TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
tải về 119.67 Kb.
|
| ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------- Bùi Thị Khánh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------ Bùi Thị Khánh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM Mã số: 60420114 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa Hà Nội – 2015
Trong hầu hết các tế bào, ty thể là bào quan quan trọng đảm nhiệm chức năng cung cấp năng lượng dưới dạng ATP cho các hoạt động của tế bào. Ty thể sản xuất năng lượng bằng cách oxy hóa hoàn toàn các hợp chất trung gian của quá trình chuyển hóa thức ăn của cơ thể tạo thành sản phẩm cuối cùng là H2O, CO2, và năng lượng dưới dạng ATP. Ty thể có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với hệ gen nhân. DNA ty thể người tồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thước 16.569 bp, với 37 gen, mã hóa cho 2 RNA ribosome, 22 RNA vận chuyển và 13 protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp. DNA ty thể dễ bị tổn thương do ty thể là môi trường giàu dạng oxy phản ứng và thiếu cơ chế sửa chữa hiệu quả dẫn đến nhiều đột biến xuất hiện trong hệ gen ty thể. Hầu hết các hoạt động của tế bào đều dựa vào nguồn năng lượng ổn định do ty thể cung cấp, do đó những sai hỏng trong DNA ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống ảnh hưởng đến nhiều tế bào, mô và các tổ chức khác nhau. Năm 1988, Wallace và tập thể đã công bố đột biến điểm đầu tiên trên hệ gen ty thể người gây bệnh liên quan đến thần kinh thị giác di truyền theo Leber (Leber’s hereditary optic neuropathy - LHON). Cho đến nay, hơn 300 đột biến khác nhau trong hệ gen ty thể người đã được xác định, trong đó có hơn 250 đột biến có khả năng gây bệnh và kèm theo nhiều hội chứng khác nhau. MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) là hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không đều, ảnh hưởng đến hệ thần kinh và cơ xương cũng như các hệ thống khác của cơ thể, gây nên bởi những đột biến trên gen MT-TK của DNA ty thể. Ngoài ra, người mang hội chứng MERRF có thể kèm theo động kinh, mất điều hòa vận động, suy nhược và mất trí nhớ. Triệu chứng thường khởi phát ở trẻ em sau một giai đoạn phát triển bình thường, kết quả hay gặp là điếc, thấp bé, thoái hóa thần kinh thị giác, đôi khi quan sát được các u mỡ khu trú dưới da. Tế bào cơ bất thường và xuất hiện sợi cơ màu đỏ bị xé rách nham nhở khi nhuộm với Gomori trichrome và quan sát dưới kính hiển vi. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hội chứng MERRF để xác định nguyên nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng như tính di truyền của bệnh. Tuy nhiên, do tính phức tạp trong tác động lâm sàng, mô bệnh học, cơ chế phát sinh và biểu hiện bệnh nên việc chẩn đoán bằng phương pháp thăm khám lâm sàng hay bằng các xét nghiệm thường quy là rất khó khăn, vì thế nhiều bệnh nhân MERRF vẫn chưa được phát hiện và không có phương pháp điều trị hiệu quả. Ở Việt Nam, gần như chưa có công trình nào đi sâu nghiên cứu phát hiện và định lượng đột biến MERRF ở người Việt Nam. Nhằm góp phần vào việc chẩn đoán, điều trị và tư vấn di truyền đối với các bệnh nhân, gia đình bệnh nhân mang hội chứng MERRF chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều - MERRF ở người Việt Nam“. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Ty thể là bào quan phổ biến được tìm thấy trong hầu hết các tế bào nhân chuẩn. Chức năng chính của ty thể là cung cấp năng lượng hóa học cần thiết cho các hoạt động sinh tổng hợp và vận động của tế bào. Ty thể được lần đầu tiên tìm thấy trong tế bào cơ năm 1857 bởi nhà giải phẫu học người Thụy Sĩ, Kollier. Đến năm 1890, nhà mô học người Đức, Richard Altmann, bằng phương pháp nhuộm fuchsine đã quan sát được ty thể ở nhiều tế bào khác nhau dưới kính hiển vi quang học.Ty thể có đường kính khoảng 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm. Về cấu trúc, ty thể có cấu tạo dạng màng kép, gồm màng trong và màng ngoài, bao lấy khối chất nền bên trong, khoảng cách giữa hai màng được gọi là xoang gian màng. Cả hai màng đều có bản chất là lipoprotein tương tự như màng sinh chất, nhưng có sự khác biệt về hình dạng và các tính chất lý hóa chuyên trách cho việc thực hiện các chức năng sinh hóa của chúng.
1.1.2.1. Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bàoTy thể đóng vai trò trung tâm trong quá trình chuyển hóa năng lượng của tế bào. Quá trình hô hấp biến đổi hóa học và trao đổi chất tại ty thể đã giúp chúng chuyển đổi năng lượng hóa học tiềm tàng trong các hợp chất hữu cơ tạo ra CO2, H2O và giải phóng năng lượng vào phân tử cao năng ATP. ATP là nguồn năng lượng lớn được sử dụng cho tất cả các quá trình trao đổi chất cần thiết bên trong tế bào. Vì vậy, khi ty thể bị tổn thương, quá trình sản sinh ra năng lượng bị chậm lại, thậm chí là ngừng lại hoàn toàn. Pyruvate không được chuyển hóa tiếp, nên bị biến đổi thành lactate, vì vậy các bệnh nhân bị bệnh ty thể thường có hàm lượng lactate trong máu và trong dịch não tủy cao. Do gần như tất cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lượng ổn định do ty thể cung cấp nên khi ty thể bị tổn thương có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống, ảnh hưởng đến nhiều loại tế bào cũng như mô và các cơ quan. 1.1.2.2. Ty thể và quá trình lão hóaLão hóa là một quá trình sinh học phức tạp, là yếu tố nguy cơ lớn cho sự phát triển của ung thư, thoái hóa thần kinh và các bệnh tim mạch. Cơ chế phân tử của sự lão hóa là vấn đề phức tạp, tuy nhiên quá trình oxy hóa và nitrate hóa protein trong tế bào đã được đề xuất là cơ sở cho việc suy giảm chức năng của tế bào và làm giảm khả năng chống chịu của cơ thể. ROS được cho là tác nhân chính gây ra những tổn thương sinh lý của tế bào. Sự tích lũy ROS và các tác nhân oxy hóa có liên quan đến nhiều bệnh lý, bao gồm các bệnh thoái hóa thần kinh, tiểu đường, ung thư và lão hóa sớm. ROS và các gốc tự do gây ra các đột biến gen, tăng sự hình thành và tích lũy các đột biến DNA ty thể ở các mô trong quá trình lão hóa. 1.1.2.3. Ty thể và quá trình tự chết theo chương trình của tế bàoTy thể đóng vai trò cốt lõi trong việc điều tiết sự chết của tế bào bằng cách cung cấp nhiều yếu tố quan trọng bao gồm cả sự hoạt hóa caspase và phân mảnh nhiễm sắc thể. Ty thể có vai trò quan trọng trong cơ chế tích tụ Ca2+ và rối loạn quá trình oxy hóa, sự tích lũy lượng Ca2+ đủ lớn trong ty thể dẫn đến chết theo chương trình của tế bào. Những rối loạn chức năng của ty thể gây ra bởi sự sai hỏng DNA và các yếu tố làm tổn thương gen dẫn đến một kết quả chắc chắn là sự chết tế bào theo chương trình.
1.1.3.1. Hệ gen ty thểTy thể là bào quan có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với gen nhân. DNA ty thể người tồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thước 16.569 bp, gồm 37 gen mã hóa cho 2 phân tử ARN ribosome, 22 phân tử ARN vận chuyển và 13 phân tử protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp. ND1-ND6 và ND4L mã hóa 7 tiểu đơn vị của phức hợp (NADH-ubiquinone oxidoreductase), Cyt b là tiểu đơn vị phức hợp III chỉ được mã hóa bởi mtDNA (ubiquinol cytochrome c oxidase reductase), COX 1-3 mã hóa cho 3 tiểu đơn vị của phức hợp V (ATP synthase). Các phân tử protein còn lại của chuỗi hô hấp được mã hóa bởi gen nhân, được dịch mã trong tế bào chất, sau đó được vận chuyển vào bên trong ty thể Đặc biệt, so với hệ gen nhân, hệ gen ty thể chứa rất ít trình tự không mã hóa xen kẽ với vùng mã hóa. D-loop nằm giữa gen tRNAPhe (gen MT-TK) và tRNAPro (gen MT-TP) là vùng không mã hóa lớn nhất và có vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình sao chép và phiên mã của hệ gen ty thể, chứa promoter cho sự phiên mã chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L), chứa điểm khởi đầu của quá trình tái bản. Hai gen mã hóa cho rRNA (12S và 16S rRNA) và 22 gen mã hóa cho 22 tRNA được nằm giữa các gen mã hóa cho protein. Các gen này cung cấp các RNA cần thiết cho sự tổng hợp protein bên trong ty thể.
1.1.3.2. Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thểSự di truyền của các gen trên mtDNA là sự di truyền qua tế bào chất. Giống như các DNA ngoài nhân, DNA ty thể được di truyền theo dòng mẹ, người mẹ truyền gen ty thể cho các con, nhưng chỉ con gái của bà mới có thể truyền các kiểu gen này cho thế hệ tiếp theo. Cơ chế di truyền này được lý giải bởi tế bào trứng của người phụ nữ trung bình chứa khoảng 100.000 phân tử DNA ty thể, trong đó một tinh trùng khỏe mạnh chỉ chứa trung bình 100 - 1500 phân tử, mặt khác sự suy thoái của mtDNA trong đường sinh dục nam và sự phá hủy mtDNA của tinh trùng khi vào tế bào trứng là rất rõ ràng nên mtDNA trong tế bào hợp tử thường chỉ được thừa hưởng từ trứng. 1.1.3.3. Tính chất không đồng nhất và tốc độ đột biến của ty thểMỗi tế bào có thể chứa hàng ngàn bản sao DNA. Vì vậy, khi xuất hiện đột biến thì trong cùng một mô có thể có cả mtDNA bình thường và mtDNA đột biến, hiện tượng này được gọi là tính không đồng nhất (Heteroplasmy). Nếu các bản sao của mtDNA đều giống nhau thì được gọi là đồng nhất giữa các bản sao ty thể (Homoplasmy). Số bản sao mtDNA đột biến so với tổng lượng mtDNA của tế bào sẽ xác định mức độ heteroplasmy, là một nhân tố quyết định mức độ nghiêm trọng của bệnh. Đa số các đột biến mtDNA gây bệnh đều tồn tại ở dạng heteroplasmy. Những hiểu biết về mức độ dị plasmid của người mang đột biến là thông số quan trọng để có thể tiên lượng được tình trạng bệnh lý và sự di truyền của đột biến gen ty thể. mtDNA có tốc độ đột biến cao gấp 10 - 20 lần so với DNA trong nhân, do hệ gen ty thể ở dạng trần (không liên kết với các protein bảo vệ kiểu histone như hệ gen nhân), không chứa trình tự intron, hệ gen ty thể dễ tiếp xúc với các gốc tự do. Ngoài ra, ty thể không có cơ chế sửa chữa DNA hiệu quả như với DNA trong nhân. Hiện nay, đã có nhiều đột biến gen ty thể gây bệnh được phát hiện và nghiên cứu. Các đột biến gen ty thể này thường gây ra các triệu chứng khác nhau, tuy nhiên chủ yếu tập trung vào cơ, thần kinh và các chuyển hóa của cơ thể.
Đột biến điểm là đột biến thay thế, mất hoặc thêm một nucleotide xảy ra trong cấu trúc của gen tại một điểm trên phân tử DNA. Hơn 250 đột biến điểm gây bệnh đã được xác định trên gen ty thể qua các bệnh nhân với hàng loạt các rối loạn khác nhau, thường di truyền từ mẹ sang con và liên quan đến nhiều hệ thống cơ quan. Đột biến điểm trên mtDNA có thể xảy ra trên gen mã hóa tRNA, rRNA hay protein, tuy nhiên hơn một nửa trong số các đột biến điểm được báo cáo liên quan đến gen tRNA của ty thể. tRNA ty thể có cấu trúc ngắn hơn và khác biệt với tRNA trong tế bào chất (mã hóa bởi gen nhân) nên sự sai khác về 1 nucleotide dẫn đến thay đổi dạng hình L của tRNA, ảnh hưởng đến cấu trúc bậc ba của chúng. Một số đột biến trên tRNA ty thể dẫn đến những khiếm khuyết trên phức hợp OXPHOS. Tùy thuộc vào điểm đột biến trên gen tRNA ty thể sẽ ảnh hưởng đến các kênh vận chuyển điện tử khác nhau trong chuỗi hô hấp tế bào. Các nguyên nhân gây ra khiếm khuyết trong quá trình tổng hợp các tRNA ty thể là rất nhiều bao gồm: kết thúc phiên mã, biến đổi tRNA trưởng thành, thay đổi bộ ba đối mã, ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của tRNA do đó giảm khả năng gắn acid amin, giảm liên kết với các yếu tố dịch mã mtEFT hoặc các ribosome ty thể. Đột biến điểm ở gen mã hóa protein ty thể đặc biệt ảnh hưởng đến các chức năng của phức hợp chuỗi hô hấp tế bào mà nó đảm nhiệm. Đột biến điểm trên mtDNA chủ yếu ở dạng không đồng nhất (heteroplasmy), tỷ lệ đột biến giữa các mô trong cùng một cá thể cũng rất khác nhau. Một số đột biến gen ty thể ở dạng đồng nhất (homoplasmy) đang được nghiên cứu nhiều hơn, đột biến này thường ảnh hưởng đến các mô xác định và có biểu hiện lâm sàng đặc trưng. Tuy nhiên, đột biến điểm gen ty thể rất đa hình nên việc xác định tỷ lệ đột biến gen gây bệnh ty thể là vấn đề cần được nghiên cứu nhiều hơn nữa.
Đột biến cấu trúc gen ty thể bao gồm mất đoạn, lặp đoạn và một số sự sắp xếp cấu trúc phức tạp khác đã được nghiên cứu gắn với tình trạng bệnh lý. Phần lớn đột biến cấu trúc mtDNA được phát hiện liên quan đến mất đoạn, thay đổi kích thước khoảng 1,3 - 8 kb hay một vài gen. Đột biến mất đoạn mtDNA thường xảy ra ở giai đoạn sớm trong quá trình phát triển của hợp tử dẫn đến tần số xuất hiện và biểu hiện bệnh ở các mô là tương tự nhau. Kích thước đoạn mtDNA bị mất có thể do đột biến gen nhân quy định việc duy trì, sao chép và trao đổi nucleotide trong mtDNA (ví dụ, POLG và PEO1 mã hóa Twinkle).
Năm 1973, một nhóm bệnh nhân mắc bệnh ty thể có triệu chứng lâm sàng liên quan đến động kinh, giật cơ lần đầu tiên được mô tả. Sau đó các trường hợp khác tiếp tục được mô tả, Fukuhara và cộng sự đã đưa ra các tính năng cơ bản của bệnh bao gồm: giật cơ, động kinh kết hợp với sợi cơ không đều được gọi là hội chứng MERRF. Bệnh nhân MERRF được chẩn đoán bởi các tiêu chí: rung giật cơ, động kinh, thất điều tiểu não, sinh thiết cơ cho thấy sợi cơ đỏ bị rách. Mặc dù đó là những biểu hiện chính nhưng thực tế lâm sàng tìm thấy nhiều bệnh nhân MERRF có triệu chứng không đồng nhất, có thể gặp bệnh nhân điếc, không chịu được vận động, mất trí nhớ, u mỡ đối xứng, bệnh sắc tố võng mạc. Hội chứng lần đầu tiên được mô tả là do đột biến A8344G trên gen mã hóa cho tRNALys của ty thể. Nguyên nhân phổ biến của hội chứng MERRF là do đột biến A8344G, T8356C và G8363A nằm trên gen MT-TK mã hóa cho tRNALys gây ra, tất cả đột biến đều tồn tại ở dạng không đồng nhất. Đột biến A8344G là phổ biến nhất, chiếm 80-90% số ca mang hội chứng MERRF. MERRF cũng được mô tả ở bệnh nhân bị mất đoạn mtDNA.
1.3.1.1. Đột biến A8344GĐột biến A8344G là phổ biến nhất, chiếm 80 - 90% số ca mang hội chứng MERRF. Sự thay đổi nucleotide A thành G tại vị trí 8344 trên gen MT-TK của ty thể làm thay đổi bộ ba mã hóa trên tRNAlys, do đó giảm khả năng tương tác với bề mặt ribosome. Đột biến tại vùng này ảnh hưởng đến sự hợp nhất của dư lượng lysine vào protein ty thể, làm suy yếu tổng hợp protein và gây ra các rối loạn chức năng của chuỗi hô hấp trong ty thể. Từ đó, ty thể giảm hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa, đặc biệt là các phức hợp I (NADH dehydrogenase) và IV (cytochrome c oxidase). Đột biến A8344G được di truyền độc lập từ mẹ sang con và thường tồn tại ở dạng không đồng nhất, nhưng mức độ phân bố của thể đột biến rất khác nhau giữa các cá thể và các mô trong cùng một cá thể. 1.3.1.2. Đột biến T8356CHội chứng MERRF thường được biết đến với đột biến A8344G, nhưng không quan sát thấy trong khoảng 10 - 20% số bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng tiêu biểu của hội chứng MERRF. Một nghiên cứu giải trình tự gen tRNAlys của năm bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng được xác định là rung giật cơ (hoặc động kinh), mất điều hòa và sợi cơ đỏ bị rách nham nhở, tiền sử gia đình tương thích với sự kế thừa bệnh từ mẹ, nghiên cứu tiền lâm sàng thấy tăng hàm lượng acid lactic, sinh thiết cơ cho thấy nhiều sợi cơ đỏ bị xé rách. Kết quả cho thấy có sự thay đổi nucleotide tại vị trí 8356 từ T chuyển thành C, làm gián đoạn một cặp base được bảo tồn trong phân tử mtDNA gốc. Mở rộng nghiên cứu về mức độ biểu hiện của bệnh cho thấy đột biến T8356C cũng tồn tại ở dạng không đồng nhất nhưng sự phân bố của gen đột biến cũng rất khác nhau. 1.3.1.3. Đột biến G8363ANăm 1996, nhóm nghiên cứu Filippo M. Santorelli và cộng sự đã sử dụng phương pháp phân tích đa dạng cấu hình DNA sợi đơn (SSCP) và giải trình tự trực tiếp của tất cả 22 gen tRNA mã hóa mtDNA để phát hiện tình trạng đột biến trong 9 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng tương tự như hội chứng MERRF bao gồm tăng acid lactic và pyruvic trong máu, rối loạn thần kinh ngoại biên, thất điều não, giảm thính lực, sinh thiết cơ cho thấy các sợi cơ đỏ bị xé rách. Kết quả cho thấy cả 9 bệnh nhân trong 2 gia đình đều mang đột biến thay đổi nucleotide A bằng G tại vị trí 8363 trên mtDNA. Phân tích RFLP cho thấy rằng đột biến tồn tại ở dạng không đồng nhất và có mức độ phân bố ở các mô khác nhau như ở cơ là 95%, ở máu là 59 - 94%. Sự khiếm khuyết một hay nhiều phần của chuỗi phản ứng phosphoryl hóa (OXPHOS) trong quá trình trao đổi chất ở tế bào cơ của bệnh nhân mang đột biến G8363A gây ra sự suy giảm tổng hợp protein của ty thể, do đột biến nằm trên gen tRNAlys. Sự thiếu hụt lysine sẽ ảnh hưởng đến các tiểu đơn vị trong chuỗi hô hấp của tế bào, ảnh hưởng trực tiếp đến phức hợp I và phức hợp IV của chuỗi hô hấp. Nghiên cứu sâu hơn cho thấy sự hiện diện của các peptid bất thường trong nguyên bào sợi da của một bệnh nhân mang đột biến G8363A. Những biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến A8363G cũng không đồng nhất, ở một số bệnh nhân có triệu chứng tâm thần chậm phát triển, mất thính giác, nhiều u mỡ,... được chẩn đoán giống hội chứng Leigh. Những tác động của hội chứng MERRF lên bệnh nhân là khá đa dạng, phức tạp và không đồng nhất. Các rối loạn của hội chứng MERRF ảnh hưởng đến nhiều bộ phận của cơ thể, đặc biệt cơ bắp và hệ thần kinh, triệu chứng xuất hiện từ thời thơ ấu hay tuổi vị thành niên. Vì vậy việc phân tích mtDNA là quan trọng ở nhiều trường hợp có sự rối loạn hệ thống không rõ ràng. Đột biến MERRF ở bệnh nhân Việt Nam đã được nghiên cứu tuy nhiên các thông tin có được còn hạn chế. Vì thế, việc mở rộng nghiên cứu phát hiện đột biến này ở người Việt Nam, đặc biệt là việc định lượng mức độ không đồng nhất về kiểu gen đột biến để đưa ra mối tương quan giữa tỷ lệ đột biến và biểu hiện lâm sàng của bệnh là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao.
2.1. NGUYÊN LIỆU2.1.1. Mẫu bệnh phẩmMẫu máu ngoại vi của 312 bệnh nhân người Việt Nam nghi bị bệnh ty thể (Phụ lục 1) được lấy từ Bệnh viện Nhi Trung ương. Các mẫu máu được bảo quản ở -80oC. Trong nghiên cứu này, các bệnh nhân được nghi ngờ mắc hội chứng MERRF dựa trên sự có mặt của ít nhất hai trong ba đặc điểm sau:
2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khácPlasmid chèn đoạn gen 8155 - 8366 có và không mang đột biến A8344G là sản phẩm của đề tài KC.04.10/11-15 Các kit tách chiết DNA tổng số được mua từ hãng Qiagen; các cặp mồi và mẫu dò được mua từ hãng Integrated DNA Technologies; thang chuẩn DNA, hỗn hợp dNTP; (Enzynomics, Hàn Quốc); enzyme giới hạn được mua từ hãng Thermoscientifics, Kapa probe fast qPCR, Master Mix được mua của hãng Kapabiosystems. Các hóa chất còn lại đều được mua từ các hãng tin cậy (Sigma, Merk) và đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử.
2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊCác máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: máy NanoDropTM 8000, máy PCR gradient (Eppendorf), máy real-time PCR iQTM 5 cycler (Biorad), máy ly tâm lạnh 5417 R (Eppendorf), thiết bị điện di ngang, điện di đứng (Biorad) và hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc (Biorad). 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.3.1. Tách chiết DNA tổng sốDNA tổng số được tách và tinh sạch từ máu ngoại vi của các bệnh nhân theo QIAamp DNA Mini Kit của Qiagen. 2.3.2. Kiểm tra và định lượng DNA tách chiết Sự có mặt của DNA được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. 5 µl DNA được trộn với 1 µl đệm tra mẫu chứa ethidium bromide (50 µg/ml), tra lên giếng gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Điện di được thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel, các băng DNA được phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại. Nồng độ của DNA tách chiết được định lượng bằng cách đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của các acid nucleic ở bước sóng 260 nm (A260) trên máy Nano-Drop. DNA được cho là sạch khi giá trị A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.
Đoạn gen ty thể mang đột biến MERRF được khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với các cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế và chế độ nhiệt thích hợp. Khuôn cho PCR là DNA tổng số được tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân. Theo tính toán lý thuyết, các đoạn gen chứa đột biến sẽ được nhân lên bằng kĩ thuật PCR với kích thước 212 bp (đột biến A8344G), 220 bp (đột biến T8356C), 241 bp (đột biến G8363A). 2.3.4. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn (PCR-RFLP) Đoạn gen chứa đột biến được nhân bản bằng kỹ thuật PCR, sản phẩm PCR sau khi đã kiểm tra trên gel agarose 2% được cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn trong đệm tương ứng (reaction buffer). Sau đó, sản phẩm cắt được điện di trên gel polyacrylamide 12% và đột biến được phát hiện dựa vào tính đa hình của các đoạn cắt khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại. 2.2.5. Điện di trên gel agarose Kỹ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền (gel). Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer) được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử (agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo. Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của lực của điện trường tác động lên chúng, kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel và hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử.
Sản phẩm nhân bản gen bằng PCR sau khi được cắt bằng enzyme giới hạn được trộn với đệm mẫu và tra vào đường chạy điện di trong đệm TAE 0,5X với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho tới khi vạch chỉ thị màu cách đáy bản gel 3 cm thì dừng lại (kích thước bản gel polyacrylamide chiều dài và chiều rộng là 10x7 cm). Gel được nhuộm bằng EtBr hòa trong nước, sau khoảng 5 phút, bản gel được lấy ra, rửa dưới vòi nước và soi dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp gel IQ5 (Biorad), các băng gắn với EtBr xuất hiện dưới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen. 2.2.7. Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu acid nucleic (LNA - locked nucleic acid) Trong thí nghiệm này, đột biến A8344G được định lượng bằng phương pháp real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang có trình tự bổ sung với trình tự đặc hiệu trên DNA đích, đầu 5’ của mẫu dò có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) FAM (495/520 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự không đột biến và HEX (535/556 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự đột biến, còn đầu 3’của mẫu dò có gắn chất hấp phụ tương ứng (quencher) là IBFQ (Iowa black fluorescence quencher). Ngoài ra, để tăng nhiệt độ tách chuỗi (Tm) và tính đặc hiệu của mẫu dò, trong trình tự của mẫu dò còn có cải biến bằng nucleotide dạng khóa (locked nucleic acid).
Trình tự đoạn gen được xác định dựa theo phương pháp Sanger (kết thúc bằng đầu tận cùng chứa dideoxynucleotide - ddNTP) thông qua dịch vụ phân tích bởi Công ty 1st base (Singapore). Do ddNTP chỉ chứa đầu 3’-H thay cho 3’-OH nên khi các nucleotide này được gắn vào chuỗi DNA đang được tổng hợp thì chúng sẽ làm cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừng lại. Theo đó, từ một đoạn DNA khuôn ban đầu sẽ tổng hợp nên nhiều đoạn sợi đơn mới được đánh dấu ở một đầu tận cùng là ddNTP và các đoạn này có độ dài hơn kém nhau một nucleotide. Các đoạn sợi đơn đó được phân tách trên gel acrylamide dạng mao quản và máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích kết quả để đưa ra trình tự đoạn DNA gốc. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1. THU THẬP MẪU MÁU BỆNH NHÂN VÀ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ3.1.1. Một số đặc điểm của mẫu phân tíchMẫu máu từ các bệnh nhi có độ tuổi từ 1 tháng đến 15 tuổi, trẻ dưới 5 tuổi (từ 1 tháng tuổi đến 5 tuổi) được nghiên cứu chiếm tỷ lệ 87,5%, từ 6 đến 15 tuổi chiếm tỷ lệ 12,5%. Trong đó, tỷ lệ nam là 57,1%, nữ là 43,9%. Theo các dẫn liệu chẩn đoán lâm sàng bởi các bác sĩ Bệnh viện Nhi Trung ương, các bệnh nhi lấy mẫu nghiên cứu đều xuất hiện các triệu chứng của bệnh thần kinh cơ (encephalomyopathy) như động kinh co giật, rối loạn chuyển hóa, chậm phát triển tinh thần vận động, tăng acid lactic máu. 3.1.2. Tách chiết DNA tổng số của các mẫuDNA tổng số từ 200µl mẫu máu của bệnh nhân được tách theo Kit của Qiagen (Mục 2.3.1.), chế phẩm DNA tổng số được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân (Hình 3.1) cho thấy các chế phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân đều có một băng DNA rõ nét, với độ di động điện thấp (gần vạch xuất phát), chứng tỏ DNA tổng số tách được đều nguyên vẹn. Kết quả đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở 260 nm của chế phẩm DNA tổng số (Phụ lục 1) cho thấy các mẫu DNA đều có tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0; chứng tỏ chế phẩm DNA ít lẫn protein hay RNA. Hàm lượng DNA trung bình đạt 44,5 ng/µl. Như vậy, chúng tôi đã thu được các sản phẩm DNA tổng số đạt yêu cầu để tiến hành các bước thí nghiệm tiếp theo. 3.2. SÀNG LỌC CÁC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP3.2.1. Sàng lọc đột biến A8344G3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8155 - 8366 bằng PCRĐể xác định sự thay đổi nucleotide G thành A tại vị trí 8344 trên mtDNA chúng tôi đã tiến hành nhân bản đoạn gen có kích thước 212 bp bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2% cho thấy sản phẩm DNA khuếch đại của đoạn gen có kích thước như tính toán lý thuyết (212 bp), điều này chứng tỏ chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen 8155 - 8366 từ mẫu DNA tổng số của các bệnh nhân. 3.2.1.2. Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLPĐoạn gen chứa đột biến sau khi được khuếch đại bằng PCR và kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 2% được cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn BanII. Sản phẩm cắt được điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thước của phổ băng DNA dưới ánh sáng tử ngoại. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP cho thấy các mẫu DNA nhân bản của bệnh nhân đều xuất hiện 3 băng có kích thước tương ứng là 99 bp, 72 bp và 41 bp, giống với sản phẩm cắt của plasmid không mang đột biến, trong khi đó đối chứng dương là plasmid mang đột biến bị cắt thành 4 băng có kích thước tương ứng là 99 bp, 50 bp, 41 bp và 22 bp. Chứng tỏ, kết quả PCR-RFLP của chúng tôi là đáng tin cậy, các mẫu bệnh) nhân được sàng lọc không mang đột biến A8344G.
Đoạn gen chứa đột biến T8356C phải được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu, chúng tôi nhân bản được đoạn DNA từ vị trí 8166 đến 8358. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose 2% cho thấy chỉ có một băng DNA duy nhất, kích thước 220 bp được nhân lên. Ở thí nghiệm đối chứng âm không xuất hiện băng DNA nào, chứng tỏ kết quả PCR là đúng so với những tính toán lý thuyết.
3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLPSản phẩm PCR ở trên được cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn DraI. Kiểm tra sản phẩm cắt bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thước của phổ băng DNA dưới ánh sáng tử ngoại. Phổ băng điện di cho thấy tất cả sản phẩm PCR của các mẫu bệnh nhân đều bị cắt thành 2 đoạn DNA có kích thước 192 bp và 28 bp giống như tính toán lý thuyết, chứng tỏ các mẫu bệnh nhân nghiên cứu không mang đột biến T8356C.
3.2.3. Sàng lọc đột biến G8363A3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8342 - 8582Chúng tôi dùng kỹ thuật PCR với cặp mồi bắt cặp đặc hiệu với sợi xuôi và sợi ngược của đoạn mtDNA nghiên cứu để nhân lên đoạn DNA có kích thước 241 bp (8342 - 8582) sử dụng khuôn là mẫu DNA tổng số được tách từ mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose 2% cho kết quả là một băng DNA duy nhất có kích thước 220 bp được nhân lên. Ở thí nghiệm đối chứng âm không xuất hiện băng DNA nào, chứng tỏ kết quả PCR là đáng tin cậy so với những tính toán lý thuyết. 3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLPSản phẩm PCR ở trên được cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn NlaIII. Sản phẩm cắt được điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thước của phổ băng DNA dưới ánh sáng tử ngoại. Phổ băng điện di cho thấy tất cả các mẫu sản phẩm PCR của bệnh nhân đều bị cắt thành 2 đoạn DNA 220 bp và 21 bp, chứng tỏ các mẫu bệnh nhân nghiên cứu không mang đột biến G8363A. 3.3. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG ĐỘT BIẾN A8344G BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR 3.3.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA3.3.1.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNAViệc thiết kế mồi cho real-time PCR dùng Taqman probe về cơ bản được thực hiện theo các nguyên tắc thiết kế mồi chung cho PCR. Đột biến điểm A8344G (MERRF) được chúng tôi nghiên cứu định lượng bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò Taqman khóa cầu methyl. Kỹ thuật này được phát triển dựa vào enzyme Taq DNA polymerase có hoạt tính 5’-exonuclease khi mẫu dò được gắn vào cùng sợi khuôn với mồi và phản ứng cắt này chỉ xảy ra khi gen đích được khuếch đại. Mẫu dò huỳnh quang bao gồm một đoạn nucleotide bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích, được đánh dấu reporter và quencher. Khi mẫu dò nguyên vẹn, quencher làm hấp thu tín hiệu huỳnh quang từ reporter do sự cộng hưởng năng lượng huỳnh quang (nguyên lý FRET) do khoảng cách giữa reporter và quencher khá gần nhau. Sự phân cắt của mẫu dò trong khi PCR đã giải phóng reporter làm tăng mật độ huỳnh quang và máy đo tín hiệu huỳnh quang sẽ ghi nhận được tín hiệu. Đây là phương pháp phát hiện và định lượng đột biến nhanh, nhạy và chính xác, có giá trị khi xác định tỷ lệ đột biến mtDNA thấp. Đột biến A8344G là đột biến không đồng nhất, sử dụng real-time PCR với mẫu dò Taqman thông thường đã cho tín hiệu nền cao do việc gắn không đặc hiệu của mẫu dò vào trình tự đích vì vậy không có giá trị để xác định tỷ lệ đột biến thấp. Vì vậy để xác định chính xác tỷ lệ đột biến A8344G thì một trong những thách thức cơ bản là thiết kế mẫu dò Taqman phải có khả năng phân biệt được các gen đích chỉ khác nhau một nucleotide. Điều này đạt được khi khoảng cách ΔTm giữa Tm của mẫu dò bắt cặp hoàn toàn (mẫu dò match) và Tm của mẫu dò bắt cặp không hoàn toàn (mẫu dò mismatch) càng lớn. Khoảng ΔTm càng lớn thì việc lựa chọn nhiệt độ bắt cặp/kéo dài trong phản ứng PCR bên trong khoảng ΔTm càng thuận lợi, mẫu dò sẽ bắt cặp chính xác hơn. Trong thí nghiệm này, mẫu dò huỳnh quang Taqman có trình tự bổ sung với trình tự đặc hiệu trên DNA đích, đầu 5’ của mẫu dò có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) FAM (495/520 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự đột biến và HEX (535/556) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự không đột biến, còn đầu 3’ của mẫu dò có gắn chất hấp phụ tương ứng (quencher) là BFQ (Black Fluorescence Quencher). Dựa trên nguyên tắc đã phân tích, chúng tôi đã thiết kế mẫu dò Taqman LNA đặc hiệu để phát hiện đột biến A8344G bằng real-time PCR (Bảng 3.5). Bảng 3.5: Trình tự của mẫu dò dùng cho real-time PCR
Ghi chú: dấu + chỉ nucleotide LNA 3.3.1.2. Đánh giá tính đặc hiệu của mẫu dò đột biến A8344GĐoạn DNA chứa đột biến A8344G dài 80 bp từ vị trí 8291-8370 được nhân bản với cặp mồi RT8344-Fw và RT8344-Rv và nucleotide đột biến được phát hiện bằng mẫu dò đặc hiệu Wt-8344A-FAM và Mt-8344G-HEX. Các thử nghiệm kiểm tra mẫu dò được thực hiện sử dụng DNA khuôn là plasmid đột biến và không đột biến được pha loãng 5.106 bản sao/µl. Qua nhiều lần thăm dò, chúng tôi đã xác định được nồng độ mẫu dò thích hợp cho phản ứng real-time PCR là 0,02 µmol/L mỗi loại mẫu dò cho 25l thể tích phản ứng; với hàm lượng mẫu dò này thì cường độ huỳnh quang được ghi nhận là cao nhất. Nhiệt độ bắt cặp của mồi và mẫu dò là 60oC, đây là nhiệt độ bắt cặp tối ưu của mẫu dò Taqman, với nhiệt độ bắt cặp này mẫu dò sẽ bắt cặp vào sợi đích trước khi mồi bắt cặp, nhờ đó enzyme Taq DNA polymerase dễ dàng thủy phân mẫu dò, giúp cho việc phát huỳnh quang của reporter. Đoạn DNA ty thể chứa đột biến A8344G dài 80 bp từ vị trí 8291-8370 được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi RT8344-Fw và RT8344-Rv và nucleotide đột biến được phát hiện bằng mẫu dò đặc hiệu Mt-8344G-HEX và Wt-8344A-FAM với các plasmid mang đột biến và không mang đột biến ở nồng độ 5x106 bản sao để kiểm tra sự hoạt động của mẫu dò và tính đặc hiệu của probe. Kết quả phân tích real-time PCR cho thấy khi chạy real-time PCR với plasmid mang đột biến 8344G thì tín hiệu huỳnh quang chỉ lên với kênh HEX trong khi phản ứng chứa đồng thời cả 2 mẫu dò Mt-8344G-HEX và Wt-8344A-FAM. Tương tự, với plasmid không mang đột biến (tức chỉ là A8344), thì chỉ có tín hiệu FAM. Kết quả này khẳng định mẫu dò mà chúng tôi thiết kế có khả năng phân biệt đặc hiệu mẫu đột biến và mẫu không đột biến.
3.3.2. Xây dựng đường chuẩn và đánh giá độ tin cậy của phương pháp real-time PCR để định lượng đột biến A8344G3.3.2.1. Xác định số bản sao của plasmid mang đoạn gen đột biến và không đột biến A8344GĐể xây dựng đường chuẩn của đoạn gen mang đột biến A8344G thuộc hội chứng MERRF bằng real-time PCR, plasmid mang DNA có đột biến và không đột biến A8344G được chuẩn bị ở các nồng độ bản sao khác nhau, dựa trên kích thước hay trọng lượng phân tử và nồng độ của DNA plasmid thu nhận được. Cụ thể, chúng tôi đã tính được số bản sao của plasmid 8344A = 2,1 x 1010 bản sao, plasmid 8344G = 1,7 x 1010 bản sao Số bản sao của 2 plasmid được pha loãng về cùng một nồng độ là 1 x 1010 bản sao/µl và được pha loãng theo hệ số 10 dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2. 2. Xây dựng đường chuẩn của đột biến A8344GSử dụng khuôn là hỗn hợp plasmid đột biến và không đột biến theo tỷ lệ 1:1 có nồng độ 5x107 - 5x102 bản sao /l. Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt, các mẫu chuẩn có số chu kỳ ngưỡng khác nhau tương quan với số lượng DNA đích ban đầu. Kết quả phân tích real-time PCR cho thấy đường có độ tuyến tính cao, giá trị của hệ số tương quan R2 giữa số bản sao DNA ty thể và số chu kỳ ngưỡng với mẫu dò Wt-8344A-FAM (không mang đột biến) là 0,999 và Mt-8344G-HEX (mang đột biến) là 0,999, hiệu quả PCR nằm trong khoảng 94-100%. Slope của probe Wt-8344A-FAM là -3,458, probe Mt-8344G-HEX là -3,317. Nhằm kiểm tra độ nhạy và độ tin cậy của phương pháp chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn tỷ lệ đột biến bằng cách pha mẫu chuẩn có tỷ lệ đột biến là 0,01% - 100% đột biến bằng cách trộn plasmid mang đột biến và không đột biến với các thể tích nồng độ tương ứng. Sau đó chúng tôi tiến hành định lượng mẫu chuẩn và xây dựng đồ thị sự tương quan tuyến tính giữa phần trăm tỷ lệ độ biến thực tế và lí thuyết. Đánh giá độ nhạy và độ tin cậy của phương pháp. Kết quả cho thấy giới hạn phát hiện đột biến của phương pháp thiết lập được là 0,1%, sự tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ đột biến thực tế và lý thuyết có độ tin cậy cao (R2 = 0,997).
3.2.4. Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lượng đột biến A8344GTrong 312 mẫu bệnh phẩm đã sàng lọc bằng phương pháp PCR-RFLP, chúng tôi không phát hiện được trường hợp nào mang đột biến A8344G. Để khẳng định thêm về kết quả này chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 5 mẫu bệnh phẩm (kí hiệu BN1, BN2, BN3, BN4, BN5) và thử nghiệm bằng phương pháp real-time PCR đã được thiết lập ở trên. Kết quả định lượng cho thấy cả 5 mẫu bệnh phẩm được thử nghiệm chỉ thu được tín hiệu FAM, là tín hiệu không đột biến trong khi đó tín hiệu HEX là tín hiệu đột biến đều không phát hiện được. Đường chuẩn được xây dựng có độ tuyến tính cao (R2 > 0,99). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho kết quả giống nhau. Vì vậy chúng tôi một lần nữa khẳng định 5 mẫu bệnh phẩm này đều không mang đột biến A8344G, sự phù hợp về kết quả của hai phương pháp PCR-RFLP và real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang LNA.
Như đã nêu ở trên, qua sàng lọc bằng PCR-RFLP, chúng tôi đã không phát hiện được trường hợp nào mang các đột biến A8344G, T8356C và G8363A thuộc hội chứng MERRF. Để một lần nữa khẳng định kết quả nghiên cứu bằng PCR-RFLP là chính xác chúng tôi đã lựa chọn 29 mẫu bệnh nhân nghi ngờ mắc hội chứng MERRF với triệu chứng rõ nhất để giải trình tự đoạn gen 8155 - 9292 thuộc vùng các đột biến này. Đoạn gen ty thể 8155 - 9292 dài 1137 bp của 29 bệnh nhân nghi bị MERRF được chúng tôi nhân gen từ phản ứng PCR với khuôn là mẫu DNA bệnh phẩm được nhân lên bằng PCR và giải trình tự nucleotide sử dụng mồi theo cả hai chiều. Kết quả phân tích trình tự thu được cho thấy không có trường hợp nào mang đột biến A8344G, T8356C và G8363A của hội chứng MERRF (Hình 3.12). Như vậy, kết quả xác định trình tự một lần nữa khẳng định kết quả phân tích bằng PCR-RFLP là chính xác và đáng tin cậy. KẾT LUẬN
KIẾN NGHỊ
Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 119.67 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|