TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 8160-3 : 2010 en 12014-3: 2005

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT VÀ/HOẶC NITRIT - PHẦN 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT VÀ NITRIT TRONG SẢN PHẨM THỊT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ

TCVN 8160-3:2010 hoàn toàn tương đương với EN 12014-3:2005;

TCVN 8160-3:2010 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit bao gồm các phần sau:

- TCVN 7814:2007 (EN 12014-2:1997), Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit - Xác định hàm lượng nitrat trong rau và sản phẩm rau bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao/trao đổi ion;

- TCVN 8160-3:2010 (EN 12014-3:2005), Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit - Phần 3: Xác định hàm lượng nitrat và nitrit trong sản phẩm thịt bằng đo phổ sau khi khử nitrat thành nitrit bằng enzym;

- TCVN 8160-4:2009 (EN 12014-4:2005), Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit - Phần 4: Phương pháp xác định hàm lượng nitrat và nitrit trong sản phẩm thịt bằng sắc ký trao đổi ion;

- TCVN 8160-5:2010 (EN 12014-5:1997), Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit - Phần 5: Xác định hàm lượng nitrat trong thực phẩm chứa rau dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ bằng phương pháp enzym;

- TCVN 8160-7:2010 (EN 12014-7:1998), Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit - Phần 7: Xác định hàm lượng nitrat trong rau và sản phẩm rau bằng phương pháp phân tích dòng liên tục sau khi khử bằng cadimi.

Bộ tiêu chuẩn EN 12014 còn có phần sau:

- EN 12014-1, Foodstuffs - Determination of nitrate and/or nitrite content - Part 1: General considerations (Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit - Phần 1: Xem xét chung).

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp đo phổ để xác định hàm lượng nitrat và nitrit trong các sản phẩm thịt, phương pháp này đã được thẩm định trên các sản phẩm thịt khác nhau có hàm lượng nitrit từ 9 mg/kg đến 22 mg/kg tính theo natri nitrit và hàm lượng nitrat từ 23 mg/kg đến 48 mg/kg tính theo natri nitrat.

CHÚ THÍCH: Kinh nghiệm cho thấy rằng phương pháp này cũng có thể áp dụng cho các sản phẩm chứa tổng hàm lượng nitrat và nitrit trong khoảng từ 5 mg/kg đến 125 mg/kg tính theo natri nitrit. Thông tin thêm về khả năng áp dụng, xem [1].

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3. Nguyên tắc

Nitrit trong dịch chiết của mẫu thử được xử lý bằng sulfanilamide và N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride. Đo độ hấp thụ của hợp chất màu đỏ tạo thành tại bước sóng 540 nm [2].

Nitrat trong dịch chiết của mẫu phân tích được chuyển thành nitrit bằng enzym khử nitrat (nitrat reductaza). Nitrit được chuyển thành cùng với nitrit có sẵn trong mẫu phân tích sẽ phản ứng với sulfanilamide và N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride. Cường độ màu của hợp chất màu đỏ tạo thành này được đo bằng máy đo phổ ở bước sóng 540 nm. Hàm lượng nitrat được tính từ chênh lệch kết quả giữa các phép đo phổ.

4. Thuốc thử

4.1. Yêu cầu chung

Tất cả các thuốc thử và vật liệu được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích và nước được sử dụng ít nhất phải là loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696). Khi chuẩn bị các dung dịch, cần tính đến độ tinh khiết của các thuốc thử có sẵn.

Hòa tan 150 g kali hexaxyanoferat (II) (K₄[Fe(CN)₆].3H₂O) vào nước và pha loãng bằng nước đến 1000 ml. Bảo quản dung dịch này trong chai màu nâu và thay dung dịch mới sau hai tháng.

Hòa tan trong nước 230 g kẽm axetat Zn(CH₃COOH)₂.2H₂O và thêm nước đến 1000 ml.

Hòa tan 0,68 g imidazol trong 80 ml nước đựng trong bình định mức 100 ml, chỉnh pH đến 7,8 bằng axit hydrochloric [c(HCl) = 2 mol/l] và pha loãng bằng nước đến vạch.

Hòa tan 125 mg -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate dạng khử và 2,5 mg muối dinatri của flavin adenin dinucleotide (có ít nhất 88 % phần khối lượng) vào 50 ml dung dịch đệm imidazol (4.5.1). Chuẩn bị dung dịch này ngay trước khi sử dụng.

Hòa tan 11 mg nitrat reductaza khô lạnh từ Aspergillus sp. (EC 1.6.6.2, khoảng 0,4 U mg/mg³⁾) trong 10 ml dung dịch đệm imidazol (4.5.1) và thêm 50 mg muối dinatri ngậm hai phân tử nước của axit ethylenedintrilotetraacetic.

Dung dịch này bền trong khoảng 14 ngày khi được bảo quản ở 4 ^oC.

4.6. Thuốc thử màu

4.6.1. Thuốc thử màu số 1

Hòa tan 8 g sulfanilamide vào 500 ml nước đang được làm nóng trên nồi cách thủy (5.3). Làm nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng và lọc, nếu cần. Vừa thêm vừa khuấy 330 ml axit hydrochloric (4.9) và pha loãng dung dịch bằng nước đến 1 000 ml. Dung dịch này có thể bền được vài tuần ở nhiệt độ phòng.

Hòa tan 0,330 g N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride trong 250 ml nước. Giữ dung dịch trong chai màu nâu và thay dung dịch sau mỗi tuần.

Chuẩn bị lượng hỗn hợp thuốc thử màu cần thiết bằng cách trộn các phần thể tích bằng nhau của các thuốc thử màu số 1 (4.6.1) và số 2 (4.6.2) ngay trong ngày sử dụng.

Nên chuẩn bị các dung dịch chuẩn natri nitrit trong ngày sử dụng.

Hòa tan trong nước 200 mg natri nitrit, được cân chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức 500 ml rồi thêm nước đến vạch.

Dung dịch gốc này có thể bền 2 tuần nếu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 ^oC.

4.7.3. Dung dịch gốc natri nitrit pha loãng, (NaNO₂) = 20 mg/l

Dùng pipet lấy 25 ml dung dịch gốc natri nitrit (4.7.2) cho vào bình định mức 500 ml và pha loãng bằng nước đến vạch.

Dùng pipet lấy 10 ml, 20 ml, 30 ml và 40 ml dung dịch gốc đã pha loãng (4.7.3) có chứa tương ứng 0,13 m, 0,27 mg, 0,40 mg và 0,53 mg nitrit, cho vào một dãy các bình định mức 200 ml, thêm dung dịch natri hydroxit (4.2) để chỉnh pH đến khoảng từ 8,0 đến 8,5, dùng máy đo pH (5.5).

Thêm 4 ml của từng dung dịch Carrez số 1 (4.3) và số 2 (4.4), lắc sau mỗi lần thêm, pha loãng bằng nước đến vạch, trộn kỹ lượng chứa trong bình rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp (5.4). Loại bỏ 20 ml dịch lọc đầu tiên.

4.8. Dung dịch kali nitrat

4.8.1. Yêu cầu chung

Nên chuẩn bị các dung dịch kali nitrat trong ngày sử dụng.

Hòa tan trong nước 300 mg kali nitrat, đã được cân chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức rồi thêm nước đến vạch.

Dùng pipet lấy 25 ml dung dịch gốc kali nitrat pha loãng (4.8.2) vào bình định mức 500 ml và pha loãng dung dịch bằng nước đến vạch.

Dùng pipet lấy 10 ml, 20 ml, 30 ml và 40 ml dung dịch gốc pha loãng (4.8.3) có chứa tương ứng 0,14 mg, 0,27 mg, 0,41 mg, 0,55 mg ion nitrit, cho vào một dãy các bình định mức 200 ml, thêm dung dịch natri hydroxit (4.2) để chỉnh pH đến khoảng từ 8,0 đến 8,5 sử dụng máy đo pH (5.5).

Thêm 4 ml của từng dung dịch Carrez số 1 (4.3) và số 2 (4.4), lắc sau mỗi lần thêm, pha loãng bằng nước đến vạch, trộn kỹ lượng chứa trong bình và lọc qua giấy lọc gấp nếp (5.4). Loại bỏ 20 ml dung dịch lọc đầu tiên.

4.9. Axit clohydric, bốc khói, w = 37 %⁵⁾, không chứa nitrit.

5. Thiết bị, dụng cụ

5.1. Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

Đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm bằng thiết bị thích hợp (5.2). Chú ý không để nhiệt độ của mẫu vượt quá 25 ^oC. Nếu sử dụng máy nghiền thì nghiền mẫu ít nhất hai lần. Cân 10 g mẫu đồng nhất, chính xác đến 10 mg, cho vào bình nón cổ rộng, thêm khoảng 50 ml nước và đồng hóa trong khoảng từ 30 s đến 60 s. Rửa sạch trục của thiết bị đồng hóa trong bình cầu bằng 50 ml nước nóng. Thêm dung dịch natri hydroxit (4.2) điều chỉnh pH đến khoảng từ 8,0 đến 8,5, dùng máy đo pH (5.5). Làm nóng bình cầu khoảng 15 min trong nồi cách thủy đun sôi (5.3), thỉnh thoảng lắc bình.

CHÚ THÍCH: Đối với các sản phẩm thịt chưa nấu thì pH không nên vượt quá 8,5 vì nếu không thì không thể làm trong được các dung dịch bằng cách lọc sau khi thêm thuốc thử Carrez. Trong trường hợp của xúc xích Frankfurter hoặc các mẫu đã nấu chín như xúc xích gan, thì việc làm trong với thuốc thử Carrez là dễ dàng hơn và pH có thể được phép tăng đến khoảng 9,5.

Làm nguội bình đến nhiệt độ phòng và chuyển lượng chứa trong bình cầu sang bình định mức 200 ml và thêm 4 ml mỗi dung dịch thuốc thử Carrez số 1 (4.3) và số 2 (4.4), lắc sau mỗi lần thêm. Sau đó pha loãng bằng nước đến vạch, trộn kỹ rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp (5.4), loại bỏ 20 ml dịch lọc đầu tiên. Làm sạch phần dịch lọc để sử dụng cho phép xác định (mẫu dung dịch).

Trộn 2,0 ml của mỗi dung dịch chuẩn natri nitrit (4.7.4) với 1,0 ml nước và 3,0 ml hỗn hợp thuốc thử màu (4.6.3) trong một ống nghiệm, lắc và bảo quản dung dịch ở nhiệt độ phòng và để ở nơi tối.

Sau 30 min, đo độ hấp thụ của mỗi dung dịch ở bước sóng 540 nm trong máy đo phổ (5.6) so với nước.

Dựng đồ thị của mối quan hệ giữa độ hấp thụ thu được của bốn dung dịch chuẩn natri nitrit (4.7.4) và lượng ion nitrit tương ứng (mg trong 200 ml dung dịch).

Đưa 0,2 ml dung dịch NADPH (4.5.2), 2,0 ml của mỗi dung dịch chuẩn kali nitrat (4.8.4) tương ứng và 0,8 ml dung dịch đệm nitrat reductaza (4.5.3) vào một ống nghiệm, trộn kỹ và để yên 1 h ở nhiệt độ phòng. Sau đó, thêm 3,0 ml hỗn hợp thuốc thử màu (4.6.3), lắc và bảo quản các dung dịch ở nhiệt độ phòng, để ở nơi tối.

Sau 30 min, đo độ hấp thụ của mỗi dung dịch ở bước sóng 540 nm trong máy đo phổ (5.6) so với nước.

Dựng đồ thị các giá trị độ hấp thụ thu được của bốn dung dịch chuẩn kali nitrat (4.8.4) dựa theo các lượng ion nitrit tương ứng (mg trong 20 ml dung dịch) sau khi khử.

Trộn 2,0 ml dung dịch mẫu (6.1) trong cuvet với 1,0 ml nước và 3,0 ml hỗn hợp thuốc thử màu (4.6.3) và để yên ở nhiệt độ phòng, để ở nơi tối.

Sau 30 min đo độ hấp thụ trong máy đo phổ (5.6) ở bước sóng 540 nm so với nước.

6.4. Đo tổng hàm lượng nitrit sau khi khử

Lấy 0,2 ml dung dịch NADPH (4.5.2), 2,0 ml dung dịch mẫu thử (6.1) tương ứng và 0,8 ml dung dịch đệm nitrat reductaza (4.5.3) cho vào ống nghiệm, trộn kỹ và để yên 1 h ở nhiệt độ phòng. Sau đó, thêm 3,0 ml hỗn hợp thuốc thử màu (4.6.3), lắc và bảo quản các dung dịch ở nhiệt độ phòng, để ở nơi tối.

Sau 30 min, đo độ hấp thụ A­_tổng-NO2 ở bước sóng 540 nm trong máy đo phổ (5.6) so với nước.

7. Đánh giá

7.1. Tính toán hàm lượng natri nitrit

Đọc giá trị tuyệt đối của nitrit, tương ứng với giá trị hấp thụ từ 6.3 xác định nitrit mà không có bước khử từ đường chuẩn nitrit trong 6.2.1.

Phần khối lượng của natri nitrit, tính bằng miligam natri nitrit trên kilogam mẫu sử dụng công thức (1):

(1)

trong đó:

1,50 hệ số để tính nitrat natri từ nitrit (= 68,995/46,005).

Làm tròn kết quả đến số nguyên.

7.2. Tính toán hàm lượng natri nitrat

Tính hàm lượng natri nitrat là chênh lệch giữa hàm lượng nitrit tổng số sau khi khử (6.4) và hàm lượng nitrit (6.3).

Tính toán phần khối lượng của natri nitrat, theo miligam của natri nitrat trên kilogam mẫu sử dụng công thức (2):

= (2)

trong đó:

m là khối lượng phần mẫu thử, trong 200 ml dung dịch mẫu, tính bằng gam (g);

1,85 là hệ số để tính natri nitrat từ nitrit (= 84,994 / 46,005).

Làm tròn kết quả đến số nguyên.

Ngoài ra, việc đánh giá và tính toán cũng có thể được thực hiện bằng cách sử dụng hồi quy tuyến tính.

Chi tiết về phép thử liên phòng thử nghiệm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các chất nền khác với các giá trị đã nêu trong Phụ lục A.

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r:

Các giá trị đối với natri nitrit là:

Hỗn hợp giăm bông với xúc xích thịt bò và thịt lợn có các hạt thô: = 21,9 mg/kg r = 3,5 mg/kg

Hỗn hợp xúc xích Wiener, xúc xích thịt bò và thịt lợn chưa chế biến: = 9,2 mg/kg r = 1,7 mg/kg

Các giá trị đối với natri nitrat là:

Hỗn hợp giăm bông với xúc xích thịt bò và thịt lợn có các hạt thô: = 46,5 mg/kg r = 8,8 mg/kg

Giăm bông nguyên liệu: = 48,1 mg/kg r = 10,7 mg/kg

Hỗn hợp xúc xích Wiener, xúc xích thịt bò và thịt lợn chưa chế biến: = 22,9 mg/kg r = 2,8 mg/kg

8.2. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau do hai phòng thử nghiệm khác nhau thực hiện, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R.

Các giá trị đối với natri nitrit là:

Hỗn hợp giăm bông với xúc xích thịt bò và thịt lợn có các hạt thô: = 21,9 mg/kg R = 5,9 mg/kg

Hỗn hợp xúc xích Wiener, xúc xích thịt bò và thịt lợn chưa chế biến: = 9,2 mg/kg R = 3,7 mg/kg

Các giá trị đối với natri nitrat là:

Hỗn hợp giăm bông với xúc xích thịt bò và thịt lợn có các hạt thô: = 46,5 mg/kg R = 11,9 mg/kg

Giăm bông nguyên liệu: = 48,1 mg/kg R = 14,0 mg/kg

Hỗn hợp xúc xích Wiener, xúc xích thịt bò và thịt lợn chưa chế biến: = 22,9 mg/kg R = 7,0 mg/kg

8.4. Giới hạn định lượng

Khi áp dụng phương pháp này thu được các giới hạn định lượng như sau: Đối với natri nitrit là 1,4 mg/kg và đối với natri nitrat là 3,6 mg/kg.

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp sử dụng;

c) kết quả thử nghiệm thu được và đơn vị tính;

d) ngày lấy mẫu và phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu biết);

e) ngày phòng thử nghiệm nhận được mẫu;

f) ngày thử nghiệm;

g) nêu độ lặp lại, nếu độ lặp lại được kiểm tra;

h) mọi chi tiết đặc biệt quan sát được trong khi thử nghiệm;

i) mọi chi tiết thao tác khác với quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.
Phụ lục A

(Tham khảo)

Các thông số trong Bảng A.1 và A.2 đã được xác định trong các phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với TCVN 6910 (ISO 5725) (tất cả các phần [3]. Phép thử do Viện Sức khỏe tiêu dùng và Thú y Liên Bang Đức (cũ) (Bundesinstitut fur gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaxmedizin, BgW) thực hiện [1], [2].

Mẫu	Hỗn hợp giăm bông với xúc xích thịt bò và thịt lợn có các hạt thô	Giăm bông nguyên liệu	Hỗn hợp xúc xích Wiener và xúc xích thịt bò và thịt lợn chưa chế biến
Năm thử nghiệm	2002	2002	2002
Số mẫu	1	1	1
Số lượng phòng thử nghiệm	13	13	12
Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ ngoại lệ	13	13	12
Số lượng giá trị ngoại lệ quan sát được	0	2	0
Số lượng kết quả được chấp nhận	68	63	60
Giá trị trung bình , mg/kg	21,9	23,0	9,2
Độ lệch chuẩn lặp lại sr mg/kg	1,2	1,9	0,6
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSDr, %	5,7	8,1	6,5
Giới hạn lặp lại r, mg/kg	3,5	5,3	1,7
Độ lệch chuẩn tái lập sR­, mg/kg	2,1	7,1	1,3
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSDR, %	9,5	30,7	14,0
Giới hạn tái lập R, mg/kg	5,9	20,0	3,7
Chỉ số Horrat R	0,9	3,1a	1,2
a Theo chỉ số Horwitz [4] thì dữ liệu độ chụm đối với các nồng độ nitrit cao được đánh giá là không thể chấp nhận được và chỉ được đưa ra chỉ để cung cấp thông tin.

Mẫu	Hỗn hợp giăm bông với xúc xích thịt bò và thịt lợn có các hạt thô	Giăm bông nguyên liệu	Hỗn hợp xúc xích Wiener và xúc xích thịt bò và thịt lợn chưa chế biến
Năm thử nghiệm	2002	2002	2002
Số lượng mẫu	1	1	1
Số lượng phòng thử nghiệm	13	13	12
Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ ngoại lệ	10	10	9
Số lượng giá trị ngoại lệ quan sát	0	0	1
Số lượng kết quả được chấp nhận	53	50	44
Giá trị trung bình , mg/kg	46,5	48,1	22,9
Độ lệch chuẩn lặp lại sr, mg/kg	3,1	3,8	1,0
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSDr, %	6,7	7,8	4,3
Giới hạn lặp lại r, mg/kg	8,8	10,7	2,8
Độ lệch chuẩn tái lập sR­, mg/kg	4,2	5,0	2,5
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSDR, %	9,1	10,3	10,7
Giới hạn tái lập R, mg/kg	11,9	14,0	7,0
Chỉ số Horrat R	1,0	1,2	1,1

[1] Arneth, W.; Herold, B. Nitrat/Nitrit-Bestimmung in Wurstwaren nach enzymasticher Reduktion (nitrate/nitrite determination in sausages after enzymatic reduction). Fleischwirstchaft, 1988:68, No. 6, page 761.

[2] Untersuchung von Lebensmitteln: Bestimmung des Nitrit- und Nitratgehaltes in Wurstwaren nach enzymatischer Reduktion; L 08.00-14 1990-12 (Food Analysis: Determination of nitrite and nitrate content of sausage products after enzymatic reduction: L 08.00-14 1990-12) in: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG: Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenstanden/Bundesamt fQr Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (In: Collection of official methods under article 35 of German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal Office of Consumer Protection and Food Safety) Loseblattausgabe, im Druck (Loose leaf edition, in press) Berlin, Koln: Beuth Verlag GmbH

[3] TCVN 6910 (ISO 5725) (tất cả các phần), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo

[4] Horwitz, W: International coordination and validation of analytical methods. In: Food Additives Contaminants, 1993, Vol 10, No 1, 61 - 69

[5] EN 12014-1, Foodstuff - Determination of nitrate and/or nitrite content - Part 1: General.