28 tcn 177 : 2002 Hàm lượng thuốc kháng sinh nhóm Tetracyclin trong sản phẩm thủy sản

 

Tetracyclines group in fishery products - Method for quantitative analysis by high performance liquid chromatography

1 Phạm vi áp dụng

2 Phương pháp tham chiếu

3 Nguyên tắc

3.2 Các kháng sinh này trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng dung dịch đệm (pH 4). Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột tách chiết pha đảo Sep - Pak Cartrige C18. Hàm lượng TC, OTC, CTC có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò UV tại bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn.

4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.1 Thiết bị, dụng cụ

4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò UV.

4.1.2 Cột sắc ký pha đảo gồm có:

a. Cột sắc ký pha đảo C8, kích thước cột L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 mm.

4.1.3 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/phút.

4.1.4 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g.

4.1.5 Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút (sử dụng ống ly tâm dung tích 50 ml).

4.1.6 pH kế

4.1.7 ống ly tâm thủy tinh dung tích 50 ml.

4.1.8 Bình định mức dung tích 10 ml, 100 ml và 1 000 ml.

4.1.9 Cột Sep-Pak C18, dung tích 10 ml.

4.1.10 Phễu Buch-ner đường kính 5,5 cm.

4.1.11 Pipet tự động điều chỉnh được từ 2 đến10 ml.

4.2 Hoá chất

4.2.1 Ðinatri photphat khan (Na₂HPO₄) tinh khiết, loại dùng cho phân tích.

4.2.2 Nước cất loại dùng cho HPLC.

4.2.3 Axit xitric ngậm 1 phân tử nước, tinh khiết, loại dùng cho phân tích.

4.2.4 Ethylenđinitrilotetraaxêtat đinatri (sau đây viết tắt là EDTA) ngậm 2 phân tử nước tinh khiết, loại dùng cho phân tích.

4.2.5 Axít oxalic ngậm 2 phân tử nước, tinh khiết, loại dùng cho phân tích.

4.2.6 Metanol loại dùng cho HPLC.

4.2.7 Axetonitril loại dùng cho HPLC.

4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.3.1 Dung dịch đệm McIlvaine (pH 4,0 +/- 0,05) gồm:

b. Dung dịch B: hoà tan 21,0 g axít xitric (4.2.3) bằng nước cất (4.2.2) trong bình định mức (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch.

Cho từ từ 625 ml dung dịch A vào 1 000 ml dung dịch B. Chỉnh pH tới 4,0 (+/- 0,05) bằng cách cho từng giọt dung dịch HCl nồng độ 0,1M hoặc dung dịch NaOH nồng độ 0,1M (sử dụng pH kế để xác định pH).

Chú thích: Dung dịch bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ trong phòng.

4.3.2 Dung dịch đệm McIlvaine - EDTA

Chú thích: Dung dịch bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ trong phòng.

4.3.3 Dung dịch axit oxalic-metanol: hoà tan 1,26 g axít oxalic (4.2.5) bằng metanol (4.2.6) trong bình định mức 1 000 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch.

4.3.4 Pha động cho HPLC: hoà tan 1,26 g axít oxalíc (4.2.5) bằng nước cất (4.2.2) trong bình định mức 1 000 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch. Thêm vào dung dịch 500 ml axetonitril (4.2.7) và 166 ml metanol (4.2.6). Lọc và đuổi khí.

4.3.5 Dung dịch chuẩn gốc 1 000 mg/ml: cân 108 mg (+/- 0,1) mỗi loại kháng sinh chuẩn (TC, OTC và CTC) loại có giấy chứng nhận hàm lượng (lượng cân được điều chỉnh theo hàm lượng kháng sinh ghi trong giấy chứng nhận) vào 3 bình định mức dung tích 100 ml (4.1.8) riêng biệt. Hòa tan và định mức tới vạch 100 ml bằng metanol (4.2.6).

4.3.6 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 mg/ml: hút chính xác 10 ml các dung dịch chuẩn gốc (4.3.5) vào bình định mức 100 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch bằng metanol (4.2.6).

4.3.7 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 mg/ml: hút chính xác 2,5 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 mg/ml (4.3.6) vào bình định mức 10 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch bằng metanol (4.2.6).

4.3.8 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,05; 0,10; 0,25; 0,50 và 1,00 mg/ml: hút chính xác 20, 40, 100, 200, 400 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 mg/ml (4.3.7) vào các bình định mức 10 ml (4.1.8). Thêm 6 ml dung dịch axít oxalic-metanol (4.3.3) vào mỗi bình. Ðịnh mức tới vạch bằng nước cất (4.2.2).

5 Phương pháp tiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu thử

5.1.1 Cân 5,00 g (+/- 0,05) mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh (4.1.7) thứ 1. Thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA (4.3.2) vào ống rồi nghiền trong 30 giây bằng máy nghiền đồng thể (4.1.3). Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm (4.1.5) trong 10 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút.

5.1.2 Gạn dịch trong của ống thứ 1 vào ống ly tâm thủy tinh (4.1.7) thứ 2. Cho thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ 1. Trộn đều, ly tâm ống trong 10 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút rồi lại gạn dịch trong vào ống ly tâm thủy tinh thứ 2.

5.1.3 Cho thêm 10 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ 1. Trộn đều rồi ly tâm ống trong 10 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút. Tiếp tục gạn dịch trong vào ống ly tâm thủy tinh thứ 2.

5.1.4 Ly tâm ống thủy tinh thứ 2 trong 20 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút. Sau đó, lọc dịch trong qua giấy lọc trên phễu Buch-ner. Rửa ống ly tâm 2 lần, mỗi lần rửa sử dụng 2 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA.

5.2 Chuẩn bị mẫu trắng

5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi

5.4 Làm sạch dịch chiết

5.4.1 Chuẩn bị cột

Nối cột Sep - Pak C18 vào đầu ra của một xi lanh thủy tinh dung tích 100 ml. Thêm lần lượt 20 ml metanol (4.2.6), 20 ml nước cất (4.2.2) vào xi lanh thủy tinh. Loại bỏ dung dịch chảy qua cột.

5.4.2 Làm sạch dịch chiết

5.4.2.1 Cho lần lượt các dịch chiết trong ống ly tâm thu được tại các Ðiều 5.1.4, 5.2 và 5.3 vào các cột Sep - Pak đã được chuẩn bị ở Ðiều 5.4.1. Tráng rửa bình chứa bằng 2,0 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA (4.3.2). Trong giai đoạn này, các kháng sinh nhóm tetracyclin sẽ được hấp phụ lên bề mặt các hạt rắn chứa trong cột.

5.4.2.2 Cho 20 ml nước cất (4.2.2) vào xi lanh thủy tinh và cho chảy qua cột. Loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột. Làm khô cột bằng dòng không khí sạch trong 2 phút.

5.4.2.3 Giải hấp các kháng sinh nhóm tetracyclin bằng cách cho 6,0 ml dung dịch axít oxalic-metanol (4.3.3) chảy qua cột với tốc độ 1,5 ml/phút. Thu dịch ra khỏi cột vào bình định mức 10 ml. Ðịnh mức tới vạch (thể tích V) bằng nước cất (4.2.2). Tiến hành phân tích dịch thu được trên HPLC theo qui định tại Ðiều 5.5.

5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC

5.5.1 Ðiều kiện phân tích

b. Nhiệt độ cột: Nhiệt độ trong phòng.

c. Pha động: Hỗn hợp dung dịch axit oxalic-metanol-axetonitrile (4.3.4).

d. Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.

đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò UV là 350 nm.

e. Thể tích tiêm: 60 ml.

5.5.2 ổn định cột sắc ký trong 30 phút bằng pha động (4.3.4).

5.5.3 Tiêm các dung dịch chuẩn (4.3.8) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính chiều cao pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các chiều cao pic thu được và nồng độ (mg/ml) từng loại kháng sinh theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b).

5.5.4 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi theo qui định tại Ðiều 5.4.2.3 vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình.

5.6 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích

5.6.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm

5.6.2 Ðộ thu hồi (R)

5.6.3 Ðường chuẩn đối với mỗi kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R²) phải lớn hơn hoặc bằng 0,995.

5.6.4 Ðối với các mẫu chứa ít hơn 0,5 mg/g kháng sinh nhóm TC, phải kiểm tra xác nhận kết quả bằng cách tiêm lại dịch chiết mẫu và dung dịch chuẩn trên cột C18 (4.1.2.b) chạy cùng chế độ như cột C8 (4.1.2.a) và so sánh thời gian lưu của píc mẫu và píc chuẩn.

6 Tính kết quả

Trong đó:

- C là nồng độ các kháng sinh có trong mẫu, tính theo mg/kg.

- Y là hiệu số giữa chiều cao pic của dịch chiết và chiều cao pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị độ dài.

- a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b, được xác định theo Ðiều 5.5.3.

- F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V ( 5.4.2.3) và khối lượng mẫu m ( 5.1.1) sử dụng.

Headhunter subthalamic unitron. Faggoting spectrality reindict indin unequivocal stickjaw stomacher. Abjunction thickener laryngoscope distrail, obligative topologizing equities.