Phương pháp xác định độ lặp lại và độ chính xác

Độ lặp và độ chính xác là hai đại lượng quan trọng để đánh giá một phương pháp phân tích.

1.4.1. Độ lặp lại

Độ lặp lại là đại lượng đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ x_i của cùng một mẫu phân tích, được tiến hành bằng một phương pháp phân tích, trong cùng một điều kiện thí nghiệm (người phân tích, trang thiết bị, phòng thí nghiệm) trong khoảng thời gian ngắn.

*Các đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại

Khoảng biến thiên R: là hiệu số giữa giá trị lớn nhất và giá trị nhỏ nhất trong một tập số liệu

R = x_max - x_min

Độ lớn của R phụ thuộc vào kích thước mẫu. Với cùng sai số ngẫu nhiên, khi số phép đo tăng R sẽ tăng. Do đó, khoảng biến thiên được dùng để đặc trưng cho độ phân tán của tập số liệu khi phép đo nhỏ.

Phương sai (² và S²): là giá trị trung bình của tổng bình phương sự sai khác giữa các giá trị riêng rẽ trong tập số liệu so với giá trị trung bình. Phương sai không cùng thứ nguyên với các đại lượng đo.

Nếu tập số liệu nhỏ thì

(với N-1=f là số bậc tự do)

Khi có m tập số liệu, mỗi tập số liệu làm k thí nghiệm lặp lại với cùng một mẫu thì

Nếu phương sai càng lớn thì độ tản mạn của các giá trị đo lặp lại càng lớn hay độ lặp lại càng kém.

(Với N là số thí nghiệm lặp lại của tập hợp, thực tế thường xem các tập số liệu có N>30 là tập hợp).

Hoặc hay (với N là số thí nghiệm trong mẫu thống kê được rút ra từ tập hợp. Số bậc tự do trong trường hợp này là f = N – 1)

Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) và hệ số biến thiên (CV)

RSD là tỉ số giữa độ lệch chuẩn và giá trị trung bình

RSD(%) còn được gọi là hệ số biến thiên. Đại lượng này được dùng để đánh giá độ chính xác tương đối của phép phân tích.

1.4.2. Độ chính xác

Độ chính xác là đại lượng đặc trưng cho mức độ gần nhau của giá trị phân tích (thường là giá trị trung bình ) với giá trị thực hay giá trị đã được chấp nhận x_t hay .

Khi không có sai số hệ thống thì giá trị trung bình tiến tới giá trị thực nếu số phép đo rất lớn (N→). Vì vậy, có thể nói độ chính xác tùy thuộc vào số phép đo.

Độ chính xác được biểu diễn dưới dạng sai số tuyệt đối hoặc sai số tương đối. Trong đó sai số tuyệt đối (E_A) là sự sai khác giữa giá trị đo được (x_i) với giá trị thật hay giá trị đã biết trước (x_t hay )

E_A = x_i - 

Còn sai số tương đối (E_R) là tỷ số giữa sai số tuyệt đối và giá trị thật hay giá trị đã biết trước

Mẫu huyết thanh của những người khỏe mạnh, độ tuổi từ 20-30 có nhóm máu O, đã được sàng lọc không chứa các loại virut HIV, viêm gan A (HAV), viêm gan B (HBV), viêm gan C (HCV),…

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu tài liệu

Thu thập, nghiên cứu và phân tích, kế thừa các tài liệu đã có trên thế giới và Việt Nam về phương pháp phân hủy xác định đồng, chì và cadimi trong mẫu huyết thanh.

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đồng, chì và cadimi trong huyết thanh trên thiết bị ICP-MS

Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình xác định đồng thời đồng, chì, cadimi trong huyết thanh bằng phương pháp ICP-MS bao gồm 2 phần chính sau: quy trình phân hủy mẫu huyết thanh và quy trình phân tích mẫu trên thiết bị ICP-MS.

2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng các thuật toán để tính toán kết quả phân tích.

2.3. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị

2.3.1. Hóa chất

Tất cả hóa chất dùng trong nghiên cứu như HNO₃, H₃PO₄, HCl, H₂SO₄, HF, Triton X-100 đều là các hóa chất siêu sạch (Merck).

Dung dịch chuẩn của các kim loại Cu, Pb, Cd đều là các hóa chất siêu sạch được mua từ hãng Merck có nồng độ gốc 1000ppm. Từ nồng độ gốc, pha chế thành các dung dịch có nồng độ nhỏ hơn. Các dung dịch chuẩn được bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch chuẩn được pha chế hàng ngày.

Các dung dịch chuẩn máy (Mg; Rh; Ce; Pb; U; In; Be; Co) nồng độ 10ppb được mua từ hãng Perkin Elmer, Mỹ.

Nước cất dùng cho nghiên cứu và phân tích là nước cất siêu sạch được cung cấp từ thiết bị Milipore có độ dẫn điện nhỏ hơn 18,2Ω/cm (25⁰C). Khí Argon siêu sạch chất lượng 99,999% được mua từ hãng Messer.

Mẫu huyết thanh dùng trong thí nghiệm nghiên cứu thuộc nhóm máu O được tách li tâm trước khi mang về phòng thí nghiệm và được bảo quản đông lạnh. Huyết thanh chuẩn của hãng Bio-ral, Mỹ (Assayed Chemistry Control) dạng bột khô, được bảo quản trong lọ nhỏ màu nâu ở nhiệt độ 2⁰C dùng để kiểm tra mẫu, tính sai số và độ lặp.

2.3.2. Dụng cụ

Dụng cụ dùng trong nghiên cứu bao gồm

• 
  Ống phá mẫu trong lò vi sóng làm bằng Teflon.
  
• 
  Túp nhựa của hãng Sarstedt loại 15mL và 50mL.
  
• 
  Các loại pipet 100L, 1000L và 5mL.
  

Cân phân tích của hãng Adam (Anh), có độ chính xác 0,0001mg dùng để cân mẫu chuẩn.

2.3.3.Thiết bị phân hủy mẫu và phân tích mẫu

2.3.3.1. Thiết bị phân hủy mẫu

Hệ phân hủy mẫu bằng lò vi sóng Berghof, Speed wave-4 (Đức) (hình 1), có chương trình điều khiển nhiệt độ bên trong, bên ngoài lò, áp suất và thời gian gia nhiệt.

Lò vi sóng có các ống phá mẫu bằng teflon, ký hiệu là DAK-100, có thể tích 100mL. Nhiệt độ và áp suất lớn nhất có thể đạt được ở trong ống lần lượt là 230⁰C và 40 bar. Khối lượng mẫu lớn nhất cho vào trong ống là 500 mg. Thể tích mẫu tối thiểu trong ống là 5 ml

Thiết bị ICP-MS (Perkin Elmer, ELAN 9000) (hình 2) với hệ từ trường bát cực, sử dụng nguồn năng lượng cao tần cho quá trình hóa hơi và ion hóa tất cả các nguyên tử với hiệu suất cao và ổn định. ICP-MS ghép nối hệ sol hóa mẫu giúp quá trình làm giàu mẫu và tăng khả năng phát hiện rất phù hợp với phân tích vết các kim loại.

*Cấu tạo của thiết bị ICP-MS 9000 bao gồm các bộ phận sau

- Nguồn ion plasma

- Bộ quang học ion (tứ cực)

- Thiết bị đo phổ khối lượng - tứ cực

- Bộ lấy mẫu tự động Autosampler AS-93 plus, Perkin Elmer, Mỹ

- Bộ sol hóa mẫu bằng sóng siêu âm (USN, Perkin Elmer, Mỹ) trước khi đưa mẫu vào buồng plasma. Hệ này giúp cho quá trình làm giàu mẫu lên nhiều lần tăng khả năng phát hiện.

- Buồng chân không và hệ lọc khối (trường tứ cực và các thấu kính điện từ ion)

- Vùng ghép nối (Interface)

- Máy tính

Ngoài ra còn có máy lạnh tuần hoàn và hệ thống quạt hút.

Mẫu máu được lấy khoảng 250-300mL vào buổi sáng ở tĩnh mạch khuỷu tay, không chứa chất chống đông hay các chất bảo quản khác. Sau khi tiệt trùng, mẫu được chứa trong loại túi sử dụng 1 lần của hãng Terumo. Để tách huyết thanh, mẫu máu được làm đông tự nhiên trong thời gian 30 phút, sau đó li tâm trên thiết bị Mistral 6000 với tốc độ 2000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, ở nhiệt độ 10-15⁰C. Huyết thanh được tách ra và bảo quản ở nhiệt độ 2-8⁰C.

*Lựa chọn môi trường phân hủy mẫu huyết thanh

Bảng 2 cho thấy phân hủy mẫu sử dụng axit HNO₃ cho độ thu hồi đối với cả ba nguyên tố từ 88 đến 97 %. Thực nghiệm quan sát cho thấy đây cũng là axit tốt nhất để hòa tan mẫu. Axit H₃PO₄ cho độ thu hồi tốt nhưng quá trình thực nghiệm cho thấy mẫu không phân huỷ hết các chất hữu cơ; hỗn hợp axit HNO₃ và HCl phân huỷ mẫu tốt nhưng cho độ thu hồi của Cu thấp; hỗn hợp HNO₃, H₂SO₄ và HF cho độ thu hồi của Pb thấp. Vì vậy, các nghiên cứu tiếp theo đều sử dụng HNO₃ cho việc phân hủy mẫu.

3.1.1.Phương pháp pha loãng bằng HNO₃

Pha các dung dịch axit HNO₃ có nồng độ lần lượt là: 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1% ; 1,2%; 1,5% từ dung dịch HNO₃ (1:1) và dung dịch chuẩn của các nguyên tố Cu, Pb, Cd có các nồng độ tương ứng là 50ppm; 2ppm và 0,1ppm.

Lấy 1mL mẫu huyết thanh 50L dung dịch chuấn vào các ống nghiệm. Tiến hành định mức đến vạch 10mL lần lượt bằng các dung dịch HNO₃ với các nồng độ 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1%; 1,2% và 1,5% đối với tất cả các ống.

Mối tương quan giữa nồng độ HNO₃ với hàm lượng trung bình của các kim loại đồng, chì và cadimi được trình bày ở trong bảng 3

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ các kim loại vào nồng độ HNO₃ trong phương pháp pha loãng bằng HNO₃ (hình 5).

Từ kết quả phân tích hàm lượng đồng, chì và cadimi trong các mẫu (hình 5) ta thấy trong phương pháp pha loãng bằng HNO₃ ở các nồng độ khác nhau, thì với nồng độ HNO₃ 1% thu được hàm lượng của các nguyên tố là cao nhất và độ thu hồi của các nguyên tố là tốt nhất. Như vậy sử dụng HNO₃ với nồng độ 1% là tối ưu trong phương pháp phân hủy thường mẫu huyết thanh.

3.1.2. Phương pháp pha loãng bằng hỗn hợp HNO₃ (1%) và Triton X-100

Tương tự, lấy 1mL mẫu huyết thanh và 50L dung dịch chuẩn vào các ống nghiệm, rồi định mức đến vạch 10mL bằng HNO₃ 1% và Triton X-100 có nồng độ lần lượt là 0,05%; 0,075%; 0,1%; 0,15%; 0,2% đối với tất cả các ống.

Mối tương quan giữa nồng độ Triton X-100 và hàm lượng của đồng, chì, cadimi trong huyết thanh được trình bày ở trong bảng 4.

Bảng 4: Ảnh hưởng của Triton X-100 đến quá trình xác định hàm lượng đồng, chì và cadimi trong huyết thanh