TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 8178 : 2009 iso/ts 2963 : 2006

PHOMAT VÀ SẢN PHẨM PHOMAT CHẾ BIẾN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT XITRIC - PHƯƠNG PHÁP ENZYM

TCVN 8178 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 2963 : 2006;

TCVN 8178 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12

Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất

lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp enzym để xác định hàm lượng axit xitric trong phomat và sản phẩm phomat chế biến.

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

Phần khối lượng của các chất xác định được bằng qui trình qui định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH Hàm lượng axit xitric được biểu thị bằng phần trăm khối lượng.

3. Nguyên tắc

Dịch chiết của mẫu được xử lý bằng các enzym và các chất sinh hóa dưới đây:

a) lyaza xitrat (CL) để chuyển hóa axit xitric về oxalaxetat và axetat;

b) malat dehydrogenza (MDH) và lactat dehydrogenaza (LDH) khi có mặt nicotilamide adenine dinucleotide (NADH) khử, xúc tác việc khử oxalaxetat và sản phẩm pyruvat tách nhóm carboxyl của nó và L-malat và L-lactat tương ứng, sau đó chuyển NADH về dạng oxi hóa của nó (NAD⁺).

Việc giảm nồng độ NADH được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch thử ở bước sóng 340 nm. Hàm lượng axit xitric tỷ lện với việc giảm nồng độ NADH.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước được sử dụng là nước đá loại khoáng hoặc nước ít nhất có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có qui định khác. Lưu ý ngày sản xuất và hạn sử dụng của nhà sản xuất thuốc thử.

Nếu sử dụng huyền phù enzym có hoạt độ khác với qui định, thì cần nêu rõ thể tích huyền phù trong sơ đồ dùng pipet (8.5.1) phải tăng hoặc giảm tỷ lệ.

Các thuốc thử nêu trong 4.7 đến và kể cả 4.10 có thể có bán sẵn hỗn hợp thử nghiệm.

4.2. Dung dịch axit tricloaxetic (CCl₃COOH)

Hòa tan 200,0 g axit tricloaxetic trong nước. Thêm nước đến 1000 ml và trộn.

Hòa tan 200,0 g dung dịch natri hydroxit trong nước. thêm nước đến 1000 ml và trộn.

Hòa tan 40,0 g dung dịch natri hydroxit trong nước. Thêm nước đến 1000 ml và trộn.

Hòa tan 4,0 g dung dịch natri hydroxit trong nước. Thêm nước đến 1000 ml và trộn.

Hòa tan 800 g kẽm clorua trong nước. Thêm nước đến 1000 ml và trộn.

Hòa tan 71,3 g glyxylglyxin trong khoảng 700 ml nước. Chỉnh pH 7,8 bằng dung dịch natri hydroxit I (4.3). Thêm 100 ml dung dịch kẽm clorua (4.6). Thêm nước đến 1000 ml và trộn.

Dung dịch này có thể ổn định được 4 tuần nếu được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 ⁰C đến 5 ⁰C.

4.8. Dung dịch nicotilamide adenine dinucleotide (NADH) khử

Hòa tan 50 mg muối dinatri dinucleotide adenine nicotilamide khử (C₂H₂₇N₇O₁₄P₂Na₂) và 100 mg natri hydro cacbonat (NaHCO₃) trong 10 ml nước.

Dung dịch dinucleotide adenine nicotilamide khử này có thể ổn định được 4 tuần nếu được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 ⁰C đến 5 ⁰C.

4.9. Huyền phù dehydrogenaza malate/lactate dehydrogenaza

Trộn các lượng thích hợp của dehydrogenaza malat (MDH từ tim lợn, tạo huyền phù trong dung dịch amoni sulfat, 3,2 mol/l ở pH 6,0  0,2; EC 1.1.1.37)¹ và dehydrogenaza lactat (LDH từ cơ thỏ, tạo huyền phù trong dung dịch amoni sulfat, 3,2 mol/l ở pH 7,0  0,2; EC 1.1.1.27). Pha loãng với dung dịch amoni sulfat (nồng độ 3,2 mol/l) sao cho thu được huyền phù cuối cùng của MDH/ml chứa 600 đơn vị² và của LDH/ml chứa 1400 đơn vị².

Huyền phù dehydrogenaza lactat/dehydrogenaza malat có thể ổn định được 1 năm nếu được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 ⁰C đến 5⁰C.

4.10. Dung dịch lyaza xitrat

Hòa tan một lượng thích hợp của lyaza xitrat [lyophilisat (CL) từ Aerobacter aerogen; EC 4.1.3.6] trong nước đá sao cho thu được dung dịch chứa 40 đơn vị/ml²⁾.

Dung dịch lyaza xitrat này có thể ổn định được 1 tuần nếu được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 ⁰C đến 5 ⁰C và 4 tuần nếu được bảo quản ở âm 20 ⁰C.

4.11. Dung dịch chuẩn axit xitric

Hòa tan 1,600 g axit xitric ngậm một phần tử nước (C₆H₈O₇.H₂O) trong nước. Thêm nước đến 100 ml và trộn.

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

Việc ủ cuvet trong nồi cách thủy cần đến khi nhiệt độ phòng thấp hơn 20 ⁰C.

Mẫu gửi đến phòng thí nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

7. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu đồng nhất chú ý không làm thất thoát ẩm, sử dụng kỹ thuật sau đây:

a) Trong trường hợp phomat, loại bỏ cùi hoặc lớp bề mặt mốc của phomat sao cho thu được mẫu tại diện của phomat.

Nghiền hoặc xay mẫu thử bằng dụng cụ nghiền thích hợp, trộn nhanh mẫu nghiền hoặc xay và nghiền hoặc xay lần thứ hai, nếu có thể và trộn kỹ bằng cách khuấy trộn mạnh.

b) Trong trường hợp phomat chế biến, lấy phần mẫu đại diện cho sản phẩm. Trộn mẫu càng nhanh càng tốt và nghiền mẫu, nếu cần. Trộn kỹ bằng cách khuấy trộn mạnh.

c) Trong trường hợp phomat chế biến chứa các thành phần thức ăn khác (ví dụ: dăm bông, quả, hạt, rau thơm), thì xác định xem mục tiêu của phép phân tích là xác định hàm lượng axit xitric của phomat chế biến hay của toàn bộ sản phẩm. Đối với trường hợp xác định hàm lượng axit xitric của phomat thì tách riêng các phần thực phẩm khác rồi tiến hành như đối với phomat chế biến.

Chuyển mẫu thử sang hộp chứa có nắp đậy kín, để bảo quản khi phân tích. Đậy ngay hộp chứa. Tiến hành phân tích càng sớm càng tốt ngay sau khi chuẩn bị xong mẫu thử.

8. Cách tiến hành

8.1. Phép thử kiểm tra

8.1.1 Thực hiện phép thử trong 8.1.2 đến 8.1.4 để kiểm tra độ thu hồi của axit xitric khi

- mỗi mẻ thuốc thử mới (4.7 đến và kể cả 4.10) được đưa vào sử dụng.

- các thuốc thử đã được giữ trong tủ lạnh quá 2 tuần mà chưa được sử dụng.

- bắt đầu lại việc phân tích sau quá trình ngừng phân tích, hoặc

- các điều kiện xác minh chính phép thử đó.

8.1.2 Dùng pipet lấy 5,0 ml và 10,0 ml dung dịch chuẩn axit xitric (4.11) cho từng bình định mức một vạch 100 ml (5.5).

Cho 10 ml dung dịch axit tricloaxetic (4.2) vào mỗi bình. Pha loãng bằng nước đến 100 ml và trộn cho mỗi bình.

Xác định hàm lượng axit xitric trong cả hai dung dịch như trong 8.4.3 đến 8.5.3.

8.1.3 Tính hàm lượng axit xitric ngậm một phân tử nước của dung dịch chuẩn axit xitric (4.11) theo công thức (2) trong 9.1, nhưng khi sử dụng các giá trị sau:

- V₅ là thể tích của dung dịch chuẩn axit xitric (4.11) (V₅ = 1000 ml), tính bằng mililit (ml);

- V₆ là thể tích của dung dịch chuẩn axit xitric (8.12) (v₆ = 5 ml và 10 ml tương ứng), tính bằng mililit (ml);

- V₇ là thể tích của dung dịch chuẩn axit xitric đã pha loãng (8.1.2) (V₇ = 100 ml), tính bằng mililit (ml);

Cân khoảng 1 g, chính xác đến 0,1 mg, mẫu thử đã chuẩn bị (Điều 7) cho vào cốc có mỏ (5.3). Hòa tan mẫu thử trong khoảng 50 ml nước đã được làm ấm sơ bộ máy nghiền (5.4) đến khoảng từ 40 ⁰C đến 50 ⁰C. Chuyển hết lượng chứa trong cốc có mỏ sang bình định mức một vạch 100 ml (5.5). Làm nguội lượng chứa trong bình đến khoảng 20 ⁰C.

Thực hiện phép thử trắng đối với thuốc thử lặp lại hai lần. Thực hiện theo qui định trong 8.4 và 8.5, sử dụng tất cả các thuốc thử nhưng bỏ qua phần mẫu thử.

Chuyển hết lượng chứa trong cốc có mỏ sang bình định mức một vạch 100 ml (5.5). Thêm nước đến vạch và trộn.

Tiến hành xác định theo sơ đồ trong Bảng 1, chú ý đưa dung dịch đệm (4.7) và nước được sử dụng đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

Tính độ hấp thụ A, của từng cuvet được dùng để tính hàm lượng axit xitric (9.1), theo công thức (1):

Trong đó:

Nếu độ hấp thụ, A, vượt quá 0,800, thì lặp lại qui trình qui định trong 8.5.1 và 8.5.2, sử dụng dung dịch lỏng thích hợp của dịch lọc từ cả phần mẫu thử (8.2) lẫn mẫu thử trắng (8.3).

Tính hàm lượng axit xitric, w, bằng phần trăm khối lượng axit xitric khan, theo công thức (2):

Trong đó:

V₄ là thể tích của dịch lọc đã khử protein (8.4.3) được lấy để chỉnh pH đến 8 (8.4.4), tính bằng mililit (ml) (V₄= 25 ml);

Báo cáo kết quả ba chữ thập phân.

Các giá trị về độ lặp và độ tái lập thu được từ phép thử liên phòng thí nghiệm này không hoàn toàn đáp ứng được yêu cầu của ISO 5425³, do đó độ tin cậy của các kết quả này không chắc chắn.

CHÚ THÍCH: Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm này sẽ được công bố trong tạp chí sữa của Hiệp hội Sữa Quốc tế.

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, đơn lẻ thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá 5 % (tương đối) của trung bình các kết quả.

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp vượt quá 8 % (tương đối) của trung bình các kết quả.

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;

e) kết quả thử nghiệm thu được; nếu thõa mãn yêu cầu về độ lặp lại nêu kết quả cuối cùng thu được theo 10.1.
Phụ lục A

(Qui định)

Các nguyên tắc Thực hành Phòng thí nghiệm tốt (GLP) đối với việc phân tích bằng enzym thường ít được biết đến hơn so với các phép phân tích hóa học khác.

Nên đặc biệt chú ý về nguyên tắc này để thu được các kết quả có độ chính xác và độ chụm thỏa mãn yêu cầu.

Do đó, trước khi phân tích cần đọc kỹ các nguyên tắc GLP dưới đây.

CHÚ THÍCH: Các cuvet bằng chất dẻo có các ưu điểm hơn cuvet thủy tinh như sau:

- Giá rẻ (dùng một lần);

- Có khả năng phân tích với các lượng lớn hơn;

- Trong một mẻ, thì các cuvet bằng chất dẻo có độ hấp thụ tốt hơn.

A.3.2 Khi một mẻ các cuvet mới được đưa vào sử dụng, thì kiểm tra chiều dài đường quang của các cuvet dựa vào cuvet chính xác (ví dụ: cuvet thạch anh), như sau:

Làm đầy cuvet chính xác và cuvet bằng chất dẻo bằng nước và độ hấp thụ (A₁) của từng cuvet dựa vào không khí. Sau khi tráng rửa, làm đầy các cuvet bằng dung dịch NADH (khoảng 0,15 mg/ml) và đo lại độ hấp thụ (A₂) dựa vào không khí.

Đối với cả cuvet chính xác lẫn các cuvet bằng chất dẻo, tính (A₂ - A₁). Chênh lệch của các (A₂ - A₁) giữa hai loại cuvet không được khác nhau nhiều. Nếu chênh lệch (A₂ - A₁) vượt quá 0,5 % độ hấp thụ của cuvet chính xác, thì tính trung bình phần trăm chênh lệch và đưa vào để tính chiều dài đường quang (1 cm) trong phần tính kết quả (9.1).

A.3.3 Luôn sử dụng các cuvet không bị xước và sạch. Chỉ làm sạch hoặc làm khô các mặt của cuvet quang học bằng khăn mềm.

A.3.4 Không đo độ hấp thụ của cuvet mẫu thử dựa vào cuvet thử mẫu trắng, vì sẽ không thu được thông tin về mức cường độ hấp thụ của chính phép thử trắng. Cần đo độ hấp thụ của hai cuvet mẫu thử và cuvet mẫu thử trắng dựa vào không khí và tính chênh lệch.

A.3.5 Không đo độ hấp thụ của cuvet đựng mẫu hoặc cuvet mẫu trắng dựa vào cuvet trống (bởi vì tán xạ ánh sáng).

A.3.6 Trộn lượng chứa trong cuvet bằng cách trộn chất dẻo hoặc bằng cách dùng parafin làm kín cuvet rồi xoay nhẹ cuvet.

A.3.7 Loại hết bọt khí trên thành cuvet bằng cánh trộn. Tránh làm xước mặt trong cuvet.

A.3.8 Luôn sử dụng cùng một lại cuvet để đo mẫu thử và đo mẫu trắng.

A.3.9 Luôn đặt cuvet ở cùng một vị trí và cùng hướng trong giá đựng cuvet. Chú ý đánh dấu một mặt của cuvet.

A.4. Đo quang và đo phổ

A.4.1. Yêu cầu chung

Sử dụng máy đo phổ (chiều rộng dải tần  10 nm) có gắn bộ lọc nhiễu (chiều rộng dải tần  10 nm), hoặc máy đo quang vạch phổ được gắn với đèn hơi thủy ngân. Các phép đo được tiến hành bằng máy đo phổ hoặc máy đo quang có bộ lọc phải được thực hiện ở độ hấp thụ tối đa của NADH hoặc NADPH, nghĩa là 340 nm, phép thử được tiến hành sử dụng máy đo quang vạch phổ có đèn hơi thủy ngân phải được đo ở 365 nm hoặc 334 nm.

CHÚ THÍCH: Các hệ số hấp thụ phân tử NADH và NADPH được đo ở 334 nm, 340 nm và 365 nm như sau:

NADH và NADPH ở bước sóng 334 nm (Hg):	6,18 x 106 cm2/mol
NADH và NADPH ở bước sóng 340 nm:	6,3 x 106 cm2/mol
NADPH ở bước sóng 365 nm (Hg):	3,5 x 106 cm2/mol
NADH ở bước sóng 365 nm (Hg):	3,4 x 106 cm2/mol

A.4.2. Kiểm tra độ tuyến tính

Mối quan hệ tuyến tính đến độ hấp thụ 2,0 phải tồn tại giữa độ hấp thụ và nồng độ của NADH hoặc NADPH. Kiểm tra như sau:

a) Dùng pipet lấy 2,0 ml nước cất cho vào cuvet. Đo độ hấp thụ A₀ dựa vào không khí;

b) Dùng pipet 0,10 ml dung dịch NADH (0,5 mg/ml) cho vào cuvet và trộn. Đo độ hấp thụ A₁.

Tính độ hấp thụ giảm, A_r1, theo công thức sau:

A_r1 = (A₁ - A₀) x

Trong đó

A₁ độ hấp thụ thu được của dung dịch NADH [xem b)];

A₀ độ hấp thụ thu được của nước [ xem a)].

c) Lặp lại qui trình mô tả trong b) ỏ trên thêm 14 lần. Sau mỗi cặp phép đo, tính độ hấp thụ giảm A_M, theo công thức sau:

A_rn = (A_n- A₀) x

Trong đó

A₀ là thể tích lượng chứa trong cuvet tạp phép đo thử n.

d) Đối với mỗi phép đo, vẽ đồ thị của thể tích dung dịch NADH có mặt trong cuvet dựa theo các độ hấp thụ giảm. Phải thu được đường thẳng nối từ các điểm giao nhau thu được.

A.5. Pipet tự động và các bộ phân phối khác

A.5.1. Sử dụng các pipet tự động và các bộ phân phối khác theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.5.2. Sử dụng các đầu tip thích hợp cho từng pipet.

A.5.3. Kiểm tra định kỳ các qui định về thể tích, độ lặp lại của pipet tự động và các bộ phân phối khác (ví dụ: hàng tháng), như sau:

a) cân cốc thủy tinh có mỏ với nước ở thời điểm t;

b) một pipet hoặc bộ phân phối đong nước cho vào cốc có mỏ và cân chính xác ở thời điểm t + 1 min sau lần thứ nhất;

c) lặp lại qui trình hút bằng pipet hoặc bộ phân phối như ở b) 9 lần

d) cân cốc có mỏ không có pipet hoặc bộ phân phối ở thời điểm t + 11 min, t + 12 min, t + 13 min, t + 14 min và t + 15 min; tính khối lượng hao hụt hơi sau mỗi phút.

e) tính thể tích và độ lặp lại của pipet hoặc bộ phân phối, có tính đến hao hụt nước do bay hơi.

Kiểm tra hiện tượng này bằng qui định trong A.5.3 và tránh sử dụng các pipet này.

Có thể dùng pipet để lấy các lượng nhỏ dung dịch/huyền phù enzym (10 l đến 50 l) cho vào cánh trộn để đưa vào cuvet và dùng cánh trộn để trộn với lượng chứa trong cuvet.

CHÚ THÍCH: Các chất chuẩn có độ tinh khiết đã được xác nhận có thể thu được các tổ chức như là Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia hoặc Trung tâm chuẩn của Châu Âu (BCR).

CHÚ THÍCH: Lượng chất lỏng dính lại trên cánh trộn phải không đáng kể.

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] TCVN 6910-1 : 2001 (ISO 5725-1 : 1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Các định nghĩa và nguyên tắc chung.

[3] TCVN 6910-2 : 2001 (ISO 5725-2 : 1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản để xác định độ lặp lại và độ tái lặp của phương pháp đo.