TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 7700-2: 2007 iso 11290-2: 1998 with amendment 1: 2004



tải về 0.71 Mb.
trang3/3
Chuyển đổi dữ liệu01.06.2018
Kích0.71 Mb.
1   2   3

B.1. Dung dịch đệm pepton

B.1.1. Thành phn

Dịch thuỷ phân mô động vật bằng enzym

10,0 g

Natri clorua (NaCI)

5,0 g

Dinatri hydro phosphat ngậm mười hai phân tử nước (Na2HPO412H2O)

9,0 g

Kali dihydro phosphat (KH2PO4)

1,5 g

Nước

1 000 ml

B.1.2. Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH [sử dụng máy đo pH (6.7)], sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường vào các bình cầu (6.8) có dung tích thích hợp để thu được các lượng cần thiết cho phép thử (xem 9.1).

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

B.2. Môi trường cơ bản đối với canh thang nửa Fraser có sắt (III) amoni xitrat [xem TCVN 7700-1 (ISO 11290-1)]

B.2.1. Môi trường cơ bản đối vái canh thang nửa Fraser

Dịch thuỷ phân mô động vật bằng enzym

5,0 g

Dịch thuỷ phân casein bằng enzym

5,0 g

Cao thịt

5,0 g

Cao men

5,0 g

Natri clorua (NaCI)

20,0 g

Dinatri hydro phosphat ngậm hai phân tử nước (Na2HPO42H2O)

12,0 g

Kali dihydro phosphat (KH2PO4)

1,35 g

Aesculin

1,0 g

Nước

1 000 ml

B.2.1.2. Chuẩn b

Hoà tan các thành phần hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7.2 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường vào các bình cầu (6.8) có dung tích thích hợp để thu được các lượng cần thiết cho phép thử (xem 9.1).

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

B.2.2. Dung dịch sắt (III) amoni xitrat

B.2.2.1. Thành phn

Sắt (III) amoni xitrat

5,0 g

Nước

100 ml

B.2.2.2. Chuẩn bị

Hoà tan sắt (III) amoni xitrat trong nước.

Khử trùng bằng cách lọc.

B.2.3. Chuẩn bị môi trường

Ngay trước khi sử dụng, cho 1,0 ml sắt (III) amoni xitrat (B.2.2) vào mỗi phần 100 ml môi trường cơ bản đối với canh thang nửa Fraser (B.2.1).



B.3. Thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti (ALOA5))

B.3.1 Môi trường cơ bản

B.3.1.1 Thành phn

Dịch thuỷ phân mô động vật bằng enzym

18 g

Dịch thuỷ phân casein bằng enzym

6g

Cao men

10 g

Natri pyruvat

2g

Glucoza

2g

Magie glyxerolphosphat

1 g

Magie sulfat (khan)

0,5 g

Natri clorua (NaCI)

5g

Liti clorua

10 g

Dinatri hydro phosphat (khan)

2,5 g

5-bromo-4-cloro-3-indolyt--D-glucopyranosit

0,05 g

Thạch

12 g đến 18 g a

Nước

930 ml b

a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

b 925 ml nếu sử dụng dung dịch amphoterixin B (xem B.3.5.2).

B.3.1.2. Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nuớc bằng cách đun sôi. Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.



Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,2 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

B.3.2. Dung dịch axit nalidixic

Muối natri của axit nalidixic

0,02 g

Natri hydroxit (0,05 mol/l)

5 ml

Hòa tan muối natri của axit nalidixic trong 5 ml natri hydroxit và lọc để khử trùng.

B.3.3. Dung dịch xeftazidim

Xeftazidim

0,02 g

Nước

5 ml

Hòa tan xeftazidim trong 5 ml nước và lọc qua màng 0,45 m để khử trùng.

B.3.4. Dung dịch polymyxin B

Polymyxin B sulfat

76 700 IU

Nước

5 ml

Hòa tan polymyxin B trong 5 ml nước và lọc qua màng 0,45 m để khử trùng.

B.3.5. Kháng sinh bổ sung

B.3.5.1. Dung dịch xycloheximit

Xycloheximit

0,05 g

Etanol

2,5 ml

Nước

2,5 ml

Hòa tan xycloheximit trong 2,5 ml etanol và sau đó thêm 2,5 ml nước. Lọc qua màng 0,45 m để khử trùng.

B.3.5.2 Dung dịch amphoterixin B (làm dung dịch thay thế cho xycloheximit)

Amphoterixin B

0,01 g

HCI (1 mol/l)

2,5 ml

Dimetylformamit (DMF)

7,5 ml

Hòa tan amphoterixin trong dung dịch HCI/DMF. Lọc qua màng 0,45 m để khử trùng.

CNH BÁO - Dung dịch HCI/DMF rất độc, cn thận trọng khi sử dụng.

B.3.6. Dung dịch bổ sung

Hòa tan 2 g L--phosphatidylinositol (Sigma P 6636 6)) trong 50 ml nước lạnh.

Khuấy khoảng 30 phút cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 °C và làm nguội đến khoảng nhiệt độ từ 48 °C đến 50 °C.



B.3.7. Môi trường hoàn chỉnh

B.3.7.1. Thành phn

Môi trường cơ bản (B.3.1)

930 mla

Dung dịch axit nalidixic (B.3.2)

5 ml

Dung dịch xeftazidim (B.3.3)

5 ml

Dung dịch polymyxin B (B.3.4)

5 ml

Dung dịch xycloheximit (B.3.5.1) hoặc dung dịch amphoterixin B (B.3.5.2)

10 ml

Dung dịch bổ sung (B.3.6)

50 ml

a 925 ml nếu sử dụng dung dịch amphoterixin B.

B.3.7.2. Chuẩn bị

Cho các dung dịch trên vào môi trường cơ bản tan chảy đến 50 °C, trộn kỹ sau mỗi lần thêm.

pH của môi trường hoàn chỉnh phải là 7,2 ± 0,2 ở 25 °C.

Môi trường hoàn chỉnh phải mờ đục đồng đều.



B.3.7.3 Chuẩn bị các đĩa thạch

Cho vào mỗi đĩa Petri từ 15 ml đến 20 ml môi trường hoàn chỉnh vừa mới chuẩn bị, rồi để cho đông đặc



B.4. Môi trường nuôi cấy đặc: Thạch từ dịch chiết nấm men trypton dậu tương (TSYEA)

B.4.1 Thành phn

Dịch thuỷ phân casein bằng enzym

17,0 g

Dịch thuỷ phân đậu tương bằng enzym

3,0 g

Natri clorua (NaCI)

5,0 g

Dikali hydro phosphat (K2HPO4)

2,5 g

D-Glucoza

2,5 g

Cao men

6 g

Thạch

9 g đến 18 g 1)

Nước

1 000 ml

1) Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường này vào các ống nghiệm có dung tích thích hợp để có được các lượng cần thiết cho phép thử.

Khử trùng 15 phút trong nối hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

Để yên trong tư thế nghiêng.

Để chuẩn bị các đĩa thạch, phân phối vào các đĩa Petri vô trùng với các lượng môi trường thích hợp cho phép thử. Để yên cho đông đặc.

CHÚ THÍCH Nếu thực hiện phép thử rọi Henry, thì lớp môi trường phải mỏng (khoảng 12 ml cho một đĩa có đường kính 90 mm).

B.5. Môi trường nuôi cấy lỏng: Canh thang từ dịch chiết nấm men trypton đậu tương (TSYEB)

B.5.1. Thành phn

Dịch thuỷ phân casein bằng enzym

17,0 g

Dịch thuỷ phân đậu tương bằng enzym

3,0 g

Natri clorua (NaCI)

5,0 g

Dikali hydro phosphat (K2HPO4)

2,5 g

D-Glucoza

2,5 g

Cao men

6g

Nước

1 000 ml

B.5.2. Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường này vào các ống nghiệm hoặc bình có dung tích thích hợp để có được các lượng cần thiết cho phép thử.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

B.6. Thạch huyết cừu

B.6.1. Môi trường cơ bản

B.6.1.1. Thành phn

Dịch thuỷ phân mô động vật bằng enzym

15 g

Dịch thuỷ phân gan bằng enzym

2,5 g

Cao men

5g

Natri clorua (NaCI)

5g

Thạch

9 g đến 18 g 1)

Nước

1 000 ml

1) Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

B.6.1.2. Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,2 ± 0,2 ở 25 °c, nếu cần.

Phân phối môi trường này vào các bình có dung tích thích hợp để có được các lượng cần thiết cho phép thử.

Khử trùng 15 phút trong nỗi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

B.6.2. Môi trưng hoàn chỉnh

B.6.2.1. Thành phn

Môi trường cơ bản (B.6.1)

100 ml

Huyết cừu đã khử fibrin

5 ml đến 7 ml

B.6.2.2 Chuẩn bị

Cho huyết cừu vào môi trường cơ bản đã làm nguội đến 47 °C. Trộn đều.

Phân phối môi trường này vào các đĩa Petri vô trùng với các lượng thích hợp cho phép thử. Để yên cho đông đặc.

B.7. Canh thang sử dụng cacbohydrat (ramnoza và xyloza)

B.7.1. Môi trường cơ bản

B.7.1.1. Thành phần

Dịch thủy phân mô động vật bằng enzym

10 g

Cao thịt

1 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Bromocresol tía

0,02 g

Nước

1 000 ml

B.7.1.2 Chuẩn b

Hoà tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 6,8  0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường này vào các ống nghiệm có dung tích thích hợp để có được các lượng cần thiết cho phép thử.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 °C.

B.7.2 Dung dịch hydrat cacbon

B.7.2.1 Thành phn

Hydrat cacbon 1)

5g

Nước

100 ml

1) L-Ramnosa hoặc D-xylosa




B.7.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan riêng rẽ từng hydrat cacbon vào 100 ml nước.

Lọc để khử trùng.

B.7.3. Môi trường hoàn chỉnh

Đối với từng loại hydrat cacbon, thêm xml dung dịch B.7.2 vào 9x ml môi trường cơ bản (B.7.1).



B.8. Môi trường thạch di động

B.8.1. Thành phần

Dịch thuỷ phân casein bằng enzym

20,0 g

Dịch thuỷ phân mô động vật bằng enzym

6,1 g

Thạch

3,5 g

Nước

1 000 ml

B.8.2 Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường này với các lượng 5 ml vào các ống nghiệm.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 °C.

B.9. Môi trường CAMP (Christie, Atkins, Munch-Paterson) và chủng xét nghiệm

Đối với phép thử này có thể sử dụng các đĩa thạch huyết cừu (B.6), nhưng tốt nhất là sử dụng các đĩa thạch hai lớp có lớp môi trường huyết cừu rất mỏng (xem B.9.3).



B.9.1. Môi trường cơ bn

Xem B.6.1.



B.9.2. Môi trưởng huyết cừu

Xem B.6.2.



B.9.3. Môi trưng hoàn chỉnh

Phân phối môi trường cơ bản (B.9.1) vào các đĩa Petri vô trùng, với các lượng khoảng 12 ml cho mỗi đĩa Petri đường kính 90 mm, để yên cho đông đặc. Rót đều một lớp rất mỏng môi trường huyết cừu (B.9.2) với các lượng không lớn hơn 3 ml trên một đĩa. Để yên cho đông đặc.

Nếu cho môi trường huyết cừu vào các đĩa môi trường cơ bản đã chuẩn bị trước, thì có thể phải làm ấm các đĩa này 20 phút bằng cách đặt chúng vào tủ ấm để ở 37 °C trước khi rót lớp môi trường huyết cừu.

B.9.4 Các chủng phản ứng CAMP

Chủng phân giải huyết  của S.aureus (ví dụ: NCTC 1803 hoặc ATCC 25923), chủng R.equi (ví dụ: NCTC 1621 hoặc ATCC 6939) và chủng L. monocytogenes (ví dụ: NCTC 11994) cần phải qua phép thử CAMP. Không phải tất cả các chủng S. aureus và chủng L. monocytogenes đều thích hợp đối với phép thử CAMP.

Bảo quản các chất cấy gốc của S. aureus, R. equi, L. monocytogenes, L. innocuaL. ivanivii bằng cách nuôi cấy lên môi trường TSVEA (B.4) đổ nghiêng, nuôi ấm ở 37°C từ 24 giờ đến 28 giờ, hoặc cho đến khi thấy mọc và bảo quản trong tủ lạnh +3 °C ± 2 °C. Cấy truyền ít nhất một lần trong một tháng và khẳng định độ thuần khiết của chúng bằng cách ria cấy lên các đĩa thạch TSYEA (B.4).

B.10. Dung dịch hydro peroxit

Sử dụng dung dịch 3 % (m/m).



B.11. Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (tùy chọn)

B.11.1. Thành phn

Dinatri hydro phosphat ngậm hai phân tử nước (Na2HPO4.2H2O)

8,98 g

Natri dihydro phosphat (NaH2PO4)

2,71 g

Natri clorua (NaCI)

8,5 g

Nước

1 000 ml

B.11.2. Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần trong nước.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7.2 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 °C.



B.12. Huyn phù huyết cầu cừu (tùy chọn)

Giữ tế bào huyết cừu ở +3 °C ± 2 °C truớc khi sử dụng.

Trước khi sử dụng phải kiểm tra dấu hiệu phân giải huyết (bị đỏ) trong lớp huyết thanh phía trên.

Nếu không phân giải huyết, thì lấy 2 ml lớp tế bào đỏ phía dưới cho vào 98 ml dung dịch đệm PBS (B.11).

Nếu thấy xuất hiện phân giải huyết, thì hòa khoảng 4 ml lớp tế bào đỏ trong 10 ml dung dịch đệm PBS và trộn nhẹ, rồi ly tâm. Nếu thấy có lớp nổi phía trên màu đỏ chứng tỏ có sự phân giải huyết, thì không sử dụng nữa và loại bỏ huyền phù gốc này. Nếu không thì gạn lớp nổi phía trên và cho 2 ml huyền phù tế bào này vào 98 ml dung dịch đệm PBS.

Bảo quản huyền phù này đến 5 ngày ở +3 °C ± 2 °C. Nếu thấy xuất hiện phân giải huyết thì loại bỏ.


PHỤ LỤC C

(tham khảo)

Phép thử rọi Henry

Kiểm tra các đĩa, sử dụng nguồn ánh sáng trắng, đủ để rọi tốt các đĩa, rọi vào đáy đĩa một góc 45° (xem hình C.1). Khi được kiểm tra dưới ánh sáng truyền trệch góc này (rọi Henry) trực tiếp trên đĩa, thì các khuẩn lạc Listeria spp cho thấy có màu xanh nhạt và bề mặt nổi hạt.





Hình C.1 - Kiểm tra các đĩa về khuẩn lạc nghi ngờ
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] LECLERCQ. A. Colonial atypical morphology and low recoveries of Listeria monocytogenes strains on Oxford, PALCAM, Rapid’L.mono and ALOA solid media. J. Microbiol. Methods 57, 2004, pp.251-258.



1 Tại thời điểm ban hành ISO này, ISO 6887:1993 đang được soát xét và đến nay đã được ban hành.

2 Đối với một mu đã cho có thể sử dụng cùng một bộ dàn mu, bằng cách bắt đu với độ pha loãng cao hơn.

3 Việc Kiểm tra này là không cn thiết nếu người phân tích thường xuyên phân tích phát hiện L.monocytogens.

4 Vùng phân giải huyết  có th nhìn thy rõ hơn bằng cách chuyển bt kỳ một khuẩn lạc mọc trên b mt đĩa thạch xung quanh dịch cấy đánh dấu.

5 ALOA là một ví dụ về môi trường thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tổ chức ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các môi trường khác nếu chúng cho các kết quả tương đương.

6 P6636 là tên thương mại của sản phẩm do hãng Sigma cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tổ chức ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng sản phẩm khác nếu chúng cho các kết quả tương đương.
1   2   3


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2016
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương