10tcn tiêu chuẩn ngành 10 tcn 728-2006 quy trình chẩN ĐOÁn bệnh tụ huyết trùNG



tải về 208.09 Kb.
Chuyển đổi dữ liệu19.11.2017
Kích208.09 Kb.
#34410

10 TCN 728 – 2006


BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

__________________

10TCN TIÊU CHUẨN NGÀNH
10 TCN 728-2006
QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG

Hà Nội - 2006

TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 728 – 2006


QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG
(Ban hành kèm theo Quyết định số QĐ/BNN-KHCN

ngày tháng 5 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn)



1. Phạm vi áp dụng

Quy trình áp dụng cho các cán bộ thú y để chẩn đoán bệnh Tụ huyết trùng (Pasteurellosis) do vi khuẩn Pasteurella multocida (P. multocida) gây ra trên trâu, bò, lợn và gia cầm.



2. Khái niệm

Bệnh tụ huyết trùng (Pasteurellosis) là bệnh truyền nhiễm do cầu trực khuẩn Gram âm P. multocida gây ra trên vật nuôi và một số động vật hoang dã.

Trên trâu, bò: Bệnh thường gặp ở thể nhiễm trùng máu, xuất huyết (Haemorragic Septicaemiae-HS) với đặc điểm đặc trưng trâu bò chết nhanh, tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ chết cao. ở các nước châu á bệnh do P. multocida serotyp B:2 (theo hệ thống phân loại của Carter và Heddleston) gây ra.

Trên lợn: bệnh do P. multocida serotyp A, B và D gây ra và P. multocida tác động chủ yếu tới bộ máy hô hấp. Serotyp B gây bệnh trầm trọng hơn và chỉ thấy ở các nước Đông nam châu á, Trung quốc và ấn độ. Bệnh thường ghép với bệnh dịch tả lợn, phó thương hàn hoặc với bệnh viêm phổi truyền nhiễm.

Trên gia cầm (gà, vịt, ngan, chim cút): Bệnh thường thể hiện ở thể nhiễm trùng huyết với tỷ lệ nhiễm bệnh và tỷ lệ chết cao nhưng cũng có nhiều trường hợp mắc bệnh ở thể mạn tính.
3. Máy móc - dụng cụ - môi trư­ờng - hoá chất - nguyên liệu

3.1. Máy móc và Dụng cụ



  • Tủ lạnh thường

  • Tủ ấm 370C

  • Tủ sấy khô

  • Lò vi sóng

  • Nồi hấp ư­ớt (Autoclave)

  • Cân điện

  • Kính hiển vi

  • Buồng cấy

  • Bộ đồ mổ đại gia súc

  • Dụng cụ thuỷ tinh: Bình tam giác, ống đong, chai thuỷ tinh, đĩa lồng, ống nghiệm, pipet các loại, lam kính.....

  • Các dụng cụ khác: nhiệt kế 430C, cối chày sứ, kéo, dao cắt, que cấy, đèn cồn, bút viết kính, bông thấm nước, bông không thấm nước, khăn bông hoặc giấy thấm mềm, bút đo pH, khay nhựa 96 lỗ tròn.

3.2. Hoá chất

  • Cồn Ethylic

  • Xylen

  • Thuốc thử Kovacs (phụ lục 4)

  • Natri hydroxyt

  • Natri bicarbonat

  • Nước cất

  • Dung dịch KOH

  • Dầu soi kính

  • PBS

  • Glutaraldehyt

  • Bộ thuốc nhuộm gram (phụ lục 1)

  • Bộ thuốc nhuộm gemsa (phụ lục 2)

3.3. Môi trường

  • Thạch máu cơ bản (Blood agar base)

  • Thạch MacConkey

  • Nước thịt (Brain heart Infusion) BHI

  • Môi trường thạch nghiêng Kligler hay thạch TSI

  • Nước pepton

  • Thạch urê

3.4. Nguyên liệu

  • Máu bò, bê, cừu

  • Chuột bạch hoặc thỏ

  • Huyết thanh tối miễn dịch đặc hiệu của các chủng vi khuẩn tụ huyết trùng.

  • Hồng cầu cừu


4. Phương pháp chẩn đoán

Dựa vào đặc điểm bệnh sử, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và xét nghiệm vi khuẩn học trong phòng thí nghiệm để xác định bệnh.

Sơ đồ chẩn đoán bệnh (trang sau)

Sơ đồ chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng

KiÓm tra l©m sµng

Xem bÖnh sö

BÖnh phÈm



Mæ kh¸m

Tiªm truyÒn ®éng vËt thÝ nghiÖm

KiÓm tra b»ng kÝnh hiÓn vi

Ph©n lËp, gi¸m ®Þnh sinh ho¸

KiÓm tra ®éc lùc trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm

Týp huyÕt thanh


KÕt luËn

4.1. Đặc điểm dịch tễ


  • Động vật cảm nhiễm: trâu bò, lợn và gia cầm mọi lứa tuổi đều có thể nhiễm bệnh tuy nhiên động vật non mẫn cảm với bệnh hơn động vật già.

  • Bệnh có tính chất lây lan cục bộ địa phương, từng vùng nhất định và lây lan chủ yếu qua đường hô hấp.

  • Bệnh thường phát khi có stress như: sự thay đổi về khí hậu đột ngột, do điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng kém hoặc do vận chuyển động vật.

4.2. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích

4.2.1 Trên trâu, bò



  • Triệu chứng lâm sàng: thường gặp ở thể quá cấp tính và thể cấp tính vật chết nhanh từ vài giờ đến hai ngày từ khi xuất hiện những triệu chứng lâm sàng như sau:

  • Vật sốt, khó thở, có khi ho khan.

  • Vật chảy n­ước dãi, chảy n­ước mũi nhiều.

  • Phù ở vùng cổ có thể lan xuống yếm và lên quanh đầu.

  • Có triệu chứng thần kinh: hung dữ, điên cuồng.

  • Có con có hiện tượng bụng ch­ướng to.
  • Bệnh tích


  • Tổ chức liên kết dưới da xuất huyết lấm tấm.

  • Bắp thịt và niêm mạc xuất huyết màu hồng tím.

  • Hạch lâm ba xuất huyết lấm tấm.

  • Khi bệnh khu trú ở hạch lâm ba: Hạch viêm, thuỷ thũng vùng xung quanh có khi lan tràn ra cả một vùng.

  • Khi bệnh khu trú ở ngực: xoang ngực, xoang bao tim chứa nước vàng. Phổi viêm.

  • Khi bệnh khu trú ở bụng xuất hiện viêm phúc mạc, có chứa nước vàng và xuất huyết ở hạch ruột, phủ tạng.

Trong các trường hợp bệnh quá cấp tính thường không thể hiện bệnh tích điển hình.

4.2.2. Trên lợn



  • Triệu chứng lâm sàng

  • Thể cấp tính

  • Lợn ủ rũ, ăn ít hoặc bỏ ăn, sốt.

  • Con vật thở khó: có tiếng khò khè ướt trong phế quản, chảy nước mũi đặc, nhờn, đục, có khi có mủ.

  • Mặt sưng, hầu sưng, thuỷ thũng lan rộng xuống cổ

  • Trên da nổi những chấm đỏ hoặc từng đám tím bầm ở vùng bụng, tai, bẹn.

  • Bệnh tiến triển từ một ngày đến vài ngày. Tỷ lệ chết có thể đến 80%. Nếu con vật qua được thì bệnh chuyển sang thể mạn tính.

  • Thể mạn tính

  • Vật thở khó, ho nhiều.

  • Ỉa chảy

  • Da đỏ từng mảng, bong vảy.

  • Niêm mạc miệng đóng màng giả.

  • Bệnh tiến triển từ 3 tuần đến 6 tuần. Vật gầy yếu dần rồi chết.

  • Bệnh tích

  • Thể cấp tính

  • Viêm phổi thuỳ: tụ máu từng đám, có nhiều vùng gan hoá ở các thời điểm khác nhau, thẩm tương dịch đỏ nhạt, khi cắt thấy có vân.

  • Khí quản, phế quản có bọt khí lẫn máu.

  • Hạch phổi tụ huyết

  • Ngoại tâm mạc viêm, có nước ngoại xuất và có khi lầy nhầy.

  • Thể mạn tính

  • Phổi viêm có vùng gan hoá, hoại tử màu vàng xám.

  • Màng phổi dày dính vào lồng ngực

  • Phế quản viêm

4.2.3. Trên gia cầm

  • Triệu chứng lâm sàng

  • Thể qúa cấp tính: triệu chứng lâm sàng không rõ, chỉ thấy một số lượng lớn gia cầm khỏe mạnh bị chết đột ngột.

  • Thể cấp tính: Gia cầm bệnh ủ rũ, bỏ ăn, chảy dịch nhầy từ miệng, ỉa chảy: phân màu sôcôla. Vật khó thở, tím tái và vật chết do ngạt thở.

  • Thể mãn tính: Viêm cục bộ: Mào, tích sưng, các khớp xương sưng to, viêm kết mạc mắt. Vật khó thở và có khi ngoẹo cổ.

Thực tế rất khó có thể đưa ra được những đặc điểm đặc trưng của thể bệnh cấp tính và mãn tính riêng rẽ vì triệu chứng thường thể hiện xen lẫn, trung gian giữa hai thể bệnh.

  • Bệnh tích

  • Thể qúa cấp tính: Bệnh tích không rõ ràng

  • Thể cấp tính: xác chết xung huyết nặng. Có nhiều điểm lấm tấm xuất huyết ở phủ tạng. Gan sưng và có những điểm hoại tử nhỏ màu trắng nằm rải rác.

  • Thể mãn tính: bệnh tích thường mang tính chất cục bộ. Có các ổ mủ nằm rải rác trong cơ thể. Phù phổi và viêm phổi. Viêm khớp cổ chân và bàn chân hay khớp xương cánh chứa nhiều dịch màu xám đục hoặc có bã đậu. Sưng ở tích.

4.3. Chẩn đoán phòng thí nghiệm

4.3.1.Lấy mẫu



  • Dụng cụ lấy mẫu: lọ thuỷ tinh, bình tam giác hoặc túi nilon vô trùng

  • Mẫu bệnh phẩm

+ Bệnh phẩm lấy sau khi gia súc, gia cầm chết càng nhanh càng tốt và phải được lấy vô trùng. Bệnh phẩm là máu tim, dịch xoang bao tim, phổi của động vật chết nghi mắc bệnh. Mỗi loại bệnh phẩm cho vào từng lọ hay túi nilon vô trùng riêng biệt đậy kín. Nếu con vật chết đã lâu, lấy mẫu bệnh phẩm là xương ống.

+ Tất cả các loại bệnh phẩm phải được đưa ngay vào phòng thí nghiệm không quá 1giờ. Nếu phòng thí nghiệm ở xa, phải bảo quản trong điều kiện lạnh từ 20C đến 80C và gửi về phòng xét nghiệm chậm nhất 24 gìơ sau khi lấy mẫu.

+ Bệnh phẩm phải được gửi kèm theo một phiếu xin xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích và những thông tin về dịch tễ.

4.3.2. Kiểm tra trực tiếp vi khuẩn từ bệnh phẩm qua kính hiển vi

4.3.2.1. Phết kính và nhuộm tiêu bản

- Từ tổ chức: cắt một miếng nhỏ phủ tạng (gan, lách, phổi) phết lên phiến kính sạch, để khô.

- Từ máu: lấy một giọt máu nhỏ lên phiến kính sạch sau đó dàn mỏng đều bằng phiến kính khác, để khô.

Cố định tiêu bản: tiêu bản đã để khô, nhỏ cồn cố định (cồn Methanol) ngập tiêu bản, để khô rồi nhuộm Giemsa hay Gram (xem phụ lục1, 2)


4.3.2.2. Hình thái vi khuẩn

Tiêu bản sau khi được nhuộm, để khô, xem trên kính hiển vi bằng vật kính dầu 100 X.

Nhuộm gram: vi khuẩn Pasteurella bắt màu hồng (màu của vi khuẩn gram âm), lưỡng cực (hai đầu đậm hơn), có dạng cầu trực khuẩn hoặc đa hình thái: hình bầu dục, hình chấm tròn hoặc hình que.Vi khuẩn đứng rải rác từng con hoặc từng đám, không thành chuỗi.

Vi khuẩn không có nha bào, lông, có giáp mô thành vòng sáng xung quanh vi khuẩn.

Nhuộm Giemsa: Vi khuẩn bắt màu tím, lưỡng cực.

4.3.3. Tiêm truyền động vật thí nghiệm

Động vật thí nghiệm là chuột bạch, hoặc thỏ và đóng vai trò như một “màng lọc sinh học” lọc các vi khuẩn tạp nhiễm trong bệnh phẩm.

Máu, tuỷ xương hoặc phủ tạng đã được nghiền nát, hoà với nước muối sinh lý 0,9% theo tỷ lệ 1/10, tiêm cho chuột bạch (0,1ml đến 0,2ml), thỏ (1ml đến 2ml) vào dưới da, xoang phúc mạc hoặc tĩnh mạch. Nếu P. multocida còn sống sẽ làm chết trong vòng 24 giờ đến 36 giờ. Lấy máu tim và phủ tạng phết tiêu bản kiểm tra trực tiếp trên kính hiển vi và tiến hành phân lập giám định vi khuẩn.

4.3.4. Nuôi cấy phân lập vi khuẩn

Bệnh phẩm được cấy vào môi trường thạch máu, nước thịt, thạch Maconkey. Nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí, ở 37oC sau 24 giờ kiểm tra kết quả nuôi cấy.

Nếu mẫu bệnh phẩm lấy từ động vật đã chết lâu hoặc lấy không vô trùng thì các tạp khuẩn sẽ phát triển lấn át và việc phân lạp vi khuẩn Pasteurella sẽ rất khó khăn.

Tính chất mọc trên các môi trường



  • Môi trường nước thịt thường hay BHI (Brain heart infusion): Pasteurella mọc trong môi trường nước thịt đục đều, lắc có vẩn nhẹ (vẩn sương mù) môi trường không có cặn đáy.

  • Môi trường thạch máu

  • Khuẩn lạc của P. multocida có 3 dạng: Dạng nhầy (M) kích thước to nhất, trắng hơi xám khuẩn lạc nhầy, ướt. Dạng (S) kích thước nhỏ bóng, rìa nhẵn, mặt vồng. Dạng xù xì (R) thường dẹt.

  • P. multocida không gây dung huyết trên thạch máu.

  • Khuẩn lạc của P. multocida có mùi đặc trưng: mùi tanh của nước dãi khô.

  • Môi trường thạch MacConkey: Vi khuẩn P. multocida không mọc trên thạch MacConkey

4.3.5. Giám định vi khuẩn

4.3.5.1. Kiểm tra hình thái vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy

Lấy que cấy chấm vào khuẩn lạc trên đĩa thạch, hoà vào giọt nước sinh lý trên phiến kính hoặc lấy 1 vòng que cấy canh trùng đã nuôi cấy vi khuẩn giàn mỏng trên phiến kính, để khô, rồi cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn.

Tiêu bản sau khi đã được cố định, nhuộm bằng phương pháp Gram. Xem tiêu bản vật kính dầu 100X.

Vi khuẩn bắt màu đỏ không nhìn rõ lưỡng cực như tiêu bản nhuộm từ tổ chức hay máu, có dạng cầu trực khuẩn hoặc đa hình thái: hình bầu dục, hình chấm tròn hoặc hình que. Vi khuẩn đứng rải rác, không thành chuỗi.

4.3.5.2. Các phản ứng sinh hóa


Bảng1: Một số dặc tính sinh hoá đặc trưng của vi khuẩn P. multocida


Tính chất

P.multocida

Dung huyết

-

Mọc MacConkey

-

urease

-

Lactose

-

H2S

-

Catalaza

+

Oxidaza

+

Indol

+

Glucose

+

Sucrose

+

Dương tính: + ; âm tính: -

  • Giám định khả năng lên men đường glucose, lactose, sinh H2S

  • Dùng thạch nghiêng chế từ Kligler hoặc TSI: Thạch màu đỏ có 2 phần: phần thạch đứng bên dưới để kiểm tra khả năng lên men đường glucose, sinh hơi, sinh H2S, phần thạch nghiêng ở bên trên để kiểm tra khả năng lên men đường lactose.

  • Lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính giữa phần thạch đứng) sâu xuống đáy ống nghiệm, rút dần que lên cấy tiếp trên bề mặt nghiêng, nuôi cấy ở 370C trong điều kiện hiếu khí.

  • Kiểm tra sau 24 giờ nuôi cấy: vi khuẩn không lên men đường Lactose nên mặt nghiêng có màu hồng, lên men đường Glucose làm môi trường ở phần thạch đứng (phần chân ống) có vàng. Vi khuẩn Pasteurella không sinh H2S nên đáy ống nghiệm không có màu đen.

  • Cấy khuẩn lạc nghi ngờ thẳng (chính giữa ống) sâu xuống đáy ống nghiệm. Sau khi cấy xong để tủ ấm 370C

  • Giám định khả năng sinh Indol và phân giải Ure

  • Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường nước peptone, nuôi cấy ở 370C.

  • Kiểm tra sau 24 giờ nuôi cấy: Vi khuẩn làm sinh indol nên khi nhỏ dung dịch Kowac lên mặt môi trường, lắc nhẹ, vòng màu đỏ tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và môi trường (dương tính).

  • Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường thạch ure: Vi khuẩn không phân giải urê nên môi trường vẫn giữ nguyên màu.

  • Phản ứng Oxidaza và Catalaza

  • Phản ứng Oxidaza: Tiến hành trên giấy có tẩm dung dịch 1% Tetrammethyl-P. phenylene diamin hydrochloride. Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch chà sát lên trên mặt giấy đã thấm thuốc thử. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đen tím sau 30 giây.

  • Phản ứng Catalaza: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch đặt lên một điểm trên phiến kính sạch. Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3%. Phản ứng dương tính khi thấy có hiện tượng sủi bọt.

4.4. Thử độc lực trên động vật thí nghiệm

Lấy khuẩn lạc sau khi đã được giám định hình thái, tính chất mọc trên các môi trường và sinh hoá cấy vào môi trường nước thịt, nuôi cấy tĩnh (không lắc) ở 370 C sau 24 giờ lấy 0,2 ml canh trùng tiêm cho hai chuột theo dõi trong bảy ngày:



  • Nếu cả hai chuột chết: vi khuẩn tụ huyết trùng có độc lực cao.

  • Nếu 1 chuột chết: vi khuẩn tụ huyết trùng có độc lực yếu.

  • Nếu hai chuột chết không chết: vi khuẩn tụ huyết trùng không có độc lực.

4.5. Định typ huyết thanh: có thể định typ huyết thanh vi khuẩn tụ huyết trùng bằng phản ứng IHA, nếu phòng thí nghiệm có đủ điều kiện để tiến hành phản ứng (xem phụ lục 3).

5. Kết luận

Dựa vào

1. Bệnh sử

2.Triệu chứng lâm sàng

3. Bệnh tích

4. Kết quả chẩn đoán phòng thí nghiệm

- Phân lập, giám định đặc tính sinh hoá

- Kiểm tra độc lực trên động vật thí nghiệm




KT. BỘ TRƯỞNG

THỨ TRƯỞNG
Bùi Bá Bổng

Phụ lục

Phụ lục 1: Nhuộm gram

1. Thuốc nhuộm



  1. Dung dịch kết tinh tím

    Kết tinh tím

    2,5g

    Nước cất

    1000 ml

  2. Dung dịch fuscin mẹ

Fucsin kiềm

1g

Cồn 960 C

10 ml

Axit phenic kết tinh

5g

Nước cất

100ml

Pha loãng dung dịch mẹ theo tỉ lệ 1/10 với nước cất khi nhuộm

  1. Dung dịch lugol

    Iodua kali

    1g

    Iodua tinh thể

    0,5g

    Nước cất

    150 ml

  2. Cồn axeton

Cồn nguyên chất

3 phần

Axeton

1 phần

2. Cách nhuộm

  • Nhỏ dung dịch tím lên tiêu bản: 1 phút đến 2 phút

  • Rửa nước nhanh, vẩy khô nước

  • Nhỏ dung dịch lugol: để 1 phút

  • Rửa nước nhanh, vẩy khô

  • Nhỏ cồn Axeton

  • Rửa nước thật nhanh

  • Nhỏ dung dịch fucsin loãng: để 1 phút

  • Rửa nước

  • Thấm khô. Sấy khô

3. Xem kính bằng vật kính dầu

  • Vi khuẩn gram dương bắt màu tím

  • Vi khuẩn gram âm bắt màu đỏ


Phụ lục 2: Nhuộm Giemsa

Dùng để nhuộm các tiêu bản máu

1. Thuốc nhuộm


Giemsa bột

1g

Glyxerin

66ml

Cồn nguyên chất

66ml

2. Cách nhuộm

  • Tiêu bản máu làm xong cố định bằng cồn nguyên chất trong 10 phút rồi rửa bằng nước cất

  • Nhỏ dung dịch Giemsa đã pha loãng (1/10, 1/20....) cho ngập tiêu bản. Để 20 phút đến 30 Phút. Rửa nước nhanh. Sấy khô. (Không được thấm).

3. Xem kính

  • Tế bào bạch cầu: bắt màu đỏ

  • Tế bào đa nhân: bắt màu đỏ tía

  • Bào tương: bắt màu xanh da trời hoặc hồng

  • Vi khuẩn: bắt màu xanh

  • Hạt nhiễm sắc: bắt màu đỏ


Phụ lục 3: Định type kháng nguyên vỏ (capsular) bằng phản ứng IHA
1. Chuẩn bị nguyên liệu:

  • Huyết thanh tối miễn dịch của các chủng Tụ huyết trùng.

  • Chế kháng nguyên: Giống vi khuẩn P. multocida cần định type được nuôi trên môi trường thạch máu hoặc thạch Dextrose Starch Agar. Sau 16 giờ đến 18 giờ nuôi cấy, rửa mặt thạch bằng dung dịch phosphat buffer solution (PBS). Huyễn dịch thu được được đun cách thuỷ ở 1000C trong vòng 1 giờ, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút để loại cặn. Dịch nổi phía trên chính là kháng nguyên giáp mô hoà tan.

  • Cố định hồng cầu cừu (HCC):

+ Máu cừu được lấy cho vào bình tam giác có chứa Alsever với tỷ lệ 1:1. Tiến hành rửa hồng cầu ba lần bằng PBS với tỷ lệ PBS và hồng cầu là 1/10, ly tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút. Sau lần rửa cuối cùng, hoà kết tủa với PBS để tạo ra dung dịch 10% và bảo quản ở 40C trong hộp có chứa đá vụn.

+ Pha dung dịch glutaraldehyt 1% với PBS Hỗn dịch 10% hồng cầu cừu được trộn từ từ với thể tích tương đương của dung dịch glutaraldehyt 1% và hỗn dịch này ủ ở 40C trong 30 phút với que khuấy ở tốc độ chậm.

+ Ly tâm hỗn dịch trên với tốc độ 2000 vòng / phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Rửa hồng cầu bằng PBS 3 lần như trên, lần cuối lấy cặn hồng cầu hoà vào dung dịch PBS để tạo thành dung dịch hồng cầu 10%. Hồng cầu đã cố định với glutaraldehyt (G-HCC) được bảo quản ở 4OC.



  • Hấp phụ kháng nguyên lên hồng cầu.

+ Trộn dung dịch 10% (G-HCC) với kháng nguyên chiết tách ở trên ủ hỗn dịch ở 37OC trong vòng 2giờ.

+ Tách hồng cầu bằng ly tâm 1500 v/p trong 5 phút và rửa 3 lần với 10ml PBS mỗi lần. Dùng dung dịch PBS có chứa 0,25% albumin huyết thanh bò (BSA-PBS) thêm vào hồng cầu vừa li tâm để thu được dung dịch 0,5% hồng cầu.

2.. Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp

Tiến hành phản ứng trên đĩa nhựa microtiter 96 giếng đáy chữ U ( gồm 8 hàng x 12 cột) theo sơ đồ (trang sau).



Thứ tự các lỗ

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

TN


Dung dịch PBS-0,25% BSA (l)

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

Huyết thanh tối miễn dịch đặc hiệu (l)

50


































Hồng cầu – kháng nguyên (l)

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

ĐC -

Dung dịch PBS-0,25% BSA (l)

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

Hồng cầu – kháng nguyên (l)

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

ĐC +

Dung dịch PBS-0,25% BSA (l)

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

Huyết thanh tối miễn dịch đặc hiệu của các typ (l)

50


































Hồng cầu – Kháng nguyên (của chủng THT chuẩn) (l)

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

Chú thích ĐC + : Đối chứng dương

ĐC - : Đối chứng âm

TN : Thí nghiệm

3. Các bước làm phản ứng:



  • Pha loãng huyết thanh trong dung dịch đệm PBS - 0,25% BSA theo bậc hai bằng cách dùng Micropipet cho vào mỗi giếng 50 l dung dịch PBS - 0,25% BSA, sau đó cho vào dãy giếng đầu phía bên trái bản nhựa mỗi giếng 50 l huyết thanh tối miễn dịch của các chủng vi khuẩn Tụ huyết trùng đã biết (A, B, D, E) và trộn đều ta được huyết thanh pha loãng hai lần, tiếp đó hút từ dãy giếng đầu 50 l (huyết thanh pha loãng bậc 2) chuyển sang dãy tiếp theo, cứ như vậy cho đến dãy giếng cuối cùng và hút từ dãy cuối bỏ đi 50 l.

  • Dùng Micropipet hút vào mỗi giếng thí nghiệm 50 l hồng cầu gắn kháng nguyên

  • Lắc khay nhựa trên máy lắc khoảng 40 giây để trộn đều các thành phần, để yên ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ rồi đọc kết quả lần một, sau đó để qua đêm đọc kết quả lần hai.

  • Đánh giá phản ứng

Dương tính: hồng cầu ngưng kết hình như hoa hồng, mức độ ngưng kết được đánh giá như sau:

++++ : hồng cầu ngưng kết rất đều, rìa xung quanh cuộn khía như

hoa hồng : 4 điểm

+++ : hồng cầu ngưng kết đều : 3 điểm

++ : hồng cầu ngưng kết tương đối đều : 2 điểm

+ : hồng cầu ngưng kết quanh đáy lỗ : 1 điểm


Phụ lục 4: Phản ứng sinh indol

- Thuốc thử Kovacs

a- Paradimetylaminobenzaldehyte 5 g

b- Amyl alcohol (cồn amyl) 75 ml

c- HCL đặc 25 ml

- Cách pha: cho Paradimetylaminobenzaldehyte vào cồn để vào nước ấm 500C đến 600C, lắc đều cho tan hoàn toàn đợi nguội, cho từ từ HCl đặc vừa cho vừa lắc.

Bảo quản thuốc thử ở nhiệt độ lạnh khoảng 40C

- Tiến hành và đánh giá phản ứng: Nhỏ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử Kovacs vào môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn, nếu trên bề mặt môi trường có vòng màu đỏ ở là phản ứng dương tính. Không biến màu là phản ứng âm tính.







tải về 208.09 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương