TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 10783-1: 2015 iso/ts 15216-1: 2013

tải về 0.5 Mb.

trang	2/3
Chuyển đổi dữ liệu	02.06.2018
Kích	0.5 Mb.
	#39300

1 2 3

6.2. Pipet có lọc và pipet_{, với các dải cỡ, ví dụ: 25 ml, 10 ml, 5 ml.}

_{6.3. Máy trộn Vortex.}

_{6.4. Máy lắc}_{, có thể vận hành ở tốc độ khoảng 500 dao động/min.}

_{6.5. Máy ủ lắc}_{, vận hành ở (37 ± 1,0) °C và (320 ± 20) dao động/min hoặc tương đương.}

_{6.6. Bệ lắc hoặc loại tương đương để sử dụng ở nhiệt độ phòng và vận hành ở (4 ± 2) °C, (60 ± 5) dao động/min.}

_{6.7. Bộ hút}_{hoặc thiết bị tương đương để loại bỏ dung dịch phía trên.}

_{6.8. Bộ gia nhiệt}_{, có thể vận hành ở (95 ± 1,0) °C hoặc tương đương.}

_{6.9. Nồi cách thủy}_{, có thể vận hành ở (60 ± 2,0) °C hoặc tương đương.}

_{6.10. Máy ly tâm và rotor}_{, có thể vận hành với tốc độ, nhiệt độ như sau:}

_{a) 10 000 x}_g_{ở (5 ± 3) °C với dung tích ống ít nhất là 35 ml thể tích;}

_{b) 10 000 x}_g_{ở (5 ± 3) °C với dung tích ống cỡ hẹp (15 mm là quá lớn) bền với cloroform ít nhất là 1 ml thể tích;}

_{c) 4 000 x}_g_{ở nhiệt độ phòng với dung tích dùng cho dụng cụ cô lọc ly tâm (6.17).}

_{6.11. Máy ly tâm micro.}

_{6.12. Máy ly tâm, ống}_và_{chai micro ly tâm}_{, với các dải cỡ: 1,5 ml, 5 ml, 15 ml, 50 ml .v.v… Nên sử dụng ống loại hẹp (15 mm là quá lớn) chịu được cloroform, có dung tích 1 ml.}

_{6.13. Máy đo pH}_{(hoặc dải thử pH)}

_{6.14. Gạc bông vô trùng.}

_{6.15. Túi lọc màng}_{, dung tích 400 ml.}

_{6.16. Bộ lọc màng tích điện dương}_{, có cỡ lỗ 0,45 µm (đường kính 47 mm).}

_{6.17. Dụng cụ cô lọc ly tâm}_{, có dung tích 15 ml và ngưỡng phân tử lượng tương đối 100 kDa.}

_{6.18. Nguồn chân không}_{hoặc thiết bị tương đương dùng để lọc và dùng cho tháp lọc có đường kính lỗ màng lọc 47 mm.}

_{6.19. Dao tách vỏ vô trùng}_{để tách vỏ của động vật nhuyễn thể hai mảnh vỏ (BMS).}

_{6.20. Bệ cao su,}_{để tách vỏ BMS.}

_{6.21. Kéo.}

_{6.22. Kẹp.}

_{6.23 Đĩa Petri vô trùng.}

_{6.24. Lưỡi dao cạo hoặc bộ đồng hóa tương đương.}

_{6.25. Găng tay bảo vệ an toàn.}

_{6.26. Thiết bị tách chiết ARN}_{thích hợp với phương pháp tách chiết dùng silica và hỗn hợp thuốc thử (5.2.1.6). Xem Phụ lục E nêu chi tiết về dụng cụ tách chiết ARN.}

_{6.27. Máy real-time PCR}_{, ví dụ: máy chu trình nhiệt, được gắn với nguồn năng lượng thích hợp để kích thích các phân tử huỳnh quang và có hệ thống detector huỳnh quang để phát hiện tín hiệu huỳnh quang sinh ra trong quá trình chạy PCR với mẫu dò thủy phân hóa học.}

_{6.28. Dụng cụ kết hợp dùng cho phản ứng real-time RT-PCR}_{, ví dụ: đĩa quang và nắp, thích hợp để sử dụng với máy real-time PCR đã chọn.}

_{7. Lấy mẫu}

_{Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể về lấy mẫu sản phẩm có liên quan thì cần đưa ra thỏa thuận giữa các bên.}

_{Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc không bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.}

_{8. Cách tiến hành}

_{8.1. Các yêu cầu chung của phòng thử nghiệm}

_{Nếu mẫu đưa đến phòng thử nghiệm ở trạng thái không đông lạnh thì không được làm đông lạnh trước khi thử nghiệm. Nếu mẫu đưa đến phòng thử nghiệm ở trạng thái vừa đông lạnh thì phải rã đông trước khi thử nghiệm. Việc chiết mẫu và chạy PCR phải được thực hiện ở khu vực làm việc hoặc phòng riêng biệt như quy định trong ISO 22174.}

_{8.2. Tách chiết virus}

_{Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào nền mẫu thực phẩm cần thử nghiệm.}

_{8.2.1. Vật liệu virus kiểm soát quá trình}

_{Ngay trước khi xử lý mẻ mẫu thử, lấy các lượng thể tích vật liệu virus kiểm soát quá trình (5.3.6) đủ cho tất cả các mẫu riêng lẻ (10 µl trên một mẫu thử cộng với 25 µl dư).}

_{Pha loãng (20 ± 0,5) µl phần vật liệu virus kiểm soát quá trình đã gộp đến 10}^-1_{(pha loãng 10 lần) bằng nước (5.2.1) và bảo quản ở (5 ± 3) °C tối đa 24 h hoặc chia thành các phần nhỏ để dùng mỗi lần và bảo quản ở –15 °C hoặc ở nhiệt độ thấp hơn để bảo quản lâu hơn.}

_{8.2.2. Kiểm soát quá trình âm tính}

_{Tiến hành chạy mẫu kiểm soát quá trình âm tính song song với chạy mẫu thử ở tần suất xác định theo chương trình đảm bảo chất lượng phòng thử nghiệm.}

_{8.2.3. Bề mặt thực phẩm}

_{Sử dụng gạc bông vô trùng đã làm ẩm trước trong PBC (5.3.4), lau bề mặt (diện tích tối đa 100 cm2) mẫu thử, ấn nhẹ gạc bông để dính các hạt chứa virus. Ghi lại phần diện tích gạc lau bằng centimet vuông.}

_{Thêm (10 ± 0,1) µl vật liệu virus kiểm soát quá trình (8.2.1) vào gạc bông.}

_{Ngay sau khi bổ sung vật liệu virus kiểm soát quá trình, nhúng gạc vào ống nghiệm chứa (490 ± 5) µl đệm phân giải, sau đó ép miếng gạc lên thành ống để loại bỏ chất lỏng. Lặp lại quá trình nhúng và ép ba lần hoặc bốn lần để đảm bảo thu được lượng virus tối đa.}

_{Đối với bề mặt mẫu gồ ghề mà có thể làm hỏng gạc bông thì có thể dùng nhiều miếng gạc để xử lý hết bề mặt mẫu.}

_{Giữ lại để chiết ARN.}

_{8.2.4. Quả mềm và rau salat}

_{Cắt (25 ± 0,3) g quả mềm hoặc rau salat thành miếng khoảng 2,5 cm x 2,5 cm x 2,5 cm (không cần cắt nếu quả có kích thước nhỏ hơn kích thước này) và chuyển vào khoang đựng mẫu của túi lọc màng dung tích 400 ml.}

_{Thêm (40 ± 1) ml dung dịch đệm TGBE (5.3.5) (đối với mẫu quả mềm, thêm pectinase 30 đơn vị từ}_A.niger_{, hoặc pectinase 1 140 đơn vị từ}_{A. aculeatus}_{vào dung dịch đệm) và (10 ± 0,1) µl vật liệu virus kiểm soát quá trình (8.2.1).}

_{Ủ ở nhiệt độ phòng và lắc liên tục ở khoảng 60 dao động/min trong (20 ± 1) min. Đối với quả mềm có tính axit thì cứ 10 min trong quá trình ủ lại kiểm tra pH của dịch quả. Nếu pH thấp dưới 9,0 thì phải chỉnh đến 9,5 ± 0,1 bằng NaOH. Kéo dài thời gian ủ 10 min mỗi lần để điều chỉnh pH. Gạn dịch rửa giải từ khoang lọc vào ống ly tâm (sử dụng hai ống, nếu cần, để thu được thể tích thích hợp).}

_{Làm trong dịch rửa giải thu được bằng cách ly tâm ở 10 000 x}_g_{trong (30 ± 5) min ở (5 ± 3) °C.}

_{Gạn phần nổi phía trên vào một ống hoặc chai sạch và chỉnh đến pH 7,0 ± 0,5 bằng HCl.}

_{Thêm các phần 0,25 thể tích của dung dịch 5 x PEG/NaCl (5.3.1) (để tạo nồng độ cuối cùng PEG 100 g/l, NaCl 0,3 mol/l), lắc để đồng hóa trong (60 ± 5) s sau đó ủ và lắc liên tục ở khoảng 60 dao động/min ở (5 ± 3) °C trong (60 ± 5) min.}

_{Ly tâm ở 10 000 x g trong (30 ± 5) min ở (5 ± 3) °C (chia thể tích sang hai ống ly tâm, nếu cần).}

_{Gạn và loại bỏ phần nổi phía trên, sau đó ly tâm ở 10 000 x g trong (5 ±1) min ở (5 ± 3) °C để tạo thành dạng hạt đặc.}

_{Gạn bỏ phần nổi phía trên và hòa lại hạt mẫu trong (500 ± 10) µl PBS (5.3.4). Nếu mẫu đã chia sang hai ống thì hòa lại cả hai phần hạt mẫu trong cùng một thể tích PBS.}

_{Để chiết mẫu rau salat, chuyển chất lỏng phía trên vào ống thích hợp và giữ lại để tách chiết ARN.}

_{Đối với quá trình chiết từ quả mềm, cần tiến hành bước làm trong tiếp theo. Chuyển huyền phù vào ống ly tâm loại hẹp chịu được cloroform (6.12). Thêm (500 ± 10) µl hỗn hợp cloroform/butanol (5.3.2), trộn bằng máy Vortex, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 min.}

_{Ly tâm ở 10 000 x g trong (15 ± 1) min ở (5 ± 3) °C. Chuyển cẩn thận pha lỏng vào một ống mới và giữ lại để tách chiết ARN.}

_{8.2.5. Nước uống đóng chai}

_{Trong tiêu chuẩn này thể tích thích hợp là từ 0,3 lít đến 5 lít. Đối với từng mẫu, ghi lại thể tích thử nghiệm.}

_{Thêm (10 ± 0,1) µl vật liệu virus kiểm soát quá trình (8.2.1) vào mẫu cần thử nghiệm. Lắc để trộn.}

_{Dùng chân không hoặc nguồn áp lực dương (6.18), sử dụng kỹ thuật vô trùng lọc toàn bộ mẫu qua bộ lọc màng tích điện dương 47 mm (6.16). Chuyển dịch lọc vào ống vô trùng, sau đó thêm (4 ± 0,1) ml dung dịch đệm TGBE (5.3.5).}

_{Thêm (10 ± 0,2) ml dung dịch đệm TGBE vào chai rỗng. Lắc cả ống và chai ở tốc độ khoảng 500 dao động/min trong (20 ± 5) min.}

_{Gộp dịch rửa giải từ ống nghiệm và chai với nhau vào một ống sạch.}

_{Rửa thành trong của chai bằng cách thêm (2 ± 0,1) ml dung dịch đệm TGBE, lắc mạnh và đảo chiều bằng tay, rồi cho hết vào ống nghiệm.}

_{Chỉnh pH của dịch rửa giải đến 7,0 ± 0,5 bằng HCl 0,1 mol/l và chuyển vào dụng cụ cô lọc ly tâm (6.17).}

_{Ly tâm ở 4 000 x}_g_{trong (15 ± 1) min. Chuyển dịch cô đặc vào một ống sạch.}

_{Chỉnh thể tích đến (500 ± 10) µl bằng PBS (5.3.4). Giữ lại để tách chiết ARN.}

_{8.2.6. Động vật nhuyễn thể hai mảnh vỏ (BMS)}

_{BMS dùng để phân tích phải sống hoặc nếu đông lạnh thì không bị hư hỏng. Phải loại bỏ bùn bám trên vỏ. Không được ngâm lại BMS vào trong nước.}

_{Dùng dao vô trùng tách vỏ tối thiểu 10 BMS. Khi tách, cần sử dụng găng tay bảo vệ để giữ động vật nhuyễn thể và kê mẫu trên bệ cao su.}

_{Dùng kéo hoặc kẹp hoặc dụng cụ tương đương cắt bỏ tuyến tiêu hóa của tất cả các mẫu động vật và chuyển vào đĩa Petri sạch. Khối lượng ruột tối thiểu cần là (2,0 ± 0,2) g.}

_{Cuối cùng, cắt tuyến tiêu hóa bằng lưỡi dao lam hoặc bộ đồng hóa tương đương để thu được mẫu dạng bột nhão, sau đó chuyển (2,0 ± 0,2) g vào ống ly tâm.}

_{Thêm (10 ± 0,1) µl vật liệu virus kiểm soát quá trình (8.2.1).}

_{Thêm (2,0 ± 0,2) ml dung dịch protease K (5.3.3) và trộn. Ủ ở (37 ± 1,0) °C, đồng thời lắc ở tốc độ 320 dao động/min trong máy ủ lắc hoặc loại tương đương trong (60 ± 5) min.}

_{Tiến hành ủ lần thứ hai bằng cách đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy hoặc thiết bị tương đương ở (60 ± 2,0) °C trong (15 ± 1) min.}

_{Ly tâm ở 3 000 x g trong (5,0 ± 0,5) min ở nhiệt độ phòng, gạn phần nổi phía trên vào một ống sạch, đo và ghi lại thể tích phần nổi phía trên, bằng mililit và giữ lại để tách chiết ARN.}

_{8.3. Tách chiết ARN}

_{Tách chiết ARN từ (500 ± 10) µl của mỗi mẫu thử sử dụng chất phân rã guanidin thiocyanat thích hợp và phương pháp hấp thụ trên nền silica. Rửa giải ARN đã tinh sạch trong (100 ± 2) µl dung dịch đệm rửa giải và giữ lại để phân tích real-time RT-PCR . ARN chiết được phải được xử lý ngay, bảo quản ở (5 ± 3) °C trong < 8 h hoặc ở –15 °C hoặc nhiệt độ thấp hơn lên đến 6 tháng.}

_{Nếu cần bảo quản lâu thì nên bảo quản ở nhiệt độ (–80 ± 5) °C.}

_{Đối với từng mẻ mẫu thử phải bao gồm cả kiểm soát tách chiết âm tính, trừ khi mẻ mẫu thử bao gồm mẫu kiểm soát quá trình âm tính (8.2.2). Tiến hành tách chiết ARN sử dụng cùng một phương pháp thực hiện đồng thời trên (500 ± 10) µl nước (5.2.1).}

_{Xem Phụ lục E nêu chi tiết về phương pháp tách chiết ARN.}

_{8.4. Phương pháp real-time RT-PCR}

_{8.4.1. Yêu cầu chung}

_{Các yêu cầu tối thiểu đối với phương pháp khuếch đại và phát hiện các trình tự axit nucleic bằng phương pháp real-time PCR quy định trong ISO 22174.}

_{8.4.2. Phương pháp real-time RT-PCR}

_{Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện HVA, norovirus nhóm gen I và norovirus nhóm gen II.}

_{Trong trường hợp nhất định, không cần thử nghiệm cả ba virus trong một mẫu đơn lẻ. Quy trình nêu dưới đây có thể phân tích mẫu thử cho một virus (nghĩa là: HAV, norovirus nhóm gen I hoặc norovirus nhóm gen II) và bao gồm một bộ đầy đủ các kiểm soát khuyến cáo. Phòng thử nghiệm cần thử nhiều hơn một virus đích để điều chỉnh chương trình phản ứng cho các phép thử bổ sung. Sơ đồ bố trí điển hình được nêu trong Phụ lục I. Các phương pháp thích hợp khác có thể dùng để kiểm soát sự ức chế RT-PCR được chứng minh là cho hiệu quả tương đương với việc sử dụng EC ARN.}

_{8.4.2.1. Phân tích virus đích}

_{Chuẩn bị các dung dịch pha loãng 10}^-1_{của mỗi ARN mẫu trong nước (5.2.1).}

_{Chuẩn bị các dung dịch pha loãng 10}^-1_{, 10}^-2_{, 10}^-3_{và 10}^-4_{của vật liệu kiểm soát dsADN đích (5.3.8) trong nước (5.2.1).}

_{Đối với mỗi mẫu chuẩn bị:}

_–_{hai giếng của một đĩa quang với (5 ± 0,1) µl ARN mẫu không pha loãng;}

_–_{hai giếng với (5 ± 0,1) µl ARN mẫu ở độ pha loãng 10}^-1_;

_–_{một giếng với (5 ± 0,1) µl ARN mẫu không pha loãng và (1 ± 0,05) µl EC ARN không pha loãng (5.3.9);}

_–_{một giếng với (5 ± 0,1) µl ARN mẫu ở độ pha loãng 10}^-1_{và (1 ± 0,05) µl EC ARN không pha loãng. Đối với kiểm soát EC ARN chuẩn bị:}

_–_{một giếng với (5 ± 0,1) µl nước (5.2.1) và (1 ± 0,05) µl EC ARN không pha loãng. Đối với đường chuẩn dsADN chuẩn bị:}

_–_{hai giếng với (5 ± 0,1) µl dsADN không pha loãng;}

_–_{hai giếng với (5 ± 0,1) µl dsADN ở độ pha loãng 10}^-1_;

_–_{hai giếng với (5 ± 0,1) µl dsADN ở độ pha loãng 10}^-2_;

_–_{hai giếng với (5 ± 0,1) µl dsADN ở độ pha loãng 10}^-3_;

_–_{hai giếng với (5 ± 0,1) µl dsADN ở độ pha loãng 10}^-4_.

_{Đối với các kiểm soát âm tính chuẩn bị:}

_–_{một giếng với (5 ± 0,1) µl nước (5.2.1);}

_–_{một giếng với (5 ± 0,1) µl ARN kiểm soát tách chiết âm tính hoặc ARN kiểm soát quá trình âm tính;}

_{Cho (20 ± 0,5) µl hỗn hợp mastermix real-time RT-PCR liên quan (5.3.7) vào mỗi giếng (hỗn hợp mastermix cũng có thể được cho vào các giếng liên quan trước khi cho vật liệu khuôn mẫu vào).}

_{8.4.2.2. Phân tích virus kiểm soát quá trình}

_{Nếu cần, rã đông một phần lượng vật liệu virus kiểm soát quá trình (8.2.1) đã pha loãng (ở độ pha loãng 10}^-1_{) đối với mẻ mẫu thử.}

_{Gia nhiệt ở (95 ± 2) °C trong (5,0 ± 0,5) min sử dụng buồng gia nhiệt hoặc thiết bị tương đương để giải phóng ARN.}

_{Làm lạnh nhanh các ống, ly tâm ở ≥ 3 000 x}_g_{trong 1 min, sau đó chuyển phần nổi phía trên (“ARN virus kiểm soát quá trình”) vào ống mới.}

_{Chuẩn bị các dung dịch pha loãng 10}^-1_{, 10}^-2_{, 10}^-3_{ARN virus kiểm soát quá trình trong nước (5.2.1) đối với từng mẻ vật liệu virus kiểm soát quá trình.}

_{Đối với mỗi mẫu chuẩn bị:}

_–_{một giếng với (5 ± 0,1) µl ARN mẫu không pha loãng;}

_–_{một giếng với (5 ± 0,1) µl ARN mẫu ở độ pha loãng 10}^-1_;

_{Đối với đường chuẩn ARN virus kiểm soát quá trình chuẩn bị:}

_–_{một giếng với (5 ± 0,1) µl ARN virus kiểm soát quá trình không pha loãng;}

_–_{một giếng với (5 ± 0,1) µl ARN virus kiểm soát quá trình ở độ pha loãng 10}^-1_;

_–_{một giếng với (5 ± 0,1) µl ARN virus kiểm soát quá trình ở độ pha loãng 10}^-2_;

_–_{một giếng với (5 ± 0,1) µl ARN virus kiểm soát quá trình ở độ pha loãng 10}^-3_;

_{Đối với các quá trình kiểm soát âm tính chuẩn bị:}

_–_{một giếng với (5 ± 0,1) µl nước (5.2.1);}

_–_{một giếng với (5 ± 0,1) µl ARN virus kiểm soát tách chiết âm tính hoặc ARN virus kiểm soát quá trình âm tính.}

_{Cho (20 ± 0,5) µl hỗn hợp mastermix real-time RT-PCR virus kiểm soát quá trình (5.3.7) vào mỗi giếng (hỗn hợp mastermix cũng có thể được cho vào các giếng liên quan trước khi cho vật liệu mẫu vào).}

_{8.4.2.3. Khuếch đại}

_{Đưa đĩa vào chu trình phản ứng bao gồm giai đoạn đầu để phiên mã ngược và ở ít nhất 45 chu kỳ PCR sử dụng máy real-time PCR (6.27). Khoảng thời gian và nhiệt độ của từng giai đoạn (phiên mã ngược, bất hoạt RT, biến tính, bắt cặp, kéo dài) phụ thuộc vào thuốc thử được sử dụng; chúng phải dựa trên các khuyến cáo của nhà sản xuất nhưng có thể được tối ưu hóa tiếp.}

_{Đối với các máy real-time PCR thì người sử dụng có thể cài đặt điểm thu dữ liệu huỳnh quang, điểm này phải cố định ở điểm cuối của giai đoạn kéo dài.}

_{Xem Phụ lục B nêu chi tiết về phương pháp khuếch đại.}

_{8.4.2.4. Phân tích dữ liệu huỳnh quang}

_{Các yêu cầu tối thiểu đối với phép phân tích dữ liệu khuếch đại được quy định trong ISO 22174. Sử dụng phương pháp khuyến cáo của nhà sản xuất máy real-time PCR phân tích đồ thị khuếch đại. Các ngưỡng phải được cài đặt sao cho chạy qua diện tích đồ thị khuếch đại (quan sát đồ thị logarit) là song song (pha chỉ số).}

_{Tất cả các điểm khuếch đại phải được kiểm tra để nhận biết các kết quả dương tính giả (phản ứng với giá trị}_C_q_{không liên quan đến độ khuếch đại tăng theo số mũ) gây ra do tín hiệu nền cao hoặc không đều. Điều này sẽ được ghi lại và các kết quả của bất kỳ phản ứng nào bị ảnh hưởng tương tự được coi là âm tính. Ngoài ra, tất cả các điểm huỳnh quang dương tính đúng phải được kiểm tra để đảm bảo rằng giá trị}_C_q_{tạo ra bởi phần mềm phân tích tương ứng (và không bị vênh do tín hiệu nền cao hoặc không đều). Khi các giá trị}_C_q_{bị vênh, thì ghi lại các giá trị}_C_q_{đã hiệu chính phù hợp với giá trị tạo ra bởi phần mềm. Giá trị}_C_q_{đã hiệu chính được sử dụng cho phép tính hiệu quả.}

_{9. Diễn giải kết quả}

_{9.1. Yêu cầu chung}

_{Mỗi kiểm soát (dsADN, EC ARN, ARN virus kiểm soát quá trình) có một giá trị dự kiến hoặc một dải giá trị dự kiến. Nếu các kết quả quan sát được của mọi phép kiểm soát khác với kết quả dự kiến thì có thể cần thử nghiệm lại mẫu.}

_{Các kiểm soát âm tính [nước (5.2.1), tách chiết âm tính hoặc kiểm soát quá trình] phải luôn luôn âm; nếu xuất hiện các kết quả dương trong các kiểm soát này thì bất kỳ mẫu cho các kết quả dương phải được thử nghiệm lại.}

_{9.2. Dựng đường chuẩn ARN virus kiểm soát quá trình}

_{Kiểm tra các giá trị}_C_q_{của dãy đường chuẩn pha loãng (ARN virus kiểm soát quá trình, dsADN đích) về mọi điểm nằm xa đường thẳng đi qua nhiều điểm nhất. Các giá trị}_C_q_{này sẽ không được đưa vào để tính đường chuẩn.}

_{Sử dụng các giá trị}_C_q_{còn lại của mỗi dãy pha loãng để dựng đường chuẩn. Bao gồm tối thiểu ba độ pha loãng (ARN virus kiểm soát quá trình) hoặc bốn độ pha loãng (dsADN). Đường chuẩn có giá trị r}²_{< 0,98, trong đó}_r_{là hệ số tương quan Pearson, không được dùng để tính toán.}

_{9.3. Tính hiệu quả khuếch đại}

_{Trong tiêu chuẩn này, hiệu quả khuếch đại chỉ được dùng làm thông số đảm bảo chất lượng và không được dùng để điều chỉnh kết quả thử.}

_{Sử dụng giá trị}_C_q_{của giếng ARN + EC ARN mẫu không pha loãng để đánh giá hiệu quả khuếch đại bằng cách tham khảo giá trị}_C_q_{của giếng nước + EC ARN và độ dốc của đường chuẩn dsADN.}

_{Nếu hiệu quả khuếch đại > 25 % thì các kết quả đối với ARN không pha loãng được dùng cho mẫu đó.}

_{Nếu hiệu quả khuếch đại < 25 % thì lặp lại phép tính với giếng ARN + EC ARN mẫu ở độ pha loãng 10}^-1_.

_{Nếu hiệu quả khuếch đại sử dụng mẫu ARN ở độ pha loãng 10}^-1_{> 25 % thì các kết quả đối với mẫu ARN ở độ pha loãng 10-1 phải được dùng cho mẫu đó. Nếu hiệu quả khuếch đại cho cả mẫu ARN không pha loãng và mẫu ARN ở độ pha loãng 10}^-1_{< 25 % thì các kết quả không có giá trị và mẫu phải được thử nghiệm lại.}

_{CHÚ THÍCH 1: Mẫu cho cùng giá trị}_C_q_{như mẫu EC ARN không pha loãng có hiệu quả khuếch đại là 100 %. Đối với đường chuẩn dsADN có độ dốc lý tưởng –3,32, nếu giá trị}_C_q_{của giếng ARN + EC ARN mẫu < 2,00 lớn hơn giá trị}_C_q_{của giếng nước + EC ARN thì hiệu quả khuếch đại > 25 % và do đó có thể chấp nhận được. Nếu giá trị}_C_q_{của giếng ARN + EC ARN mẫu > 2,00 lớn hơn giá trị}_C_q_{của giếng nước + EC ARN thì hiệu quả khuếch đại < 25 % và do đó không chấp nhận được.}

_{CHÚ THÍCH 2: Mẫu cho hiệu quả khuếch đại không chấp nhận được nhưng có thể cho kết quả đánh giá dương tính theo cách khác, nếu có thể, được báo cáo là dương như mô tả trong Điều 10.}

_{CHÚ THÍCH 3: Nếu sử dụng phương pháp thay thế để xác định hiệu quả khuếch đại thì cần điều chỉnh quy trình này để đưa ra cùng mức chính xác.}

_{9.4. Tính hiệu quả chiết}

_{Trong tiêu chuẩn này, hiệu quả chiết chỉ được dùng làm thông số đánh giá chất lượng và không được dùng để điều chỉnh kết quả.}

_{Sử dụng giá trị}_C_q_{cho phép phân tích virus kiểm soát quá trình từ giếng mẫu thử ARN (không pha loãng hoặc độ pha loãng 10}^-1_{) tùy thuộc vào các kết quả của hiệu quả khuếch đại (9.3) để đánh giá độ thu hồi của virus kiểm soát quá trình bằng cách tham khảo đường chuẩn ARN của virus kiểm soát quá trình (nếu sử dụng các kết quả của mẫu ARN độ pha loãng 10}^-1_{thì nhân với 10 để hiệu chính hệ số pha loãng).}

_{Đối với các mẫu BMS, tính hiệu quả chiết bằng cách chia độ thu hồi cho 0,5 và nhân với tổng thể tích dịch mẫu đồng nhất đo được.}

_{Đối với các nền mẫu khác, hiệu quả chiết bằng độ thu hồi của virus kiểm soát quá trình.}

_{Khi hiệu quả chiết < 1 % thì các kết quả mẫu không có giá trị và mẫu cần được thử nghiệm lại.}

_{CHÚ THÍCH 1 Mẫu tạo ra cùng giá trị}_C_q_{với ARN virus kiểm soát quá trình không pha loãng có độ thu hồi virus kiểm soát quá trình (bằng hiệu quả chiết trong các nền mẫu khác với BMS) là 100 %. Đối với đường chuẩn ARN virus kiểm soát quá trình có độ dốc lý tưởng – 3,32, nếu giá trị Cq của giếng ARN mẫu không pha loãng < 6,64 lớn hơn giá trị}_C_q_{ARN virus kiểm soát quá trình không pha loãng thì độ thu hồi virus kiểm soát quá trình của mẫu đó > 1 % và do đó có thể chấp nhận được.}

_{CHÚ THÍCH 2: Mẫu cho hiệu quả chiết không thể chấp nhận được nhưng có thể cho kết quả đánh giá dương tính theo cách khác, nếu có, được báo cáo là dương như mô tả trong Điều 10.}

_{9.5. Định lượng mẫu}

_{Đối với mỗi virus đích, lấy các giá trị Cq chỉ của các giếng ARN mẫu (không pha loãng hoặc đã pha loãng 10}^-1_{tùy thuộc vào kết quả của hiệu quả khuếch đại; 9.3) và dùng các giá trị này để tính nồng độ virus đích (tính bằng số bản sao gen virus có thể phát hiện được trong microlit ARN) cho mỗi độ lặp lại bằng cách tham khảo đường chuẩn dsADN. Các lần lặp lại âm tính được coi là định lượng bằng không. Đối với từng mẫu, tính giá trị nồng độ trung bình của hai lần lặp lại.}

_{Nhân giá trị này với 100 (ARN không pha loãng) hoặc 1 000 (ARN ở độ pha loãng 10}^-1_{) để tính lượng virus đích trong 100 µl ARN và trong 500 µl virus chiết được (toàn bộ mẫu dùng cho nền mẫu không phải BMS).}

_{Đối với các mẫu BMS, tính lượng virus có thể phát hiện được trong toàn bộ mẫu bằng cách chia giá trị trên cho 0,5 và nhân với tổng thể tích dịch mẫu đồng nhất.}

_{Để thu được lượng virus đích ước tính, tính bằng số bản sao hệ gen virus có thể phát hiện được trong một mililit, trong một gam hoặc trong một centimet vuông thì chia số bản sao hệ gen trong toàn bộ mẫu cho thể tích ban đầu (nước uống đóng chai), khối lượng (BMS, quả mềm, rau salat) hoặc diện tích (bề mặt cứng) của mẫu.}

_{9.6. Giới hạn phát hiện lý thuyết}

_{Giới hạn phát hiện lý thuyết (tLOD) là mức mà các thành phần có lượng virus đích nhỏ nhất có thể phát hiện được theo lý thuyết. Điều này tương ứng với một bản sao hệ gen trên một thể tích ARN được thử nghiệm trong phép phân tích virus đích, nhưng thay đổi theo nền mẫu thử và lượng vật liệu khởi động.}

_{Đối với mỗi mẫu bề mặt cứng, quả mềm, rau salat hoặc nước đóng chai thì lượng virus đích tối thiểu trong toàn mẫu có thể phát hiện được theo lý thuyết là 10 (các kết quả sử dụng ARN mẫu không pha loãng) hoặc 100 bản sao hệ gen (ARN độ pha loãng 10}^-1_).

_{Đối với các mẫu BMS, lượng virus đích tối thiểu có thể phát hiện được theo lý thuyết thu được bằng cách chia giá trị trên cho 0,5 và nhân theo tổng thể tích dịch mẫu đồng nhất.}

_{Để thu được tLOD của mỗi mẫu tính bằng số bản sao hệ gen virus có thể phát hiện được trên mililit, trên gam hoặc trên centimet vuông thì chia số lượng bản sao hệ gen virus có thể phát hiện trong toàn bộ mẫu cho thể tích ban đầu (nước đóng chai), khối lượng (BMS, quả mềm, rau salat) hoặc diện tích (bề mặt cứng) của mẫu.}

_{10. Biểu thị kết quả}

_{Các kết quả dương đối với mỗi virus đích được biểu thị là “x số bản sao hệ gen virus có thể phát hiện được trong một mililit”, “x số bản sao hệ gen virus có thể phát hiện được trong một gam” hoặc “x số bản sao hệ gen virus có thể phát hiện được trong một centimet vuông” trong đó x là số lượng tính được đối với mẫu đó, với điều kiện là mức này cao hơn mức giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp.}

_{Nếu phát hiện được ARN đích ở mức < LOQ thì các kết quả được biểu thị là “hệ gen virus phát hiện được ở mức thấp hơn mức định lượng” như sau (“y số bản sao hệ gen virus có thể phát hiện được trong một mililit”, “y số bản sao hệ gen virus có thể phát hiện được trong một gam” hoặc “y số bản sao hệ gen virus có thể phát hiện được trong một centimet vuông”)”, trong đó y là LOQ của phương pháp.}

_{Nếu không phát hiện được virus đích thì kết quả được biểu thị là “không phát hiện” như sau (“< z số bản sao hệ gen virus có thể phát hiện được trong một mililit”, “< z số bản sao hệ gen virus có thể phát hiện được trong một gam” hoặc “< z số bản sao hệ gen virus có thể phát hiện được trong một centimet vuông”), trong đó z là giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD).}

_{Nếu không thu được kết quả có giá trị, thì các kết quả thường được biểu thị là “không có kết quả”. Tuy nhiên, nếu thu được kết quả dương có giá trị khác từ mẫu cho thấy hiệu quả khuếch đại hoặc hiệu quả chiết không chấp nhận được thì kết quả có thể được biểu thị như trên. Các chi tiết phải được đưa vào báo cáo thử nghiệm.}

_{Nếu sử dụng các kết quả từ mẫu ARN ở độ pha loãng 10}^-1_{, thì các giá trị LOD và LOQ phải được điều chỉnh tăng bằng cách nhân với 10.}

_{11. Báo cáo thử nghiệm}

_{Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:}

_{a) Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;}

_{b) Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;}

_{c) Phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;}

_{d) Mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là tuỳ chọn cùng với các tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;}

_{e) pLOD (3.17) và LOQ (3.18) của phương pháp (được điều chỉnh để tính khi sử dụng mẫu ARN ở độ pha loãng 10}^-1_{, nếu cần) và nền mẫu được thiết lập;}

_{f) tLOD (3.16) của mẫu;}

_{g) hiệu quả chiết mẫu (9.4);}

_{h) kết quả thử thu được, biểu thị theo Điều 10.}
_{PHỤ LỤC A}

_{(Quy định)}

_{SƠ ĐỒ QUY ĐỊNH}

_{PHỤ LỤC B}

_{(Tham khảo)}

_{HỖN HỢP MASTERMIX REAL-TIME RT-PCR VÀ THÔNG SỐ CHU TRÌNH}

_{Đối với thành phần hỗn hợp mastermix real-time RT-PCR một bước sử dụng hệ thống intrivitrogen ARN ultrasense}^TM^¹⁾_{qRT-PCR một bước, xem Bảng B.1 và các thông số chu trình, xem Bảng B.2.}

_{Bảng B.1 – Hỗn hợp mastermix}

_{Thuốc thử}	_{Nồng độ cuối} _{(trong 25 µl)}	_{Thể tích trên phản ứng} _(µl)
_{5 × hỗn hợp phản ứng Ultrasense}	_1×	_{5 ± 0,1}
_{Mồi FW}	_{0,5 pmol/µl}	_{Theo yêu cầu}
_{Mồi REV}	_{0,9 pmol/µl}	_{Theo yêu cầu}
_{Mẫu dò}	_{0,25 pmol/µl}	_{Theo yêu cầu}
_{Chất nhuộm màu chuẩn ROX (50 ×)}	_{Theo yêu cầu}^a	_{Theo yêu cầu}
_{Hỗn hợp enzym Ultrasense ARN}	_—	_{1,25 ± 0,05}
_{Nước (5.2.1)}	_—	_{Theo yêu cầu}
_{Tổng thể tích}	_—	_{20 ± 0,2}
^a_{Máy real-time PCR Biosystems Applied, ROX sử dụng ở nồng độ 1× ; đối với Stratagen MX3000, ROX có thể cũng được sử dụng ở nồng độ 0,1× hoặc bỏ qua hỗn hợp mastermix. Đối với máy khác, tham khảo hướng dẫn của nhà sản xuất.} _{Máy real-time PCR Biosystems Applied và Stratagen MX3000 là các sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng.}

_{Bảng B.2 – Thông số chu trình}

_{Mô tả các bước}		_{Nhiệt độ và thời gian}	_{Số chu trình}
_RT		_{55 °C trong 1 h}	₁
_{Gia nhiệt trước}		_{95 °C trong 5 min}	₁
_{Khuếch đại}	_{Biến tính}	_{95 °C trong 15 s}	₄₅
	_{Bắt cặp-kéo dài}	_{60 °C trong 1 min}
		_{65 °C trong 1 min}

_{PHỤ LỤC C}

_{(Tham khảo)}

_{MỒI REAL-TIME RT-PCR VÀ MẪU DÒ THỦY PHÂN ĐỂ PHÁT HIỆN HAV, NOROVIRUS GI, NOROVIRUS GII VÀ VIRUS MENGO (KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH)}

_{C.1 HAV}

_{HAV68 (FW)}

_{HAV240 (REV)}

_{HAV150 (-) (PROBE):}

_{TCA CCG CCG TTT GCC TAG}

_{GGA GAG CCC TGG AAG AAA G}

_{CCT GAA CCT GCA GGA ATT AA}

_{Tài liệu tham khảo [2]}

_{Tài liệu tham khảo [2]}

_{Tài liệu tham khảo [2]}

_{Mẫu dò được dán nhãn: tại đầu 5’ với 6-carboxyfluorescein (FAM); tại đầu 3’ với MGBNFQ (chất kết dính phụ/chất hấp thụ không huỳnh quang).}

_{Bộ mồi này khuếch đại sản phẩm có kích thước 173 bp tương ứng với 68-240 nucleotid của HAV phân lập HM174 43c (số đăng ký Ngân hàng Gen M59809).}

_{Dãy trình tự sử dụng tất cả trình tự có sẵn trong Ngân hàng gen của phép phân tích vùng đích chứng minh rằng cặp mồi và mẫu dò này đủ để định lượng tất cả các kiểu gen của HAV. Ngoài ra, phép phân tích phổ đột biến của một gen các chủng biến đổi cho thấy vùng này không dễ thay đổi và phép phân tích này sẽ ổn định lâu dài. Tính đặc hiệu của các mồi đã được kiểm chứng bằng 10 piconavirus khác nhau: poliovirus (chủng vacin huyết thanh typ 1); enterovirus B ở người (echovirus typ1); enterovirus B ở người (echovirus typ 11); enterovirus B ở người (echovirus typ 30); enterovirus B ở người (Coxsackie virus-B5); enterovirus C ở người (Coxsackie virus-A24); enterovirus D ở người (eterovirus 70); enterovirus ở bò; teschovirus ở lợn (enterovirus typ 1 ở bò) và virus encephalomyocarditis. Virus enteric khác cũng được sử dụng như: virus hespatitis E, rotavirus người và bò (nhóm A), norovirus, mamastrovirus (astrovirus typ 1 ở người) và adenovirus F ở người (enteric adenovirus typ 40). Không có phép thử virus nào cho kết quả dương cũng như ở nồng độ cao (10}⁶_{đến 10}⁸_{TCID50/ml hoặc cặn huyền phù không pha loãng 0,1 g/ml) hoặc nồng độ thấp (10}⁴_{TCID50/ml hoặc cặn huyền phù 0,1 g/ml của dịch pha loãng ở độ pha loãng 10-1). LOD của phép phân tích là 10 phân tử ssARN, 1 phân tử ARN và 0,05 virus lây nhiễm trên phản ứng (Tài liệu tham khảo [2]).}

_{C.2. Norovirus GI}

_{QNIF4 (FW)}

_{NV1LCR (REV)}

_{NVGG1p (PROBE):}

_{CGC TGG ATG CGN TTC CAT}

_{CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC}

_{TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT}

_{Tài liệu tham khảo [3]}

_{Tài liệu tham khảo [4]}

_{Tài liệu tham khảo [4]}

_{Mẫu dò được dán nhãn: tại đầu 5’ với 6-carboxyfluorescein (FAM); tại đầu 3’ với 6-carboxytetrametylrhodamin (TAMRA).}

_{Bộ mồi này khuếch đại sản phẩm có kích thước 86 bp tương ứng với 5291-5376 nucleotid của Norwalk virus (số đăng ký Ngân hàng Gen M87661).}

_{C.3. Norovirus GII}

_{QNIF2 (FW)}

_{COG2R (REV)}

_{QNIFs (PROBE):}

_{ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA}

_{TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA}

_{AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG}

_{Tài liệu tham khảo [5]}

_{Tài liệu tham khảo [6]}

_{Tài liệu tham khảo [5]}

_{Mẫu dò được dán nhãn: tại đầu 5’ với 6-carboxyfluorescein (FAM); tại đầu 3’ với 6-carboxytetrametylrhodamin (TAMRA).}

_{Bộ mồi này khuếch đại sản phẩm kích thước 89 bp tương ứng với 5012-5100 nucleotid của Lordsdale virus (số đăng ký Ngân hàng Gen X86557).}

_{Diện tích được chọn để phát hiện norovirus là vùng bảo tồn tốt tại đầu 5’ của ORF2 (Tài liệu tham khảo [6]). Các dãy trình tự sử dụng tất cả các trình tự có sẵn trong Ngân hàng gen của phép phân tích vùng đích chứng minh rằng bộ mồi và mẫu dò này đủ để định lượng tất cả Nov GI và Nov GII tương ứng. Ngoài ra, sử dụng 18 chủng NoV chuẩn: GI.1 (Norwalk virus); GI.2 (Whiterose); GI.3 (Southampton); GI.4 (Malta); GI.5 (Musgrove); GI.6 (Mikkeli); GI.7 (Winchester); GI.10 (Boxer), GII.1 (Hawaii); GII.2 (Melksham); GII.3 (Toronto); GII.4 (Grismby); GII.6 (Seacroft); GII.7 (Leeds); GII.10 (Erfurt); biến thể GIIb; biến thể GIIc và GIV (Alphatron) để kiểm chứng hiệu quả và độ nhạy của mồi và mẫu dò.}

_{Tính đặc hiệu của mồi đã được kiểm chứng bằng sáu virus enteric ở người khác nhau: poliovirus (chủng vacxin huyết thanh typ 1); virus hepatitis A; virus hepatitis E ; virus aichi ; astrovirus và rotavirus. Tính đặc hiệu cũng đã được thử nghiệm trên bảy loại vi khuẩn có thể phát hiện được trong BMS: Escherichia coli; Shewenella putrefaciens, Chromobacterium violaceum, Aeromonas sobria, Vibrio alginolyticus, Vibrio paraheamolyticus và Vibrio cholerea). Không có phép thử virus hoặc vi khuẩn nào cho kết quả dương. LOD của phép phân tích là 1 đến 10 phân tử ARN virus (phụ thuộc vào chủng NoV) (Tài liệu tham khảo [5], [7]).}

_{C.4. Virus mengo}

_{Mengo 110 (FW):}

_{Mengo 209 (REV)}

_{Mengo 147 (PROBE):}

_{GCG GGT CCT GCC GAA AGT}

_{GAA GTA ACA TAT AGA CAG ACG CAC AC}

_{ATC ACA TTA CTG GCC GAA CG}

_{Tài liệu tham khảo [8]}

_{Tài liệu tham khảo [8]}

_{Tài liệu tham khảo [8]}

_{Mẫu dò được dán nhãn: tại đầu 5’ với 6-carboxyfluorescein (FAM); tại đầu 3’ với MGBNFQ (chất kết dính phụ/chất hấp thụ không huỳnh quang).}

_{Bộ mồi này khuếch đại sản phẩm có kích thước 100 bp tương ứng với 110-209 nucleotid của chủng virus mengo tái tổ hợp MC0 được dùng trong tiêu chuẩn này. Chủng này tương ứng với 110-270 nicleotid của virus mengo không tái tổ hợp phân lập M (số đăng ký Ngân hàng Gen L22089).}

_{Lựa chọn vùng đích để định lượng virus mengo càng giống với HAV càng tốt về cấu trúc, chiều dài và thành phần cơ bản (Tài liệu tham khảo [2]). Các trình tự mồi này không giống bất kỳ trình tự nào khác có sẵn trong Ngân hàng Gen.}
_{PHỤ LỤC D}

_{(Tham khảo)}

_{SỰ PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VIRUS MENGO MC}₀_{ĐƯỢC DÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH}

_{D.1. Yêu cầu chung}

_{Virus mengo là một virus murine của họ}_{Picoranviridae.}_{Chủng virus mengo MC}₀_(ATCC^®_VR-1597^TM₎^²⁾_{là một virus tái tổ hợp không có ống poly(C) khi so sánh với virus mengo tự nhiên, có đặc tính phát triển giống với virus tự nhiên nhưng có kiểu hình của vi khuẩn không độc (Tài liệu tham khảo [9]). Chủng này được sử dụng làm virus kiểm soát quá trình trong phương pháp phát hiện HAV và norovirus (Tài liệu tham khảo [2] [7]) và đã được sử dụng làm virus kiểm soát quá trình.}

_{Chủng virus mengo MC}₀_{là sinh vật biến đổi gien (GMO); cho phép các phòng thử nghiệm sử dụng GMO hoặc sử dụng virus kiểm soát quá trình khác đang được sử dụng.}

_{D.2. Thuốc thử và thiết bị, dụng cụ}

_D.2.1._{Môi trường nuôi cấy tế bào khuyến cáo đối với tế bào HeLa là môi trường thiết yếu tối thiểu của Eagle có 2 mmol/l L-glutamin và BSS của Earle, chỉnh đến 1,5 g/l natri hydrocarbonat, 0,1 mmol/l axit amin không thiết yếu, 1,0 mmol/l natri pyruvat, dung dịch 1× streptomycin/penicillin, 100 ml/l (phát triển) hoặc 20 ml/l (duy trì) huyết thanh phôi thai bò.}

_D.2.2._{Để chuẩn bị nuôi cấy tế bào và phát triển virus, cần có các thiết bị nuôi cấy tế bào cần có: máy ủ có mức CO2 có thể kiểm soát được và vật liệu nuôi cấy tế bào (bình .v.v.).}

_{D.3. Cách tiến hành}

_{Virus mengo sẽ phát triển trong môi trường (50 ± 10) ml/l CO}₂_{(bình mở) hoặc môi trường không kiểm soát (bình đóng) trên 80 % đến 90 % lớp đơn suy biến của tế bào HeLa (ATCC}^®_CCL-2^TM₎²⁾_{cho đến khi đạt được hiệu ứng tế bào ít nhất là 75 %.}

_{Đưa bình nuôi cấy tế bào vào một chu trình rã đông, sau đó ly tâm lượng chứa trong bình ở 3 000 x}_g_{trong (10 ± 1) min.}

_{Giữ lại phần nổi phía trên (nuôi cấy tế bào) để chuẩn bị vật liệu của virus kiểm soát quá trình (5.3.6).}
_{PHỤ LỤC E}

_{(Tham khảo)}

_{TÁCH CHIẾT ARN SỬ DỤNG HỆ THỐNG BIOMERIEUX NUCLISENS}^®^³⁾

_{E.1. Thuốc thử}

_{E.1.1. Dung dịch đệm lysin BioMerieux Nuclisens}^®_.

_{E.1.2. Thuốc thử chiết từ tính BioMerieux Nuclisens}^®_{(gồm dung dịch silica từ tính, dung dịch đệm rửa 1, 2, 3 và dung dịch đệm rửa giải).}

_{E.2. Thiết bị, dụng cụ}

_{E.2.1. Thiết bị miniMAG}_hoặc_{easyMAG BioMerieux Nuclisens}^®_.

_{E.2.2. Giá từ tính BioMerieux Nuclisens}^®_.

_{E.2.3. Máy ủ lắc nhiệt}_{hoặc thiết bị tương đương để lắc ống 1,5 ml ở (60 ± 2) °C và lắc khoảng 1 400 dao động/min.}

_{E.2.4. Ống có nắp vặn}_{, dung tích 1,5 ml, thích hợp để sử dụng với thiết bị NucliSens}^®_.

_{E.3. Cách tiến hành}

_{Cho (2 ± 0,1) ml dung dịch đệm phân giải NucliSens}^®_{vào ống. Thêm (500 ± 10) µl mẫu (BMS) hoặc toàn bộ mẫu (các nền mẫu khác) và trộn bằng cách lắc nhẹ.}

_{Ủ trong (10 ± 1) min ở nhiệt độ phòng.}

_{Thêm (50 ± 2) µl dung dịch silica từ tính đã trộn kỹ vào ống và trộn bằng cách lắc nhẹ.}

_{Ủ trong (10 ± 1) min ở nhiệt độ phòng.}

_{Ly tâm (120 ± 10) s ở 1 500 x}_g_{sau đó loại bỏ cẩn thận lớp huyền phù phía trên bằng cách, ví dụ: bằng cách hút.}

_{Thêm (400 ± 10) µl dung dịch đệm rửa 1 và hòa lại các hạt nhỏ bằng cách nhỏ giọt hoặc lắc.}

_{Chuyển dung dịch huyền phù vào ống có nắp vặn 1,5 ml. Rửa trong (30 ± 2) s, sử dụng hệ thống chiết miniMAG hoặc easyMAG có các bước rửa tự động. Sau khi rửa, để silica lắng xuống sử dụng khối từ của hệ thống chiết miniMAG hoặc easyMAG. Lấy phần nổi phía trên ra, ví dụ: bằng cách hút.}

_{Tách ống khỏi khối từ, sau đó thêm (400 ± 10) µl dung dịch đệm rửa 1. Hòa lại các hạt nhỏ, rửa trong (30 ± 2) s, để silica lắng xuống, sử dụng khối từ, sau đó loại bỏ phần nổi phía trên.}

_{Tách ống khỏi khối từ, sau đó thêm (500 ± 10) µl dung dịch đệm rửa 2. Hòa lại các hạt nhỏ, rửa trong (30 ± 2) s, để silica lắng xuống, sử dụng khối từ, sau đó loại bỏ phần nổi phía trên. Tiến hành lặp lại.}

_{Tách ống khỏi khối từ, sau đó thêm (500 ± 10) µl dung dịch đệm rửa 3 (mẫu phải không được để trong dung dịch đệm rửa 3 nhiều hơn số lần cần thiết). Rửa trong (15 ± 1) s, để silica lắng xuống, sử dụng khối từ, sau đó loại bỏ phần nổi phía trên.}

_{Thêm (100 ± 2) µl dung dịch đệm rửa giải. Đậy nắp ống và chuyển vào máy ủ lắc nhiệt hoặc thiết bị tương đương và ủ trong (5,0 ± 0,5) min ở (60 ± 1) °C và lắc khoảng 1 400 dao động/min.}

_{Đặt ống vào giá từ tính và để silica lắng xuống, sau đó chuyển chất rửa giải vào ống sạch.}
_{PHỤ LỤC F}

_{(Quy định)}

_{THÀNH PHẦN VÀ CÁCH CHUẨN BỊ THUỐC THỬ VÀ DUNG DỊCH ĐỆM}

_{F.1. Dung dịch 5 × PEG/NaCl (PEG 8 000 nồng độ 500 g/l, NaCl 1,5 nồng độ mol/l)}

_{F.1.1 .Thành phần}

_{Polyetylen (PEG) 8 000}	_{(500 ± 2) g}
_NaCl	_{(87 ± 1) g}
_{Nước (5.2.1)}	_{theo yêu cầu}

_{Каталог: data -> 2017
2017 -> Tcvn 6147-3: 2003 iso 2507-3: 1995
2017 -> Các Cục Hải quan tỉnh, thành phố
2017 -> TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 10256: 2013 iso 690: 2010
2017 -> Căn cứ Nghị định số 15/2017/NĐ-cp ngày 17/02/2017 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
2017 -> TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 8400-3: 2010
2017 -> TIÊu chuẩn nhà NƯỚc tcvn 3133 – 79
2017 -> Căn cứ Luật Tổ chức chính quyền địa phương ngày 19 tháng 6 năm 2015
2017 -> Căn cứ Nghị định số 15/2017/NĐ-cp ngày 17 tháng 02 năm 2017 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
2017 -> Btvqh10 ngày 25 tháng 5 năm 2002 của Ủy ban Thường vụ Quốc hội về tự vệ trong nhập khẩu hàng hóa nước ngoài vào Việt Nam

tải về 0.5 Mb.
Chia sẻ với bạn bè của bạn:}

1 2 3