300
249
118
M: marker 100bp
(-): Chứng âm
(+): Chứng dương
300 IS1081
249 IS6110
118 23S rDNA
(-) 1 2 3 (+) M
Mẫu 1, 2, 3 tương ứng với các mẫu khuyết IS6110: TB06-220, TB06-246, TB06- 247
Hình 3.9. Kết quả phát hiện mẫu khuyết IS6110 ở các chủng lao miền Nam
Ba mẫu khuyết IS6110 trên được kiểm tra lại với PCR đơn mồi. Kết quả sau khi điện di như sau:
M: marker 100bp
(-): chứng âm
(+): chứng dương
300 IS1081
249 IS6110
118 23S rDNA
 
(-) 1 2 3 (+) M
Mẫu 1, 2, 3 tương ứng với các mẫu khuyết IS 6110 là : TB06-220, TB06-246, TB06-247
Hình 3.10. Kết quả kiểm tra bằng PCR với 3 mẫu khuyết IS6110 tại miền Nam
Dựa vào hình ảnh điện di chúng tôi thấy 3 mẫu DNA được kiểm tra lại không xuất hiện băng đặc trưng cho IS6110. Mẫu đối chứng âm không xuất hiện băng nào, mẫu đối chứng dương xuất hiện một băng duy nhất đặc trưng cho gen đích IS6110. Như vậy chúng tôi kết luận khi kiểm tra 250 mẫu DNA của chủng lao ở miền Nam có 3 mẫu khuyết IS6110. Vậy kết quả phát hiện gen đích ở miền Nam được thống kê trong bảng sau
Bảng 3.6. Kết quả phát hiện gen đích trên một số chủng lao miền Nam
Tổng số mẫu
|
Tổng kết quả phát hiện gen đích của phản ứng mPCR
|
Gen đích IS6110
|
Gen đích IS1081
|
Gen đích 23S rDNA
|
Xuất hiện
|
Khuyết
|
Xuất hiện
|
Khuyết
|
Xuất hiện
|
Khuyết
|
250
|
247
|
3 (1,2%)
|
250
|
0 (0%)
|
250
|
0 (0%)
|
Kết quả trên cho thấy khi khảo sát trên số lượng mẫu là 250 của bệnh viện Phạm Ngọc Thạch thì phát hiện ra 3 mẫu không xuất hiện băng đặc trưng cho gen đích IS6110, 247 mẫu còn lại xuất hiện đủ 3 băng đặc trưng cho các gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA. Tỷ lệ khuyết gen của các chủng lao ở miền Nam được phát hiện với IS6110, IS1081 và 23S rDNA lần lượt là: 1,2%, 0%, 0%.
3.1.3. Tỷ lệ khuyết các trình tự gen đích ở Việt Nam
Sau khi kiểm tra lại các mẫu nghi khuyết ở lần chạy đầu tiên với phản ứng PCR chúng tôi đã có kết luận về tỷ lệ khuyết các gen đích ở Việt Nam. Tổng số mẫu DNA kiểm tra trên cả ba miền là 750. Tỷ lệ khuyết các gen đích được thống kê trong bảng sau:
Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra hiện tượng khuyết gen ở Việt Nam
Tổng số mẫu
|
Tổng kết quả phát hiện gen đích của phản ứng mPCR
|
Gen đích IS6110
|
Gen đích IS1081
|
Gen đích 23S rDNA
|
Xuất hiện
|
Khuyết
|
Xuất hiện
|
Khuyết
|
Xuất hiện
|
Khuyết
|
750
|
738
|
12 (1,6%)
|
749
|
1 (0,133%)
|
749
|
1 (0,133%)
|
Như vậy qua kết quả kiểm tra 750 mẫu DNA tách từ chủng lao bằng phương pháp multiplex PCR và PCR chúng tôi thu được kết quả về tỷ lệ khuyết các gen đích trong trình tự gen của vi khuẩn lao như sau:
Tỷ lệ khuyết IS6110 = (12/750)  100% = 1,6%
Tỷ lệ khuyết IS1081 = (1/750) 100% = 0,133%
Tỷ lệ khuyết 23S rDNA = (1/750) 100% = 0,133%
Trong nghiên cứu này, khi phân tích tỷ lệ khuyết gen IS6110 chúng tôi đồng thời phân tích trên cả 3 gen IS6110, IS1081, 23SrDNA để xác định xem trong trường hợp khuyết gen đích IS6110 thì chọn gen nào thay thế để phù hợp với đặc điểm của các chủng lao Việt Nam. Chúng tôi nhận thấy tỷ lệ khuyết gen đích IS6110 ở các chủng lao của Việt Nam là 1,6%. Tỷ lệ này thấp hơn so với nghiên cứu của Trần Thị Thanh Hoa là 5% [7], tương đương các tác giả nước ngoài công bố (theo Ernesto Liebana và cộng sự -1996 có 4 chủng trong 304 chủng M. tubercolosis phân lập tại Việt Nam khuyết IS6110 chiếm 1,4% [30]). Tuy nhiên ngoài nghiên cứu của Ernesto Liebana có 304 chủng thì các nghiên cứu trong nước công bố trước đây chỉ mới khảo sát trên số lượng ít khoảng vài chục chủng nên các số liệu đó có thể chưa sát thực tế. Một số nghiên cứu khác trên thế giới gợi ý sử dụng IS1081 hoặc 23S rDNA thay thế IS 6110 nhưng kết quả nghiên cứu này cho thấy cũng không thể sử dụng một gen đích đơn độc nào trong phản ứng PCR vì tỷ lệ khuyết gen IS1081 là 0,133% và 23SrDNA 0,133%. Ngoài ra chúng tôi không phát hiện chủng nào khuyết đồng thời cả 3 gen đích này.
Nghiên cứu này thực hiện trên số mẫu đủ lớn về mặt dịch tễ học, thu thập từ cả 3 miền Bắc-Trung-Nam, do vậy kết quả này phản ánh sát thực tỷ lệ khuyết gen đích trên các chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam, là thông số quan trọng cho các nhà nghiên cứu và sản xuất bộ kit PCR chẩn đoán lao phù hợp.
3.2. SO SÁNH TỶ LỆ KHUYẾT CÁC TRÌNH TỰ IS6110, IS1081 VÀ 23S rDNA TRÊN BA MIỀN BẮC TRUNG NAM TẠI VIỆT NAM
3.2.1. So sánh tỷ lệ khuyết các trình tự IS6110 trên ba miền Bắc Trung Nam
Dựa vào kết quả kiểm tra tỷ lệ khuyết trình tự IS6110 chúng tôi đã thống kê và so sánh tỷ lệ này giữa ba miền nhằm phục vụ cho những nghiên cứu liên quan đến chẩn đoán của từng vùng miền.
Bảng 3.8. Tỷ lệ khuyết gen IS6110 ở ba miền Bắc Trung Nam
Tỷ lệ khuyết IS6110
|
Miền
|
Bắc
|
Trung
|
Nam
|
%
|
0%
|
3%
|
1,2%
|
Như vậy khi khảo sát trên cả ba miền chúng tôi nhận thấy ở miền Bắc chưa có hiện tượng khuyết gen đích IS6110 trong các chủng vi khuẩn lao. Tuy nhiên ở miền Trung và miền Nam đã xuất hiện những chủng khuyết trình tự gen đích rất bảo thủ này. Đặc biệt là ở miền Trung tỷ lệ khuyết gen IS6110 lên đến 3%. Với tỷ lệ này nếu áp dụng PCR chỉ với mồi IS6110 trong chẩn đoán lao ở miền Trung và miền Nam sẽ bỏ sót nhiều bệnh nhân.
3.2.2. So sánh tỷ lệ khuyết trình tự IS1081 trên các chủng lao ở ba miền Bắc Trung Nam Việt Nam
Dựa vào kết quả kiểm tra tỷ lệ khuyết trình tự IS1081 chúng tôi đã tiến hành thống kê so sánh tỷ lệ này giữa ba vùng miền của Việt Nam.
Bảng 3.9. Tỷ lệ khuyết gen IS1081 ở ba miền Bắc Trung Nam
Tỷ lệ khuyết gen IS1081
|
Miền
|
Bắc
|
Trung
|
Nam
|
%
|
0 (0%)
|
1 (0,33%)
|
0 (0%)
|
Kết quả thống kê trên cho thấy với các chủng lao ở miền Bắc và miền Nam không có hiện tượng khuyết gen IS1081. Trong 300 chủng lao ở miền Trung có 1 mẫu vi khuẩn lao khuyết IS1081. Qua kết quả trên chúng tôi có nhận xét rằng việc sử dụng gen đích IS1081 trong chẩn đoán lao bằng phân tử là rất cần thiết do tỷ lệ khuyết trình tự này rất thấp.
3.2.3. So sánh tỷ lệ khuyết gen 23S rDNA trên ba miền Bắc Trung Nam Việt Nam
Kết quả khảo sát cho thấy chỉ có duy nhất một chủng lao của miền Trung có hiện tượng khuyết 23S rDNA. Tỷ lệ khuyết gen đích 23S rDNA là 0,33%.
Bảng 3.10. Tỷ lệ khuyết gen 23S rDNA ở ba miền Bắc Trung Nam
Tỷ lệ khuyết gen 23S rDNA
|
Miền
|
Bắc
|
Trung
|
Nam
|
%
|
0 (0%)
|
1 (0,33%)
|
0 (%)
|
3.2.4. Đặc điểm khuyết gen ở vi khuẩn lao ở Việt Nam
Với kết quả thu được khi tiến hành khảo sát trên ba miền Bắc Trung Nam chúng tôi nhận thấy đối với các chủng vi khuẩn lao ở miền Bắc không có hiện tượng khuyết các gen đích. Tuy nhiên ở miền Trung có hiện tượng khuyết với cả ba trình tự IS6110, IS1081 và 23S rDNA. Trong đó hiện tượng khuyết gen IS6110 xảy ra với tỷ lệ nhiều nhất (3%). Đặc biệt với hiện tượng khuyết hai trình tự IS1081 và 23S rDNA là hiện tượng hiếm gặp, do vậy cần phải nghiên cứu thêm về hai mẫu vi khuẩn lao này. Đối với các mẫu lao ở miền Nam cũng có hiện tượng khuyết IS6110 với tỷ lệ là 1,2%.
Hiện theo một số tác giả đề nghị chỉ dùng trình tự hoặc IS1081, hoặc 23S rDNA thay thế cho trình tự IS6110 trong chẩn đoán lao. Nhưng trình tự IS1081 và 23S rDNA có số bản copy ít và hiện chúng tôi phát hiện ra chúng có tỷ khuyết nên tốt nhất phải xây dựng kit chẩn đoán với cả 3 gen đích đồng thời.
Ngay cả với kết quả không phát hiện thấy tỷ lệ khuyết gen đích đặc trưng của các chủng vi khuẩn lao ở miền Bắc, điều đó không có nghĩa là các bệnh nhân mắc lao ở miền Bắc chỉ bị nhiễm các vi khuẩn lao có đầy đủ cả ba trình tự đặc trưng trên vì trong cùng một quốc gia việc giao lưu rất dễ dàng, hơn nữa thì bệnh nhân có thể tự do lựa chọn nơi thăm khám và điều trị cho mình, nên các chủng khuyết gen có thể theo các bệnh nhân này thâm nhập vào miền Bắc. Vì vậy việc thiết kế các kit chẩn lao với cả ba gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA là điều hết sức cần thiết.
KẾT LUẬN
-
Tỷ lệ khuyết các gen đích ở Việt Nam
Tỷ lệ khuyết IS6110 = (12/750) 100% = 1,6%
Tỷ lệ khuyết IS1081 = (1/750) 100% = 0,133%
Tỷ lệ khuyết 23S rDNA = (1/750) 100% =0,133%
-
Tỷ lệ khuyết các gen đích ở ba miền
-
Tỷ lệ khuyết các gen đích ở miền Bắc
Tỷ lệ mẫu không xuất hiện IS6110 = (0/200) 100% = 0%
Tỷ lệ mẫu không xuất hiện IS1081 = (0/200) 100% = 0%
Tỷ lệ mẫu không xuất hiện 23S rDNA = (0/200) 100% = 0%
-
Tỷ lệ khuyết các gen đích ở miền Trung
Tỷ lệ mẫu khuyết IS6110 = (9/300) 100% = 3%
Tỷ lệ mẫu khuyết IS1081 = (1/300) 100% = 0,33%
Tỷ lệ mẫu khuyết 23S rDNA = (1/300) 100% = 0,33%
-
Tỷ lệ khuyết các gen đích ở miền Nam
Tỷ lệ mẫu khuyết IS6110 = (3/250) 100% = 1,2%
Tỷ lệ mẫu khuyết IS1081 = (0/250) 100% = 0%
Tỷ lệ mẫu khuyết 23S rDNA = (0/250) 100% =0 %
KIẾN NGHỊ
Cần xây dựng kit chẩn đoán lao multiplex PCR với cả ba gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA trong chẩn đoán lao ở Việt Nam để tránh bỏ sót bệnh nhân.
TÀI TIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
-
Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu sự đáp ứng miễn dịch trong một số thể bệnh lao, Luận án Tiến sỹ Sinh học.
-
Bộ Y tế, Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2005), Báo cáo tổng kết Chương trình chống lao quốc gia 2005.
-
Nguyễn Đình Bảng (1992), Vi sinh vật y học, Học viện quân y.
-
Nguyễn Thị Chính, Trương Thị Hoà (2005), Vi sinh vật Y học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
-
Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục.
-
Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2004), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục.
-
Trần Thị Thanh Hoa, Hoa Thị Minh Tú, Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2005), Sử dụng kết hợp hai phương pháp hoá sinh và PCR để xác định đa kháng thuốc của M. tuberculosis, Hội nghị khoa học toàn quốc về công nghệ sinh học, Tháng 12/2005.
-
Nguyễn Văn Hưng (2001), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của Mycobacterium tubeculosis phân lập tại Viện lao và Bệnh phổi, Luận án Tiến sỹ Y học.
-
Lê Thị Luyến, Bộ Y tế (2007), Tình hình dịch tễ, điều trị, dự phòng và nghiên cứu Lao tại Việt Nam, Hội thảo về sinh học phân tử về bệnh lao, Đại học Quốc gia Hà Nội, Tháng 8/2007.
-
Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kĩ thuật di truyền và ứng dụng, NXB Giáo dục.
-
Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng và điều trị, NXB Giáo dục.
-
Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ và cộng sự (2007), “Hoàn thiện qui trình PCR đối với hai gen mới IS1081 và 23Sr ADN trong nâng cao hiệu quả chẩn đoán lao”, Tạp chí Y Dược Học Quân Sự , 32(2), p. 31-37.
-
Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ, Lê Quốc Tuấn (2007), “Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình PCR đa mồi (multiplex PCR) dùng trong chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao” Tạp chí Y học Việt Nam, 337(1), p.27-31.
-
Quyền Đình Thi (2005), Công nghệ sinh học, NXB Khoa học kỹ thuật.
-
Nguyễn Xuân Triều (2006), “Chẩn đoán lao”, Bài giảng Lao và Bệnh phổi sau đại học, Học Viện Quân Y.
Tiếng Anh
-
Abbas Bahador, (2005) “Performance Assessment of IS1081-PCR for Direct Detection of Tuberculous Pleural Effusion:Compared to rpoB-PCR”, Research Journal of Agriculture and Biological Sciences 1(2): 142-145.
-
Alcaide F., M. A. Benitez, J. M. Escriba, R. Martin (2000), “Evaluation of the BACTEC MGIT 969 and thi MB/BacT systems for recovery of Mycobacteria from clinical specimens and for species identification by DNA AccuProbe”, J. Clin. Microbiol. 38, 398-401.
-
Andersen A.B., Thybo S., R Godfrey-Faussett, Stoker N.G. (1993), “Polymerase Chain Reaction for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Sputum” Eur. J. Clin. Microbio!. Infect. Dis, 12 (12), 922-927.
-
Ahuja G. K., Mohan K. K., Prasad K., Behari M. (1994), “Diagnostic criteria for tuberculous meningitis and their validation”, Tuber Lung Dis 75, 149-152.
-
Bhattacharya B. et al (2003), “Development of a new sensitive and efficient multiplex polymerase chain reaction (PCR) for identification and differentiation of defferent Mycobacteria species”, Tropical Medicine and International Health, 8 (2), 150-157.
-
Clarrridge JE III, Shawar RM, Shinnck TM, Plikaytis BB. (1993), “Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory”, J Clin Microbiol, 31, 2041-56.
-
Cole S. T. et al. (1998), “Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence”, Nature, 393, 537-544.
-
Collins D M , D M Stephens (1991), “Identification of an insertion sequence, IS1081, in Mycobacterium bovis”, FEMS Microbiol Lett, 15(67), 11-15.
-
Das R. H., Chander M. A. (1995), “A rapid and gentle method for the isolation of genomic DNA from mycobacteria”, Nucl. Acids. Res.21: 2529-2530.
-
Dick Van Soolingen, Lishi Qian et al (1995), “Predominance of a single Genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of East Asia”, Journal of clinical Microbiology, p. 3234 – 3238.
-
Down J. A., Walters A. H., Dey M. S., Howard D. R., Little M. C., Keating W. E. (1996), “Sample processing method for Mycobacterium tuberculosis”, United States Patent 5554503.
-
David H. Persing et al (1993), “Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications”, American Society for Microbiology, 51-172.
-
Elnifro E. M. et al (2000), “Multiplex PCR: Optimization and Application in Diagnostic Virology”, Oct, 2000, p. 559-570.
-
Espitia C. et al (1999), “The PE-PGRS glycine-rich proteins of Mycobacterium tuberculosis: a new family of fibronectin-binding proteins”, Microbiology, 145, 3487–3495.
-
Ernesto Liebana et el (1996), “Assessment of Genetic Markers for Species Differentiation within the Mycobacteria tuberculosis complex”, Vol 34, No 4, p933-938..
-
Forbes BA, Hicks KES (1993), “Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens in a clinical laboratory by polymerase chain reaction”, J Microbiol 31: 1688-94.
-
Fomukong NG, Tang TH et al (1994), “Insertion sequence typing of Mycobacterium tuberculosis: characterization of a widespread subtype with a single copy of IS6110”, Tuber Lung Dis, 75: 435 -440.
-
Goyal et al (1996), “Rapid detection of multidrug – resistant tuberculosis”, Eur Respir, 1997, 10, p1120 – 1124.
-
Henegariu O., N. A. Heerema, S. R. Dlouhy, G. H. Vance, P. H. Vogt (1997), “Multiplex PCR: Critical Parameters and Step-by-Step Protocol”, BioTechniques 23, 504-511.
-
Henegariu, O., P. Hirschmann, K. Kilian, S. Kirsch, C. Lengauer, R. Maiwald, K. Mielke and P. Vogt (1994) “Rapid screening of the Y chromosome in idiopathic sterile men, diagnostic for deletions in AZF, a genetic Y factor expressed during spermatogenesis”, Andrologia, 26, 97-106.
-
Kamerbeek J. et al (1997), “Simultaneous Detection and Strain Differentiation of Mycobacterium tuberculosis for Diagnosis and Epidemiology”, Journal of Clinical Microbiology, Apr. 1997, 907-914.
-
Kubica GP, Dye WE, Cohn ML, Middlebrook C. (1963), “Sputum degestion and decontamination with N-Acetyl-Lsysteine-sodium hydroxide for culture of bacteria”, American Review of Respiratory Diseases, 87, 775-779.
-
Kurabachew M. et al (2004), “A multiplex polymerase chain reaction assay for genus-, group- and species-specific detection of Mycobacteria”, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 49, 99-104.
-
Kurabachew M., Sandaad R. A., Engere, Bjorvatna B., (2003), “Sequence analysis in the 23S rDNA region of Mycobacterium tuberculosis and related species”, Journal of Microbiological Methods, 54, 373 - 380.
-
Lilly K. W. Yuen et al (1993), “Characterization of Mycobacterium tuberculosis strains from Vietnames patients by southern Blot Hybridization”, Journal of clinical Microbiology, p. 1615-1618.
-
Mekonnen Kurabacchew et al (2004) “A multiplex polymerase chain reaction assay for genus-, group- and species-specific detection of mycobacteria”. Diagn. Microbiol. Infect. Dis, 49(2), 99-104.
-
Musser J. M. (1995), “Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria : Molecular genetic insights”, Clinical Microbiology Reviews, 8 (4), 496-514.
-
Mustafa A.S., Abal A.T. and Chugh T.D. (1999), “Detection of Mycobacterium tuberculosis complex and non-tuberculous Mycobacteria by multiplex polymerase chain reactions”, Eastern Mediterranean Health Journal, 5(1), 61-70.
-
Nguyen L. N., Kox L. F., Pham L. D., Kuijper S., Kolk A. H. (1996), “The potential contribution of the polymerase chain reaction to the diagnosis of tuberculous meningitis”, Arch Neurol 53, 771-776.
-
Palomino J. C., S. C. Leão, V. Ritacco (2007), Tuberculosis 2007 From basic science to patient care”, www.TuberculosisTextbook.com.
-
Schlossberg D. (2006), “Tuberculosis and nontuberculous Mycobacteria l infections. Fifth edition”, Medical Publishing Division.
-
Chia sẻ với bạn bè của bạn: |
