TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên hoàng Thị Huyền thiết kế thang chuẩn adn



tải về 67.2 Kb.
Chuyển đổi dữ liệu30.08.2016
Kích67.2 Kb.
#28439
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-------------------


Hoàng Thị Huyền


THIẾT KẾ THANG CHUẨN ADN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Võ Thị Thương Lan

Hà Nội – 2011
LỜI CẢM ƠN

Trong suốt hơn hai năm nghiên cứu, học tập và thực hiện luận văn của mình, em đã luôn nhận được sự dạy dỗ, chỉ bảo tận tình của các Thầy, Cô giáo cũng như sự quan tâm chăm sóc từ gia đình và bạn bè. Đó là động lực giúp em vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành luận văn này.

Nhân đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Võ Thị Thương Lan. Cô đã hướng dẫn, phân tích, bảo ban em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.

Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Tạ Bích Thuận, ThS. Phạm Anh Thùy Dương, tập thể cán bộ, học viên và sinh viên thuộc Phòng thí nghiệm Sinh Y – Khoa Sinh học, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này.

Cuối cùng, em cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ở bên động viên, chia sẻ và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 11 tháng 05 năm 2011

Học viên


Hoàng Thị Huyền

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleic

ATP Adenosine triphosphate

bp Base pair

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

LB Lubertini broth

ng Nanogram

kb Kilobase

PCR Polymerase chain reaction

pg Picogram

RM Restriction modification

u Unit


µl Microliter

µg Microgram



DANH MỤC BẢNG







Trang

Bảng 1.


Giá thành thang chuẩn ADN bước nhảy nhỏ năm 2011 của một số hãng sản xuất, chưa bao gồm thuế nhập khẩu tham khảo trên website: www.uoftmedstore.com.

11

Bảng 2.

Giá thành ADN ladder 100 bp năm 2010 của một số hãng thương mại chưa bao gồm thuế nhập khẩu, tham khảo trên webside: www.lablife.org.

12

Bảng 3.

Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.

14

Bảng 4.

Thành phần và điều kiện cho phản ứng PCR.

20

Bảng 5.

Tổ hợp sản phẩm cắt không hoàn toàn plasmid pJET1.2-8×100-2 bằng EcoRI.

33

Bảng 6.

Tổ hợp các băng ADN khi cắt không hoàn toàn plasmid pJET1.2-8×100-2 bằng enzyme HpaII.

35

Bảng 7.

Thành phần phản ứng cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp bằng HpaII ở 4 nồng độ ADN.

42

Bảng 8.

Tổ hợp băng trong thang chuẩn ADN SY - 100.

45



DANH MỤC HÌNH








Trang

Hình 1.

Ảnh ADN ladder 500 bp (Takara); ADN ladder 200 bp (Fermentas) và ADN ladder 10 bp (Invitrogen).

2

Hình 2.

ADN marker thương mại được tạo ra từ ΦX174; pBR322 và pUC19.

3

Hình 3.

Một số thang chuẩn ADN thương mại bán trên thị trường.

5

Hình 4.

Ảnh ADN ladder 5 bp (Fermentas) điện di trên agarose 5% và gel polyacrylamide 10%.

7

Hình 5.

Kéo dài mồi bởi Taq ADN polymerase. Mồi được gắn vào trình tự bổ sung trên sợi khuôn và Taq ADN polymerase kéo dài mồi bằng cách gắn chính xác các deoxynucleotide (dNTP) theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung với sợi ADN khuôn, quá trình tổng hợp diễn ra theo chiều 3’ - 5’.

8

Hình 6.

ADN ladder 100 bp của một số hãng sản xuất thương mại; (B): Ảnh ADN ladder 100 bp kết hợp với ADN ladder 500 bp (Fermentas).

13

Hình 7.

Sơ đồ nghiên cứu thiết kế thang chuẩn ADN SY - 100.

17

Hình 8.

Sơ đồ minh họa thiết kế cặp mồi Bre-F1/R1 dựa trên trình tự đoạn 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre.

23

Hình 9.

Điện di sản phẩm PCR đoạn 108 bp trên agarose 2%. 1: ADN Ladder 100 bp; 2: Sản phẩm PCR kích thước 108 bp.

24

Hình 10.

Điện di sản phẩm PCR kiểm tra kích thước đoạn chèn trong plasmid của 13 khuẩn lạc. L: ADN ladder 100 bp; (-): Đối chứng âm; Số 1 đến số 13: Sản phẩm PCR kiểm tra plasmid khuẩn lạc 1 đến 13.

27

Hình 11.

Điện di sản phẩm cắt hoàn toàn plasmid pJET1.2-8×100 của 5 khuẩn lạc bằng enzyme EcoRI trên gel polyacrylamide 12%. L: ADN ladder 100 bp; Số thứ tự trên hình tương ứng với số thứ tự khuẩn lạc.

28

Hình 12.

Ảnh điện di mẫu cắt không hoàn toàn plasmid pJET1.2-8×100-2 bằng EcoRI tại ba thời gian khác nhau trên agarose 2%. L: ADN ladder 100 bp; 1: Mẫu cắt 20 phút; 2: Mẫu cắt 30 phút; 3: Mẫu cắt 40 phút.

29

Hình 13.

Ảnh điện di mẫu cắt plasmid pJET1.2-8×100-2 bằng EcoRI trên agarose 2,5%. L: ADN ladder 100 bp; 1: Mẫu cắt không hoàn toàn 15 µl ADN.

30

Hình 14.

Ảnh minh họa kết quả giải trình tự vector pJET1.2-8×100-2. (A): Giải trình tự theo chiều xuôi; (B): Giải trình tự theo chiều ngược.

32

Hình 15.

Ảnh điện di sản phẩm cắt không hoàn toàn pJET1.2-8×100-2 bằng EcoRI trên gel polyacrylamide 8%. 1: Mẫu cắt; L: ADN ladder 100 bp.

34

Hình 16.

Các vị trí cắt của enzyme HpaII trên vector pJET1.2 [36].

36

Hình 17.

Vị trí mồi pJET-800-F/R trên vector pJET1.2-8×100-2.

37

Hình 18.

Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 1000 bp ở bốn độ pha loãng khuôn ADN trên agarose 1%. L: ADN ladder 500 bp; 1: Khuôn pha loãng 10-4; 2: Khuôn pha loãng 10-3; 3: Khuôn pha loãng 10-2; 4: Khuôn pha loãng 10-1; 5: Đối chứng âm.

38

Hình 19.

Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 1000 bp ở nhiệt độ gắn mồi 660C sử dụng 6 độ pha loãng khuôn ADN. L: ADN ladder 500 bp; 1: Khuôn pha loãng 10-1; 2: Khuôn pha loãng 10-2; 3: Khuôn pha loãng 10-3; 4: Khuôn pha loãng 10-4; 5: Khuôn pha loãng 10-5; 6: Khuôn pha loãng 10-6; 7: Đối chứng âm.

39

Hình 20.

Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 1000 bp sử dụng cặp mồi pJET-800-F/R với khuôn plasmid pJET1.2-8×100-2 trên agarose 1%. L: ADN ladder 500 bp; 1: Sản phẩm PCR; 2: Đối chứng âm.

40

Hình 21.

Ảnh điện di sản phẩm cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp bằng enzyme HpaII trên gel polyacrylamide 6% tại các thời gian phản ứng khác nhau. 1: Phản ứng cắt 1 phút; 2: Phản ứng cắt 3 phút; 3: Phản ứng cắt 5 phút; L: ADN ladder 100 bp.

41

Hình 22.

Điện di sản phẩm cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp bằng HpaII tại 4 nồng độ ADN khác nhau trên gel polyacrylamide 6%. L: ADN ladder 100 bp; 1: Nồng độ ADN 250 ng; 2: Nồng độ ADN 150 ng; 3: Nồng độ ADN 100 ng; 4: Nồng độ ADN 50 ng.

43

Hình 23.

Ảnh điện di sản phẩm phản ứng cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp bằng HpaII trên gel polyacrylamide 6%. 1: Sản phẩm phản ứng cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp bằng HpaII; L: ADN ladder 100 bp.

44

Hình 24.

Ảnh điện di thang chuẩn ADN SY - 100 sau tinh sạch trên gel polyacrylamide 6%. 1: Thang chuẩn ADN SY - 100 tinh sạch; L: ADN ladder 100 bp.

45

Hình 25.

Ảnh điện di 200 ng thang chuẩn ADN SY - 100 (1) và 125 ng ADN ladder 100 bp - Takara (L) trên bốn nồng độ gel khác nhau. A: Agarose 1,7%; B: Agarose 2,5%; C: Polyacrylamide 4%; D: Polyacrylamide 8%.

46


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1. THANG CHUẨN ADN 2



1.1.1. Thang chuẩn ADN 2

1.1.2. Vai trò của thang chuẩn ADN trong nghiên cứu sinh học phân tử 3

1.1.3. Sản xuất thang chuẩn ADN 4

1.1.3.1. Cung ứng và sản xuất thang chuẩn ADN trên thế giới 4

1.1.3.2. Tiềm năng sản xuất thang chuẩn ADN tại Việt Nam 5

1.1.3.3. Phương pháp sản xuất thang chuẩn ADN 6

1.1.3.4. Những thuận lợi và khó khăn trong sản xuất thang chuẩn ADN bước nhảy nhỏ 11

1.2. THANG CHUẨN 100 bp 12



1.2.1. Thị trường ADN ladder 100 bp 12

1.2.2. Sản xuất ADN ladder 100 bp 13

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1. NGUYÊN LIỆU 14



2.1.1. Hệ Vector 14

2.1.2. Các cặp mồi cho phản ứng PCR 14

2.1.3. Chủng vi sinh vật 15

2.1.4. Hóa chất và trang thiết bị 15

2.2. SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM 17

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.3.1. Phương pháp tách chiết plasmid từ vi khuẩn 17

2.3.2. Kỹ thuật nối các đoạn ADN 18

2.3.3. Biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt 18

2.3.4. Phản ứng PCR 20

2.3.5. Xác định nồng độ ADN bằng máy đo quang phổ 20

2.3.6. Phản ứng cắt ADN sử dụng enzyme cắt giới hạn 21

2.3.7. Tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR 21

2.3.8. Kỹ thuật điện di 22

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1. KHUẾCH ĐẠI VÀ TẠO ĐOẠN ADN CÓ KÍCH THƯỚC 100 bp 23



3.1.1. Khuếch đại đoạn ADN bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 23

3.1.2. Tạo đoạn 100 bp bằng phản ứng cắt với EcoRI 24

3.2. TẠO VECTOR TÁI TỔ HỢP 25



3.2.1. Phản ứng tự nối các đoạn 100 bp 25

3.2.2. Khuếch đại sản phẩm tự nối các đoạn 100 bp 25

3.2.3. Tách dòng vector tái tổ hợp 26

3.2.4. Phản ứng cắt vector pJET1.2-8×100 bằng EcoRI 27

3.2.4.1. Phản ứng cắt hoàn toàn 27

3.2.4.2. Phản ứng cắt không hoàn toàn 28

3.3. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ 31



3.3.1. Kết quả giải trình tự vector tái tổ hợp pJET1.2-8×100 31

3.4. SẢN XUẤT THANG CHUẨN ADN 100 bp 36



3.4.1. Khuếch đại đoạn 1000 bp 36

3.4.2. Phản ứng cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp 40

3.4.3. Tinh sạch sản phẩm cắt tạo thang chuẩn ADN SY - 100 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC
Каталог: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường

tải về 67.2 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương