Trong nhiều quốc gia, bệnh lao bò là bệnh truyền nhiễm chính trên đàn bò, các thú vật thuần dưỡng khác, và một số quần thể hoang dã. Sự truyền lây sang người gây nên vấn đề sức khỏe cộng đồng

Để xét nghiệm tác động gây nhạy cảm, ba con chuột lang mà trước đó không sử dụng mọi chất liệu có thể gây cản trở xét nghiệm, được tiêm trong da mỗi con ba lần, với liều tương đương 500 IU của chế phẩm đem thử nghiệm, với thể tích 0,1 ml. Từng con chuột lang, cùng với nhóm đối chứng ba con khác không được tiêm, được tiêm vào trong da, lúc 21 ngày sau lần tiêm thứ nhất, với cùng liều lượng của cùng loại lao tố này. Các phản ứng của hai nhóm chuột lang sẽ không khác biệt đáng kể khi đo lúc 24 – 48 giờ sau.

Tính hiệu lực được xác định bằng so sánh với một chế phẩm tham chiếu của lao tố bò trong chuột lang đã được làm nhạy cảm với M. bovis.

Vào các năm 1970, các quốc gia trong nhóm mười quốc gia của Ủy ban Kinh tế Châu Âu (European Economic Community –EEC, hiện nay là EU) ghi nhận một tiêu chuẩn cho các lao tố HSCM. Tiêu chuẩn EEC này đặt ra một hiệu lực là 65.000 đơn vị lao tố theo quy định của Ủy ban lâm thời (provisional Community) trên mỗi ml.

Ngay từ những năm 1960, EEC đã ghi nhận một tiêu chuẩn EEC cho PPD của bò, mà cho ra một hiệu lực từ 50.000 đơn vị lao tố theo quy định của Ủy ban lâm thời trong mỗi mg PPD, và được đóng chai trong dạng tiềm sinh. Không may là số lượng của các chai đông khô này là không đủ theo yêu cầu của WHO và do đó cần phải có một chế phẩm PPD mới mà sẽ được thiết kế bởi WHO theo tiêu chuẩn mới đối với các lao tố PPD của bò.

Chuẩn PPD bò này đã được hiệu chỉnh so với chuẩn EEC hiện hành. Dựa vào các thử nghiệm cộng tác quốc tế, cả chuột lang lẫn bò, chuẩn này đã cho thấy có hiệu lực tương đương 65% với chuẩn của EEC. Do đó, vào năm 1986, quan chức WHO đưa ra tiêu chuẩn quốc tế cho các lao tố PPD bò là 32.500 IU/mg. Điều này tức là các đơn vị lao tố theo quy định của Ủy ban lâm thời là tương đương với các Đơn vị Quốc tế (IUs). Dược điển Châu Âu cũng đã ghi nhận tiêu chuẩn quốc tế của WHO cho PPD bò.

Để lưu giữ giống vi khuẩn thực tế của chuẩn quốc tế, điều cần thiết là các quốc gia mà có sản xuất lao tố PPD phải thiết lập cho mình các chế phẩm PPD bò dùng tham chiếu quốc gia mà tương đương với các tiêu chuẩn hiện hành. Các chế phẩm tham chiếu quốc gia này phải được hiệu chỉnh theo tiêu chuẩn chính thức quốc tế đối với PPD bò, kể cả trên chuột lang lẫn trên bò (28, 38, 42).

• Quá trình chuẩn hóa (standardisation) trên chuột lang (guinea-pig)

Chuột lang được tạo nhạy (sensitised) với một liều thấp (khoảng 0,001 đến 0,0001 mg khối lượng ướt) trực khuẩn sống của một dòng M. bovis lúc 5 – 7 tuần trước khi thử nghiệm lao tố. Trực khuẩn này được hòa tan trong nước muối sinh lý, tiêm vào sâu trong da 1 ml ở phía dưới của khoảng giữa của độ dày da. Vào thời điểm thử nghiệm, chuột lang đã bị nhiễm với liều thấp của M. bovis sẽ vẫn còn sức khỏe tốt và các kết quả của nhiều kiểm tra khám tử được thực hiện trong thời gian ngắn sau khi thử nghiệm chuẩn hóa, sẽ thể hiện thấy các con chuột lang không bị mắc bệnh lao và không thải tiết trực khuẩn lao.

Cách khác, tin cậy hơn, xét nghiệm về tính hiệu lực có thể được áp dụng mà không sử dụng mycobacteria sống có khả năng gây bệnh, xét nghiệm này thích hợp hơn cho các phòng thí nghiệm mà không có các khu vực cách ly để nuôi nhốt an toàn các con chuột lang được gây nhiễm. Xét nghiệm về tính hiệu lực này được thực hiện như sau: lao tố PPD đã được thử nghiệm trong các con chuột lang đã được tạo nhạy cảm một cách đồng đều đối với lao tố PPD bò chuẩn, bằng thử nghiệm tám điểm với bốn độ pha loãng tương ứng khoảng 20, 10, 5 và 2,5 IU. Thể tích tiêm là 0,1 ml. Trong thử nghiệm này, hai lao tố đem thử nghiệm được so sánh với lao tố chuẩn trên tám con chuột lang, áp dụng từng mũi tiêm trong da cho mỗi con chuột lang và sử dụng một thiết kế ô vuông Latin. Các chuột lang đều đã được làm nhạy với trực khuẩn M. bovis đã làm bất hoạt, vào 5 – 7 tuần trước khi thử nghiệm. Trực khuẩn được hòa tan trong dịch đệm và tạo thành huyễn dịch với phụ gia không hoàn toàn của Freund (Freund’s incomplete adjuvant). Thực hiện mũi tiêm sâu trong bắp thịt, nơi giữa của độ dày bắp thịt, với liều 0,5 ml.

Một thử nghiệm thích hợp đối với tính hiệu lực như sau: Các lao tố PPD đã chế tạo đã được thử nghiệm sinh học trên các chuột lang đã được tạo nhạy cảm bằng lao tố PPD chuẩn của bò, bằng một thử nghiệm sáu điểm với ba độ pha loãng cách nhau năm lần của từng lao tố. Các độ pha loãng của các chế phẩm lao tố được pha với dịch đệm chứa 0,0005% (w/v) polysobate 80 (Tween 80). Các thể tích 0,001, 0,0002 và 0,00004 mg protein lao tố, tương đương với chuẩn quốc tế của PPD lần lượt là 32, 6,4 và 1,28 IU, được sử dụng vì các lượng này cho ra khả năng đọc được kết quả phản ứng trên da. Thể tích tiêm là 0,2 ml. Trong một thử nghiệm, hai lao tố đem thử nghiệm được so sánh với lao tố chuẩn trong chín con chuột lang, thực hiện tám mũi tiêm trong da cho mỗi con chuột và áp dụng một thiết kế ô vuông Latin cân bằng không hoàn toàn (balanced incomplete Latin square design) (17).

Bình thường, việc đọc thử nghiệm tiến hành vào 24 giờ sau khi tiêm các lao tố, nhưng một lần đọc thêm có thể được thực hiện sau 48 giờ. Các thông số chênh lệch của nốt ban nổi lên được đo lường bằng thước kẹp (calliper), thể hiện bằng mm, và được ghi chép theo bảng thử nghiệm. Các kết quả được đánh giá theo thống kê, áp dụng các phương pháp thống kê chuẩn đối với các thử nghiệm song song như của Finney (17). Các hiệu lực tương ứng của hai lao tố đem xét nghiệm được tính toán với giới hạn độ tin cậy 95%, các chênh lệch của cấp số mũ của liều lượng (log dose) so với đường biểu đồ đáp ứng (response curves) cho từng chế phẩm (gia tăng ở từng phản ứng theo đơn vị gia tăng trong cấp số mũ của liều lượng) và các tỷ lệ F (F ratios) cho các độ lệch song song.

Theo Dược điển Châu Âu, hiệu lực ước tính đối với lao tố bò phải không dưới 66% và không quá 150% như được ghi trên nhãn.

• Quá trình chuẩn hóa lao tố bò (bovine tuberculin) trên bò

Theo báo cáo kỹ thuật của WHO số 384 (WHO Technical Report Series No. 384), xét nghiệm về tính hiệu lực sẽ được thực hiện trong các loài thú vật và dưới các điều kiện mà lao tố sẽ được sử dụng trên thực tế (42). Điều này tức là các lao tố bò sẽ được thử nghiệm trên các con bò đạ bị nhiễm thự nhiên. Do yêu cầu này khó thực hiện được, thủ tục xét nghiệm tính hiệu lực được thực hiện với chuột lang. Tuy nhiên, thử nghiệm theo giai đoạn trong bò bệnh lao là cần thiết và các chế phẩm chuẩn luôn luôn được hiệu chỉnh trên bò. Tần suất của xét nghiệm trên bò có thể được giảm di nếu ở đây có đảm bảo rằng các chế phẩm chuẩn là đại diện cho thủ tục phát hành của lao tố và các phương pháp sản xuất là đảm bảo.

Một thử nghiệm tính hiệu lực thích hợp cho lao tố bò trên bò như sau: Các lao tố đem thử nghiệm được thử nghiệm so với một lao tố PPD chuẩn của bò, bằng một thử nghiệm bốn điểm, sử dụng hai độ pha loãng cách nhau năm lần của từng lao tố. Theo chuẩn, 0,1 và 0,02 mg protein của lao tố (tuberculoprotein) được đem tiêm theo các thể tích tương ứng với khoảng 3250 và 650 IU nếu tiêu chuẩn quốc tế áp dụng đối với lao tố PPD của bò. Các lao tố đem thử nghiệm cũng được phaloãng như trên và sử dụng cùng khối lượng protein. Thể tích tiêm là 0,1 ml, và khoảng cách giữa các vị trí tiêm ở vùng giữa bên cổ là 15 – 20 cm. Trong một thử nghiệm, ba lao tố đem thử nghiệm được so sánh với lao tố chuẩn, trên tám con bò có nhạy cảm (tuberculuos cattle), áp dụng tám mũi tiêm trong da cho mỗi con, trên cả hai bên cổ, và áp dụng thiết kế ô vuông Latin hoàn chỉnh (balanced complete Latin square design). Độ dày da ở vị trí của từng mũi tiêm được đo lường với thước kẹp, thể hiện bằng mm, đo càng chính xác càng tốt lúc trước khi tiêm và 72 giờ sau khi tiêm (24).

Các kết quả được đánh giá theo thống kê, sử dụng cùng phương pháp chuẩn cho các thử nghiệm song song như áp dụng trong các thử nghiệm về tính hiệu lực trên chuột lang.

Một thử nghiệm thích hợp cho tính đặc hiệu như sau: ba lao tố bò đem xét nghiệm được thử nghiệm với chuẩn đối với lao tố PPD của gia cầm (hay ba lao tố gia cầm đem xét nghiệm so với chuẩn của lao tố PPD của bò), bằng một thử nghiệm bốn điểm trong chuột lang đã được tạo nhạy cảm đồng đều, bao gồm hai độ pha loãng ở các khoảng cách gấp 25 lần của từng lao tố. Các lượng 0,03 mg và 0,0012 mg của protein lao tố đem xét nghiệm, tương ứng với 1.500 và 60 IU, được chọn vì liều lượng này cho ra các phản ứng da có thể đọc được. Các liều lượng tiêm của lao tố chuẩn là thấp, từ 0,001 đến 0,0004 mg. Trong một thử nghiệm, ba lao tố đem thử nghiệm được so sánh với lao tố chuẩn trong tám con chuột lang, bằng thực hiện támmũi tiêm trong da cho mỗi con và áp dụng thiết kế ô vuông Latin cân bằng đều. Việc đọc các kết quả và đánh giá thống kê giống như với xét nghiệm về tính hiệu lực.

Với điều kiện là các lao tố phù hợp với các tiêu chuẩn quy định về sản xuất và được bảo quản ở nhiệt độ từ 2^oC đến 8^oC và được bảo vệ tránh ánh sáng, chúng có thể sử dụng cho đến hết thời hạn được chỉ định trong cấp phép đối với sản xuất lao tố. Để bảo quản lâu dài, khuyên rằng giữ PPD trong dạng cô đậm hơn là dạng đã pha loãng và dạng cô đậm cũng phải được bảo quản trong tối.

Độ pH sẽ từ 6,5 đến 7,5.

Hàm lượng protein được xác định như nêu trong Đoạn C.3 Kiểm soát trong quá trình sản xuất.

Trong quá trình bảo quản, lao tố bò dạng lỏng sẽ được bảo vệ tránh ánh sáng và đặt trong nhiệt độ 5 ± 3^oC. Việc đông lạnh sản phẩm dạng lỏng có thể làm hại cho chất lượng. Tuy nhiên, các chế phẩm đông khô có thể được sản xuất và có thể được bảo quản ở nhiệt độ cao hơn (nhưng không quá 25^oC) và được bảo vệ tránh ánh sáng. Các giai đoạn phơi ra với nhiệt độ cao hay trực tiếp với ánh sáng mặt trời phải được giữ ở mức tối thiểu.

Các chất bảo quản kháng sinh hya các chất khác có thể được thêm vào lao tố, phải thể hiện không ảnh hưởng đến tính an toàn và hiệu quả của sản phẩm.

Hàm lượng tối đa cho pháp đối với phenol là 0,5% (w/v), và với glycerol là 10% (v/v).

k) Các cảnh báo (các nguy cơ)

Kinh nghiệm ở cả người lẫn thú vật cho thấy rằng lao tố đã được pha thích hợp, được tiêm trong da, dẫn đến phản ứng cục bộ nơi tiêm mà không ảnh hưởng toàn thân. Kể cả với những cá thể rất nhạy cảm, các phản ứng nặng nề, toàn thân là cực kỳ hiếm và thường có giới hạn. Nhưng kinh nghiệm cũng cho thấy các nhân viên quá mẫn (hypersensitive operator) có thể gây ra các dấu hiệu toàn tuân sau khi bị tai nạn tiếp xúc trong da (vết thương kim tiêm). Các nhân viên này sẽ được khuyên không thực hiện xét nghiệm thử lao tố trong da với liều cao từ 2.000 – 5.000 IU lao tố, với khoảng 1.000 lần liều lượng của người từ 5 IU.

Một xét nghiệm đối với không có độc tính hay các đặc tính kích ứng phải được thực hiện (xem Đoạn C.4.b).

Tính hiệu lực của lao tố phải được ước tính bằng các phương pháp sinh học. Các phương pháp này phải được áp dụng cho các lao tố HCSM và PPD; các xét nghiệm này dựa vào so sánh các lao tố sẽ đem thử nghiệm với một chế phẩm chuẩn tham chiếu của cùng loại (cũng xem Đoạn C.4.d).

1. ANGUS R.D. (1978). Production of reference PPD tuberculins for veterinary use in the United States. J. Biol. Stand., 6, 221.

2. ANIMAL HEALTH DIVISION (NEW ZEALAND) (1986). Possum research and cattle tuberculosis. Surveillance, 13, 18–38.

3. ARANAZ A., COUSINS D., MATEOS A. & DOMINIGUEZ L. (2003). Elevation of Mycobacterium tuberculosis subsp. caprae Aranaz et al. 1999 to species rank as Mycobacterium caprae comb. nov., sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 53, 1785–1789.

4. BENGIS R.G., KRIEK N.P.J., KEET D.F., RAATH J.P., DE VOS V. & HUCHZERMEYER H.F.A.K. (1996). An outbreak of tuberculosis in a free-living African buffalo (Syncerus caffer, Sparrman) population in the Kruger National Park: A preliminary report. Onderstepoort J. Vet. Res., 63, 15.

5. BUDDLE B.M., RYAN T.J., POLLOCK J.M., ANDERSON P. & DE LISLE G.W. (2001). Use of ESAT-6 in the interferon-gamma test for diagnosis of bovine tuberculosis following skin testing. Vet. Microbiol., 80, 37–46.

6. CLIFTON-HADLEY R.S. & WILESMITH J.W. (1991). Tuberculosis in deer: a review. Vet. Rec., 129, 5–12.

7. COUSINS D.V. (2001). Mycobacterium bovis infection and control in domestic livestock. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 20, 71–85.

8. COUSINS D.V., BASTIDA R., CATALDI A., QUSE V., REDROBE S., DOW S., DUIGNAN P., MURRAY A., DUPONT C., AHMED A., COLLINS D.M., BUTLER W.R., DAWSON D., RODRIGUEZ D., LOUREIRO J., ROMANO M.I., ALITO A., ZUMARRAGA M. & BERNARDELLI A. (2003). Tuberculosis in seals caused by a novel member of the Mycobacterium tuberculosis complex: Mycobacterium pinnipedii sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 53, 1305–1314.

9. COUSINS D.V. & FLORISSON N. (2005). A review of tests available for use in the diagnosis of tuberculosis in non-bovine species. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 24 (3) .

10. COUSINS D.V., FRANCIS B.R. & GOW B.L. (1989). Advantages of a new agar medium in the primary isolation of Mycobacterium bovis. Vet. Microbiol., 20, 89–95.

11. COUSINS D.V., SKUCE R.A., KAZWALA R.R. & VAN EMBDEN J.D.A. (1998). Towards a standardized approach to DNA fingerprinting of Mycobacterium bovis. Int. J. Tuberc. Lung Dis., 2, 471–478.

12. DE LISLE G.W., MACKINTOSH C.G. & BENGIS R.G. (2001). Mycobacterium bovis in free-living and captive wildlife, including farmed deer. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 20, 86–111.

13. DURR P.A., CLIFTON-HADLEY R.S. & HEWINSON R.G. (2000). Molecular epidemiology of bovine tuberculosis. II. Applications of genotyping. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 19, 689–701.

14. DURR P.A., HEWINSON R.G. & CLIFTON-HADLEY R.S. (2000). Molecular epidemiology of bovine tuberculosis. I. Mycobacterium bovis genotyping. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 19, 675–688.

15. ESPINOSA DE LOS MONTEROS L.E., GALAN J.C., GUTIERREZ M., SAMPER S., GARCIA MARIN J.F., MARTIN C., DOMINGUEZ L., DE RAFAEL L., BAQUERO F., GOMEZ-MAMPASO E. & BLAZQUEZ J. (1998). Allele-specific PCR method based on pncA and oxyR sequences for distinguishing Mycobacterium bovis from M. tuberculosis: intraspecific M. bovis pncA sequence polymorphism. J. Clin. Microbiol., 36, 239–242.

16. EUROPEAN UNION. Directive 80/219, amending Directive 64/432, Annex B.

17. FINNEY D.J. (1964). Statistical Methods in Biological Assays, Second Edition. Charles Griffin, London, UK.

18. FROTHINGHAM R. & MEEKER-O’CONNELL W.A. (1998). Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandom. Microbiology, 144, 1189–1196.

19. GORMLEY E., DOYLE M.B., FITZSIMONS T., MCGILL K. & COLLINS J.D. (2006). Diagnosis of Mycobacterium bovis infection in cattle by use of the gamma-interferon (Bovigam) assay. Vet. Microbiol., 112 (2–4), 171–179.

20. GRIFFIN J.F.T., CROSS J.P., CHINN D.N., ROGERS C.R. & BUCHAN G.S. (1994). Diagnosis of tuberculosis due to M. bovis in New Zealand red deer (Cervus elaphus) using a composite blood test (BTB) and antibody (ELISA) assays. N. Z. Vet. J., 42, 173–179.

21. GRIFFIN J.F.T., HESKETH J.B., MACKINTOSH C.G., SHI Y.E. & BUCHAN G.S. (1993). BCG vaccination in deer: distinctions between delayed type hypersensitivity and laboratory parameters of immunity. Immunol. Cell Biol., 71, 559–570.

22. HAAGSMA J. (1993). Working Paper on Recent Advances in the Field of Tuberculosis Control and Research. World Health Organization Meeting on Zoonotic Tuberculosis with Particular Reference to Mycobacterium bovis, 15 November 1993, Geneva, Switzerland.

23. HAAGSMA J. & ANGUS R.D. (1994). Tuberculin production. In: Mycobacterium bovis Infections in Humans and Animals, Steele J.H. & Thoen C.O., eds. Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA.

24. HAAGSMA J., O’REILLY L.M., DOBBELAAR R. & MURPHY T.M. (1984). A comparison of the relative potencies of various bovine PPD tuberculins in naturally infected tuberculous cattle. J. Biol. Stand., 10, 273.

25. HEIFETS L.B. & JENKINS P.A. (1998). Speciation of Mycobacterium in clinical laboratories. In: Mycobacteria I. Basic Aspects, Gangadharam P.R. & Jenkins P.A., eds. Chapman and Hall, New York, USA, 308–350.

26. HUARD R.C., DE OLIVEIRA LAZZARINI L.C., BUTLER W.R., VAN SOOLINGEN D. & HO J.L. (2003). PCR-based method to differentiate the subspecies of the Mycobacterium tuberculosis complex on the basis of genomic deletions. J. Clin. Microbiol., 41 (4), 1637–1650.

27. KAMERBEEK J., SCHOULS L., KOLK A., VAN AGTERVELD M., VAN SOOLINGEN D., KUIJPER S., BUNSCHOTEN A., MOLHUIZEN H., SHAW R., GOYAL M. & VAN EMBDEN J. (1997). Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J. Clin. Microbiol., 35, 907–914.

28. MAXILD J., BENTZON M.W., MOLLER S. & ZACHARIASSEN P. (1976). Assays of different tuberculin products performed in guinea pigs. J. Biol. Stand., 4, 171.

29. MILLER J., JENNY A., RHGYAN J., SAARI D. & SAUREZ D. (1997). Detection of Mycobacterium bovis in formalinfixed, paraffin-embedded tissues of cattle and elk by PCR amplification of an IS6110 sequence specific for M. tuberculosis complex organisms. J. Vet. Diagn. Invest., 9, 244–249.

30. MILLER J., JENNY A. & PAYEUR J. (2002). Polymerase chain reaction detection of Mycobacterium bovis and M. avium organisms in formalin-fixed tissues from culture-negative organisms. Vet. Micro., 2328, 1–9.

31. NOREDHOEK G.T., VAN EMBDEN J.D.A. & KOLK A.H.J. (1996). Reliability of nucleic acid amplification for detection of Mycobacterium tuberculosis: an international collaborative quality control study among 30 laboratories. J. Clin. Microbiol., 34, 2522–2525.

32. NIEMANN S., HARMSEN D., RUSCH-GERDES S. & RICHTER E. (2000). Differentiation of clinical Mycobacterium tuberculosis complex isolates by gyrB DNA sequence polymorphism analysis. J. Clin. Microbiol., 38 (9), 3231–3234.

33. O’BRIAN R., DANILOWICZ B.S., BAILEY L., FLYNN O., COSTELLO E., O’GRADY D. & RODGERS M. (2000). Characterisation of the Mycobacterium bovis restriction fragment length polymorphism DNA probe pUCD and performance comparison with standard methods. J. Clin. Microbiol., 38, 3362–3369.

34. O’REILLY L.M. & DABORN C.J. (1995). The epidemiology of Mycobacterium bovis infections in animals and man: a review. Tubercle Lung Dis. (Supple. 1), 76, 1–46.

35. PARSONS L.M., BROSCH R., COLE S.T., SOMOSKOVI A., LODER A., BRETZEL G., VAN SOOLINGEN D., HALE Y.M. & SALFINGER M. (2002). Rapid and simple approach for identification of Mycobacterium tuberculosis complex isolates by PCR-based genomic deletion analysis. J. Clin. Microbiol., 40 (7), 2339–2345.

36. PRODINGER W.M., BRANDSTATTER A., NAUMANN L., PACCIARINI M., KUBICA T., BOSCHIROLI M.L., ARANAZ A., NAGY G., CVETNIC Z., OCEPEK M., SKRYPNYK A., ERLER W., NIEMANN S., PAVLIK I. & MOSER I. (2005). Characterization of Mycobacterium caprae isolates from Europe by mycobacterial interspersed repetitive unit genotyping. J. Clin. Microbiol., 43, 4984–4992.

37. RYAN T.J., BUDDLE B.M. & DE LISLE G.W. (2000). An evaluation of the gamma interferon test for detecting bovine tuberculosis in cattle 8 to 28 days after tuberculin skin testing. Res. Vet. Sci., 69, 57–61.

38. SCHNEIDER W., DOBBELAER R., DAM A., JORGENSEN J.B., GAYOT G., AUGIER J., HAAGSMA J., REES W.H.G., LESSLIE I.W. & HEBERT C.N. (1979). Collaborative assay of EEC standards for bovine tuberculins. J. Biol. Stand., 7, 53.

39. SKINNER M.A., WEDLOCK D.N. & BUDDLE B.M. (2001). Vaccination of animals against Mycobacterium bovis. Mycobacterial Infections in Domestic and Wild Animals. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 20, (in press).

40. SKUCE R.A., BRITTAIN D, HUGHES M.S. & NEILL S.D. (1996). Differentiation of Mycobacterium bovis isolates from animals by DNA typing. J. Clin. Microbiol., 38, 2469–2474.

41. WILESMITH J.W. (1991). Epidemiological methods for investigating wild animal reservoirs of animal disease. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 10, 205–214.

42. WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO) (1987). Requirements for Biological Substances No. 16, Annex 1: Requirements for Tuberculins. Technical Report Series No. 745, WHO, Geneva, Switzerland, 31–59.

43. WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO)/FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (FAO)/OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (OIE) (1994). Report on Consultation on Animal Tuberculosis Vaccines. WHO, Veterinary Public Health Unit, Geneva. WHO/CDS/VPH/94.138.