dịch đệm Mc livaine: trộn đều 1l dung dịch axít citric (4.6) với 625 ml dung dịch disodium photphat (4.7), chỉnh pH 40,05;

4.10. Dung dịch đệm Mc livaine/EDTA: hoà tan 60,5g EDTA (4.8) trong 1,625 l dung dịch đệm Mc livaine (4.9);

4.11. Dumg môi pha động: Acetonitrile (4.1) và dung dịch axít oxalic 0,01M (4.4);

4.12. Chuẩn Tetracycline.

5. Thiết bị, dụng cụ:
5.1. Ống ly tâm polypropylene, 50ml có nắp;

5.2. Ống thuỷ tinh 30ml, có nắp;

5.3. Ống polypropylen 5ml, có nắp;

5.4. Bình định mức 25; 50; 100; 200; 1000 ml;

5.5. Pipet thuỷ tinh 2; 5; 20; 25ml;

5.6. Pipet tự động 100l; 250l; 1ml;

5.7. Máy ly tâm tốc độ cao 20.000vòng/phút;

5.8. Cân phân tích 100mg – 2000g;

5.9. Cân phân tích kỹ thuật 10mg – 210g có độ chính xác đến 0,1mg;

5.10. Hút dung môi tự động 5ml; 25ml; 50ml;

5.11. Máy đo pH có độ chính xác đến 0,01;

5.12. Máy lắc vortex 700vòng/phút;

5.13. Máy lắc quay tròn;

5.14. Máy khuấy từ;

5.15. Máy ly tâm lạnh 6000vòng/phút 40C;

5.16. Cột chiết pha rắn Bond-Elut C18, 3cc, 500mg;

5.17. Bộ chiết pha rắn Manifold (supelco), adaptor, kim;

5.18. Bơm chân không 0,4 bar, 12w;

5.19. Phễu lọc đường kính 25mm, thể tích 50ml;

5.20. Gía đỡ phễu lọc và màng lọc kích thước lỗ 0,45m;

5.21. Hệ thống máy sắc kí lỏng HPLC:

- Bơm 2 kênh dung môi gradient;

- Detector UV- Vis;

- Máy tính và phần mềm phân tích;

- Cột phân tích RP C18, 25 cm x 4,6 mm, 5m.
6. Lấy mẫu và bảo quản mẫu:
- Lấy mẫu theo TCVN 5531:1991

- Mẫu được bảo quản ở –200C. Mẫu phải được giải đông trước khi phân tích


7. Cách tiến hành

Phải tiến hành phân tích đồng thời mẫu âm tính, mẫu dương tính và mẫu phân tích



7.1 Chiết tách:
Chiết mẫu: Lấy 5ml mẫu đã được giải đông cho vào ống ly tâm (5.1). Cho vào đó 25 ml dung dịch đệm Mc Ivaine/ EDTA (4.10), lắc 30 giây bằng máy lắc vortex (5.12). Lắc 15 phút bằng máy lắc quay tròn (5.13) ở tốc độ 100 vòng/phút. Ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 40C bằng máy ly tâm lạnh (5.15).
Kết tủa protein: Chuyển phần lỏng vào ống thuỷ tinh 30 ml (5.2); đặt ống vào cốc phòng thí nghiệm và đưa lên máy khuấy từ (5.14). Cho từ từ 2,5 ml dung dịch axit tricloroacetic 1g/ml (4.3) vào và khuấy đều. Sau đó khuấy nhanh hơn trong 1 phút. Nhấc ống ra khỏi máy quấy từ. Ly tâm 5 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút.
7.2. Làm sạch:
Hoạt hoá cột chiết pha rắn Bond Elut (5.16) bằng 1ml methanol, 1ml nước và cuối cùng là 1ml nước đệm Mc livaine (4.9);
Nối phễu lọc (5.19) với cột, bộ chiết pha rắn (5.17) và bơm chân không (5.18);

Chuyển dung dịch mẫu lên phễu lọc (5.19) để mẫu được lọc bằng bơm chân không (5.18). Điều chỉnh tốc độ lọc không quá 2 giọt/giây. Không để cột bị khô trong bước này;


Bỏ phễu và rửa cột bằng 1ml nước cất;

Làm khô cột trong 5 phút bằng bơm chân không;


Rửa giải cột lần lượt bằng 1ml dung dịch axit oxalic 0,01M trong methanol (4.5), tiếp theo là 1 ml nước cất vào ống polypropylen (5.3). Ly tâm 3 phút với tốc độ 20.000 vòng/phút ở 4oC bằng máy ly tâm tốc độ cao (5.21) trước khi bơm mẫu lên hệ thống máy HPLC (5.22);
7.3 Xây dựng đường chuẩn:
Dung dịch chuẩn gốc 1 mg/ml: Pha chuẩn có nồng độ 1mg/ml trong methanol. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở -20oC trong 1 tháng.
Dung dịch chuẩn dùng để phân tích mẫu:

-Dung dịch chuẩn trung gian 50 g/ml: Pha loãng dung dịch chuẩn gốc nồng độ 1mg/ml trong methanol để được dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ 50g/ml. Bảo quản ở 40C trong 1 tuần;

-Dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 0,125; 0,25; 0,5 và 1g/ml: Pha loãng dung dịch chuẩn trung gian 50g/ml bằng dung dịch axit oxalic 0,01M (axit oxalic 0,01M pha trong methanol/nước theo tỷ lệ 30/70) để có dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0,125; 0,25; 0,5 và 1g/ml. Những dung dịch chuẩn này được pha và sử dụng hàng ngày.
7.4 Phân tích sắc kí:
Điều kiện chạy máy:

Pha động

Thời gian



Acetonitrile (4.1) (%)

Dung dịch axit oxalic 0,01M (4.4) (%)

0 phút

13

87

15 phút

36

64

Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút;

Bước sóng: 355 nm;

8. Tính toán và biểu thị kết quả
8.1Xử lý kết quả thu được: Dựa vào thời gian lưu (độ lệch 5% ) và chiều cao (diên tích) của pic chuẩn và pic mẫu để xác định và tính kết quả.
8.2Kết quả được tính theo phương pháp đường chuẩn trong đó đường chuẩn được xây dựng từ kết quả thu được của các dung dịch chuẩn làm việc. Phương trình đường chuẩn:



Trong đó: y là diện tích pic

x là nồng độ (ng/ml)

a là hệ số góc

b là hằng số
Hàm lượng của Tetracycline trong mẫu được tính bằng phương trình đường chuẩn và độ thu hồi theo công thức:


Trong đó: Ca: Nồng độ Tetracycline trong mẫu phân tích

Cf: Nồng độ cuối cùng của mẫu đối chứng

R: Độ thu hồi

F: Hệ số nồng độ
8..3 Độ thu hồi: Độ thu hồi được xác định từ mẫu đối chứng, xác định bằng phương pháp đường chuẩn theo công thức:

Trong đó: Cf: nồng độ cuối cùng của mẫu đối chứng

Yt: diện tích pic mẫu đối chứng

a: hệ số góc

b: hằng số

Độ thu hồi được xác định như sau:





Trong đó: R: Độ thu hồi

Cf: Nồng độ cuối cùng của mẫu đối chứng được xác định như trên

Ct: Nồng độ thực (nồng độ chuẩn cho vào mẫu trắng )

F: Hệ số nồng độ.
Kiểm tra lại kết quả phân tích: Kết quả được chấp nhận nếu độ thu hồi đạt được giới hạn sau:



Trong đó: R: Độ thu hồi

Rm: Độ thu hồi trung bình

SD: Độ lệch chuẩn của độ thu hồi trung bình.
8.3 Biểu thị kết quả: mg/l đến 3 chữ số sau dấu phẩy.
9. Tài liệu tham khảo:
Dtermination of Tetracyclines residues in kidney and muscle by HPLC

AFSSA- Fougères (pháp).

Dtermination of Tetracycline residues in milk by HPLC

AFSSA- Fougères (pháp).

Chlortetracycline, Oxytetracycline and Tetracycline in Edible Animal Tissues.

AOAC Offical Method 995.09.



KT. BỘ TRƯỞNG

THỨ TRƯỞNG

Bùi Bá Bổng







Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương