TS. NguyÔn Lai Thµnh

MỞ ĐẦU

Trước tình trạng bế tắc của việc tìm kiếm thuốc kháng sinh, các nhà khoa học nhận thấy một triển vọng mới đầy hứa hẹn là các peptide kháng khuẩn. Hiện nay, các peptide kháng khuẩn được coi như nguồn “kháng sinh tự nhiên” của sinh giới đã được phát hiện ở nhiều loài sinh vật khác nhau. Thuộc nhóm peptide này, Cecropin đã được phân lập đầu tiên từ nhộng bướm tằm Hyalophora cecropia bị lây nhiễm vi khuẩn, và sau đó là ở nhiều loại côn trùng 2 cánh.

Họ cecropin gồm có ba nhóm chính là cecropin A, B và D [11]. Trong đó cecropin B được biết đến với hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Với tính hiệu quả trong việc kiểm soát mầm bệnh sinh ra do tác nhân vi khuẩn và côn trùng, cecropin B cũng có thể có hiệu quả trong kiểm soát các mầm bệnh do các tác nhân này gây nên ở cá, cũng như ở nhiều loài động vật. Vì vậy mục đích chính của nhóm nghiên cứu là thử nghiệm chuyển gen cecropin B vào tế bào chuột nuôi cấy nhằm đánh giá khả năng tiếp nhận và biểu hiện gen kháng khuẩn này. Một công việc quan trọng trong quá trình nghiên cứu là thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn, cũng như các nồng độ kháng khuẩn tối ưu của cecropin lên một số chủng vi sinh vật gây bệnh trên động vật để làm cơ sở đánh giá cecropin tái tổ hợp được sản xuất trong tế bào nuôi cấy.

Vì thế chúng tôi đã tiến hành “Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật”.

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH

1.1.1. Chất kháng sinh

Một CKS tác động lên cả vi khuẩn G(+) lẫn vi khuẩn G(-) và nấm được gọi là một CKS phổ rộng. Các CKS phổ hẹp chỉ tác dụng lên một nhóm VSV, chẳng hạn vancomycin, một glycopeptide.

Trước đây, CKS được sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng có nguồn gốc từ VSV (như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn). Những năm gần đây với những tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhiều CKS đã được tạo ra theo con đường bán tổng hợp (ampicillin) hoặc tổng hợp mới hoàn toàn (chloramphenicol) [41].

Như vậy, CKS là các chất kháng khuẩn tự nhiên, bán tổng hợp, hoặc tổng hợp có hiệu quả diệt khuẩn ở nồng độ thấp. Mỗi CKS thường chỉ có tác dụng với một nhóm VSV nhất định [4].

Số lượng CKS cách đây 1/4 thế kỷ chỉ khoảng vài trăm loại, nhưng đến năm 1993 số lượng này đã lên đến 6.000. Đầu thập kỷ này đã phát hiện thêm 2.000 các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từ VSV. Ước tính số lượng thực sự của các chất này phải lên đến trên 15.000 chất [30].

1.1.2. Sơ lược lịch sử nghiên cứu CKS

Sự ra đời của penicillin đã kéo theo sự ra đời của hàng loạt các chất kháng sinh khác. Sau khi phát hiện ra penicillin, các nhà khoa học trên toàn thế giới đã tích cực tìm kiếm, nghiên cứu thêm nhiều loại CKS có nguồn gốc từ VSV.

Năm 1944, Abraham Waksman, Schatz và Bugie đã phát hiện ra streptomycin dẫn đến một kỷ nguyên mới trong điều trị bệnh lao và bệnh viêm màng não. Đây là một CKS phổ rộng, kháng được cả vi khuẩn G(-) lẫn vi khuẩn G(+). Tốc độ tìm kiếm CKS ngày càng được đẩy mạnh. Những năm 1940 – 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của CKS. Hàng loạt CKS được tách chiết và xác định: actinomicin (Waksman, 1940), chloramphenicol (Erhlich, 1947), chlotetracylin (Dugar, 1948). Ngày nay số lượng CKS được phát hiện lên tới trên 15000 chất, trong đó hàng trăm chất được dùng trong y học thực tiễn.

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các ngành Vi sinh vật học, Hóa sinh học, Di truyền học phân tử và đặc biệt là sự ra đời của Công nghệ sinh học (1975) đã tạo điều kiện thuận lợi cho lĩnh vực nghiên cứu CKS đạt được những thành tựu lớn lao.

1.1.3. Phân loại CKS

Thông thường CKS được phân loại ra thành một số nhóm quan trọng sau:

- Nhóm β – lactam: về cấu trúc chúng đều có vòng β – lactam. Nhóm này bao gồm:

+ Các penicillin: gồm có Penicillin, Ampicillin, Amoxicillin, Cloxacillin ...

+ Các cephalosporin: có 4 thế hệ I, II, III, IV. Thế hệ I, II chủ yếu để điều trị các vi khuẩn G(+), thế hệ III, IV chủ yếu để điều trị vi khuẩn G(-). Gồm có: Cefadroxil, Cephalexin, Cefaclor, Cefixim, Ceftriaxon ...

- Nhóm tetracycline: là các CKS có hoạt phổ rộng, gồm có Tetracyclin, Doxycylin, Clotetracyclin, Minocyclin ....

- Nhóm Aminosid: có nguồn gốc từ vi sinh, có phổ tác dụng rộng, chủ yếu trên vi khuẩn G(-). Gồm các kháng sinh Streptomycin, Neomycin, Paromomycin, Gentamycin ...

- Nhóm Chloramphenicol (hay Phenicol): Chloramphenicol, Thiamphenicol

- Nhóm Lincosamid: Lincomycin, Clindamycin

1.1.4. Cơ chế tác dụng của CKS

Mỗi CKS có đích tác dụng và cơ chế tác dụng riêng nhằm ức chế hoặc tiêu diệt hoàn toàn VSV kiểm định bằng cách tác động vào một hay nhiều bước của quá trình tổng hợp. Có thể phân loại thành các cơ chế tác động sau:

1.1.4.1. Ức chế tổng hợp thành tế bào

Thành tế bào vi khuẩn là cấu trúc bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại áp suất thẩm thấu. Thành phần cấu trúc chủ yếu của thành tế bào là peptidoglican (PG). PG là một đại phân tử cấu tạo bởi các chuỗi polysaccarit bao gồm đơn phân là các dẫn xuất của đường glucose nằm xen kẽ nhau và lặp lại một cách liên tục (NAG – NAM). Để tạo thành mạng lưới thực sự vững chắc, các chuỗi polysaccarit của PG phải liên kết chéo với nhau thông qua một đoạn peptide ngắn giữa các tetrapeptide của tiểu phần NAM. Để có thể sinh trưởng và phân chia, tế bào phải tổng hợp các đơn vị PG mới và vận chuyển nó tới đúng vị trí sinh trưởng của thành tế bào [34]. Phần lớn các tác nhân kháng khuẩn thông thường đều hoạt động dựa trên sự ức chế quá trình hình thành liên kết chéo giữa các tetrapeptide của tiểu phần NAM. Nổi bật nhất giữa các chất này là các chất kháng sinh β – lactam mà đại diện là penicillin và cephalosporin. Đây là các kháng khuẩn có vùng chức năng là các vòng β – lactam.

Các kháng sinh β – lactam ức chế sự hình thành PG mới bằng cách gắn chặt với enzyme transpeptidase cần thiết cho sự hình thành liên kết chéo giữa các chuỗi PG, kìm hãm enzyme này và làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn [45]. Trong khi đó tế bào vẫn sinh trưởng bình thường, thể tích tế bào cứ tăng lên mãi mà thiếu thành tế bào nên yếu đi nhanh chóng, và đến một lúc sẽ phân giải vì không chịu nổi áp suất thẩm thấu. Transpeptidase được mọi β – lactam ưa gắn vào nên được gọi là protein gắn penicillin PBP (Penicillin Binding Protein).

Tuy nhiên cần chú ý rằng các CKS này chỉ hoạt động ở giai đoạn sinh trưởng của tế bào vi khuẩn mà không có tác dụng gì khi tế bào đã già hay đang ở trạng trạng thái nghỉ vì khi đó hoạt động sinh tổng hợp PG đã ngừng lại.

Các penicillin không thấm được qua thành tế bào của vi khuẩn G(-) nên hiệu quả kháng các vi khuẩn này rất thấp. Tuy nhiên các penicillin và các cephalosporin phổ rộng hoặc bán tổng hợp có thể vượt qua màng ngoài vi khuẩn G(-) nên đã khắc phục được nhược điểm trên. Tế bào người không có PG nên các kháng sinh β – lactam rất ít độc cho người [45].

Các CKS khác như vancomycin hay CKS bán tổng hợp cycloserin ức chế sự hình thành tế bào theo một cách khác. Chúng cản trở trực tiếp sự hình thành cầu D – alanin – D – alanin liên kết các tiểu phần NAM của các vi khuẩn G(+). Tuy nhiên các vi khuẩn không có cầu D – alanin – D – alanin kháng tự nhiên với các kháng sinh này.

Một CKS ức chế sự tổng hợp thành tế bào theo cách khác là bacitracin. CKS này ngăn cản sự vận chuyển của các đơn vị PG mới từ tế bào chất đến vị trí sinh trưởng của thành tế bào. Cũng như các kháng sinh β – lactam, vancomycin, cycloserin và bacitracin làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế bào làm cho tế bào vi khuẩn bị phân giải do áp suất thẩm thấu [45].

1.1.4.2. Phá hủy màng sinh chất

Một số CKS phá võ màng sinh chất của các tế bào đích bằng cách tương tác với màng sinh chất và làm tổn thương tính nguyên vẹn của nó. Đây là cơ chế hoạt động của một nhóm chất gọi là polyen. Amphotericin B là một polyen có khả năng kháng nấm vì nó gắn với ergosterol – thành phần cấu tạo nên màng sinh chất của nấm và tạo thành các lỗ rò trên màng. Do đó nội quan của màng thất thoát ra môi trường bên ngoài. Màng sinh chất của tế bào người và động vật có thể bị tổn thương bởi amphotericin B vì chúng chứa cholesterol là các phân tử có cấu trúc tương tự như ergosterol, mặc dù cách liên kết của amphotericin B với cholesterol hơi khác so với ergosterol.

Màng sinh chất của hầu hết vi khuẩn không chứa sterol nên chúng có khả năng đề kháng với amphotericin B. Tuy nhiên polyen vẫn có khả năng kháng vi khuẩn theo các cơ chế khác. Polymycin là một ví dụ, CKS này được tạo ra bởi vi khuẩn Bacillus polymyxa có khả năng kháng đặc hiệu với vi khuẩn G(-). Polymycin phá vỡ màng sinh chất của vi khuẩn bằng cách gắn vào phospholipid của màng, làm méo mó bề mặt tế bào và thay đổi cấu trúc của màng dẫn đến sự rò rỉ ra bên ngoài các nội quan của tế bào, gây chết tế bào.

1.1.4.3. Ức chế tổng hợp protein

Protein là thành phần vô cùng quan trọng, không thể thiếu được của tế bào. Do đó, việc cung cấp protein một cách liên tục là vấn đề quan trọng mang tính sống còn của tế bào. Tất cả các sinh vật trong sinh giới đều có cùng một kiểu tổng hợp protein từ ribosome dựa trên các thông tin mã hóa từ mRNA. Các CKS ức chế sự tổng hợp protein có thể tiêu diệt được cả vi khuẩn G(-) và vi khuẩn G(+).

Ribosome của vi khuẩn có sự khác biệt lớn đối với ribosome của sinh vật nhân thực cả về cấu trúc và kích thước. Ribosome của vi khuẩn có hằng số lắng là 70S, gồm hai tiểu phần là 30S và 50S. Trong khi đó ribosome của sinh vật nhân thực có hằng số lắng là 80S, gồm hai tiểu phần là 40S và 60S. Nhiều tác nhân kháng khuẩn có khả năng nhận biết sự khác biệt này của ribosome để có thể tác dụng chọn lọc lên quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn mà không ảnh hưởng đến tế bào nhân thực. Tuy nhiên một số CKSn thuộc nhóm này có thể gây hại cho người và động vật do chúng tác dụng lên ribosome 70S của ty thể hoàn toàn giống với ribosome của vi khuẩn.

Các tác nhân kháng khuẩn có đích tấn công là tiểu phần 30S của ribosome gồm các aminogicoside và các tetracyclin. Aminoglycoside bao gồm streptomycin, gentamycin, neomycin, kamacycin, tobramycin, ... Chúng gắn vào tiểu phần 30S của ribosome, làm biến dạng tiểu phần này và gây ra sự bắt cặp không chính xác giữa các codon của mRNA và các anticodon của tRNA tương ứng. Kết quả là làm cho mã di truyền trên phân tử mRNA bị đọc sai. Ví dụ dưới tác dụng của streptomycin, codon UUU mã hóa cho phenylalanin bị đọc sai thành AUU mã hóa cho isoleucin. Tetracylin phong bế vị trí gắn của phân tử RANt với RANm ở tiểu phần 30S, ngăn cản sự bổ sung các acid amin vào chuỗi polypeptide đang được kéo dài [34].

Các tác nhân kháng khuẩn khác có đích tấn công là tiểu phần 50S của ribosome. Chloramphenicol và một số CKS tương tự phong bế vị trí hoạt động của enzyme xúc tác cho sự tạo thành liên kết peptide giữa các acid amin trong chuỗi polypeptide đang kéo dài, ngăn cản sự tạo thành acid amin hoàn chỉnh. Clindamycin và các tác nhân kháng khuẩn macrolit bao gồm erythromycin gắn vào tiểu phần 50S ngăn cản sự dịch chuyển của ribosome từ codon này đến codon kế tiếp. Kết quả là quá trình dịch mã bị cản trở và sự tổng hợp protein bị dừng lại.

1.1.4.4. Ức chế các con đường trao đổi chất

Hầu hết các CKS loại này đều có cấu trúc tương tự các chất trao đổi bình thường của tế bào như acid amin, coemzyme nên được gọi là các chất trao đổi tác dụng theo kiểu ức chế cạnh tranh. Ở nhiều VSV acid para – aminobenzoic (PABA) là cơ chất cho phản ứng enzyme dẫn đến sự tổng hợp tetrahydrofolic (THF), một dạng của acid folic đóng vai trò như một coenzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp các purin và purimydin của acid nucleic. Để tổng hợp THF PABA phải được acid dihidrofolic (DHF), rồi từ DHF tổng hợp nên THF nhờ sự có mặt của các coenzyme xúc tác chuyển PABA thành DHF. Kết quả là sự thiếu hụt DHF đã cản trở sự tổng hợp THF gây ức chế sinh trưởng VSV.

Một tác nhân kháng chất trao đổi khác là trimetholprim cũng can thiệp vào quá trình tổng hợp acid nucleic. Tuy nhiên thay vì gắn vào enzyme chuyển hóa PABA thành DHF, trimetholprim lại gắn vào enzyme chuyển DHF thành THF. Các chất kháng chất trao đổi rất có giá trị trong y học vì chúng ức chế các tế bào vi khuẩn và động vật nguyên sinh mà không tác dụng lên tế bào người và động vật. Nguyên nhân là do người không tổng hợp THF từ PABA như vi khuẩn mà thay vào đó người thu nhận các acid folic đơn giản từ các chất dinh dưỡng trong chế độ ăn uống rồi chuyển chúng thành THF.

1.1.4.5. Ức chế sự tổng hợp acid nucleic

Acid nucleic bao gồm DNA và RNA, là các đại phân tử sinh học không thể thiếu đối với sự tổng hợp của tế bào. Một số CKS cản trở quá trình sao chép DNA và phiên mã ở VSV. Các CKS này ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp acid nucleic bằng cách ức chế sự tổng hợp các nucleotide, ức chế sao chép hoặc làm dừng phiên mã. Vì sự khác biệt giữa DNA của tế bào prokaryote và eukaryote là rất nhỏ nên những CKS ức chế sinh tổng hợp acid nucleic không chỉ tiêu diệt VSV mà nó còn gây độc với cả con người. Ví dụ actinomycin gắn với DNA ức chế sự tổng hợp DNA và phiên mã không chỉ ở các tế bào vi khuẩn mà cả với con người.

Nhìn chung các CKS này không được dùng để điều trị các bệnh truyền nhiễm. Tuy nhiên chúng có thể được sử dụng để nghiên cứu quá trình sao chép của DNA hoặc sử dụng nghiêm ngặt để làm chậm sự phát triển của tế bào ung thư.

Các kháng sinh tổng hợp như quinolon và fluoroquinolon có khả năng ức chế đặc hiệu DNA của tế bào prokaryote mà ít ảnh hưởng đến tế bào eukaryote. Những kháng sinh này ức chế hoạt động của enzyme tháo xoắn sợi DNA mạch kép trong quá trình sao chép DNA của tế bào. Ví dụ ciprofloxaxin được kê đơn trong các trường hợp nhiễm trùng đường hô hấp, nhiễm trùng đường tiết niệu hoặc trong các trường hợp nghi mắc bệnh than.

Các kháng sinh khác ức chế hoạt động của RNA polymerase trong quá trình sinh tổng hợp RNA từ DNA mạch khuôn. Một số kháng sinh bao gồm rifampin kết hợp mạnh mẽ với RNA polymerase của prokaryote nhưng ít ảnh hưởng đến RNA polymerase của eukaryote. Kết quả là rifampin độc với vi khuẩn gây bệnh hơn so với con người. Rifampin được sử dụng chủ yếu để điều trị bệnh lao do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây ra. Clofazimin gắn với DNA của vi khuẩn Mycobacterium leprae gây bệnh phong và làm cản trở quá trình sao chép cũng như phiên mã bình thường của tế bào vi khuẩn. Nó cũng được dùng để điều trị bệnh lao và các bệnh truyền nhiễm khác do các vi khuẩn họ Mycobacteriaceae gây nên.

Các kháng sinh khác lại hoạt động như các chất trao đổi bằng cách cản trở chức năng của các acid nucleic. Chúng được gọi là các chất tương đồng vì cấu trúc giống với các nucleotide cấu tạo nên các acid nucleic. Chính đặc điểm đó đã cho phép chúng kết hợp được với DNA và RNA của vi khuẩn gây bệnh, làm thay đổi cấu trúc của chúng và dẫn đến làm dừng quá trình sao chép, phiên mã, dịch mã. Các CKS này thường được dùng để điều trị các bệnh do virus gây ra.

1.1.5. Thực trạng kháng kháng sinh của các chủng VSV gây bệnh

Kháng kháng sinh (hay còn gọi là kháng thuốc) là tình trạng các VSV như vi khuẩn, virut, nấm và ký sinh trùng thay đổi cách thức làm cho các thuốc trị bệnh do chúng gây ra trở nên vô hiệu. Vi khuẩn kháng hầu hết kháng sinh gọi là vi khuẩn siêu kháng thuốc (superbug). Vấn đề kháng thuốc chẳng còn mới mẻ, nhưng nó đã trở nên nguy hiểm, cấp bách, đòi hỏi sự nỗ lực hợp nhất nhằm giúp nhân loại tránh quay ngược lại thời kỳ chưa có kháng sinh (năm 1942).

CKS đã được sử dụng rộng rãi trong việc phòng chống bệnh cho cây trồng, vật nuôi và bảo quản lương thực, thực phẩm ngay từ những năm 50 – 60 [51], [55]. Đến năm 1980 sản lượng CSK trên thế giới khoảng 25.000 tấn/năm. Trong đó sản lượng penicillin các loại là 17.000 tấn, tetracylin 5.000 tấn, ... [17]. Đến nay, nhiều vi khuẩn đã kháng với penicillin, do thuốc bị lạm dụng, sử dụng quá mức hay không đúng yêu cầu. Một số vi khuẩn không còn nhạy cảm với 8 hoặc 10 kháng sinh khác nhau. Bệnh lao, một thời bị streptomycin khống chế, nay đã trỗi dậy với đại dịch AIDS và giết hại khoảng 3 triệu người hàng năm. Hiện nay, muốn tránh được tình trạng kháng thuốc, cần phối hợp cả 2 hay 3 kháng sinh, hoặc phải liên tục có những kháng sinh mới. Tiếc rằng từ năm 1970 sáng kiến đã lụi dần.

Có nhiều yếu tố gây nên tình trạng kháng kháng sinh. Một trong những nguyên nhân kháng thuốc là việc sử dụng ồ ạt kháng sinh trong chăn nuôi để chữa bệnh và bổ sung với liều lượng thấp các thuốc kháng sinh vào thức ăn để thúc đẩy tăng trưởng gia súc. Năm 1974 Châu Âu đã cấm sử dụng penicillin, tetracylin và nhiều kháng sinh khác để nuôi thúc súc vật. Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh mới làm cho chúng ta đang phải đối mặt với thời kỳ “hậu kháng sinh” [50].

Ngày càng có nhiều chủng VSV kháng kháng sinh. Báo cáo của WHO cho thấy, mỗi năm trên thế giới ước tính có thêm 440.000 ca nhiễm mới bệnh lao đa kháng thuốc gây ít nhất 15.000 ca tử vong. Ở Việt Nam con số này là khoảng 5.900 ca nhiễm lao đa kháng thuốc gây tử vong ít nhất 1.800 ca mỗi năm. Nghiêm trọng hơn là lao siêu kháng đa thuốc đã xuất hiện ở 58 quốc gia. Hiện tượng kháng thuốc điều trị sốt rét, HIV, nhiễm khuẩn bệnh viện, nhiễm khuẩn thuông thường đang tăng lên nhanh chóng [54].

Với vi khuẩn E. coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm đường tiết niệu,...) có mức kháng cao tới 90% với kháng sinh Ampicillin, 80% với Cloramphericol và Ciprofloxacin.

Kháng kháng sinh hiện nay đang là vẫn đề lo ngại toàn cầu vì nó sẽ dẫn đến những hậu quả khôn lường đối với người bệnh và xã hội. Nó có thể gây tử vong khi mà các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn kháng thuốc gây ra không còn điều trị hiệu quả bởi các liệu pháp điều trị chuẩn. Khi đó mầm bệnh sẽ lây lan và phát tán nhanh chóng. Hiện tại, các VSV kháng thuốc đang làm suy yếu cuộc chiến chóng lại bệnh tật, như bệnh lao và bệnh sốt rét – những bệnh đã ngăn chặn được từ nhiều thập kỷ trước. Đồng thời các căn bệnh khác đã có từ lâu lại đang xuất hiện và có khả năng không có thuốc chữa. Đây là vấn đề của toàn xã hội. Các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới đã và đang nỗ lực hết sức để tìm ra những giải pháp cho vấn đề này.

Каталог: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá thực trạng và ĐỀ xuất giải pháP

tải về 329.51 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: