BẢNG TRA DÙNG CHO LOẠT 5 ỐNG NGHIỆM Ở 3 NỒNG ĐỘ PHA LOÃNG LIÊN TIẾP

- Đặc điểm quan trọng nhất của S.aureus được các nhà khoa học sử dụng để phân biệt với các Staphylococci khác là khả năng sinh tổng hợp coagulase va khả năng sử dụng Mannitol.

- Một số chủng thuộc loài S.aureus có khả năng sinh tổng hợp độc tố ruột enterotoxin khi chúng nhiễm vào thực phẩm. Tuy nhiên số lượng tế bào vi khuẩn phải đủ lớn (không thấp hơn 10⁶ CFU/g) thì mới đủ sinh ra một lượng toxin gây ngộ độc cho người sử dụng. Do đó việc định lượng S.aureus trong thực phẩm là rất cần thiết để dự đoán khả năng gây ngộ độc của sản phẩm và đánh giá tổng quát mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm.


Quy trình định lượng S.aureus trong thực phẩm.







Kiểm tra


Khả năng lên men glucose và mannitol

Tính mẫn cảm với lysostaphin

Khả năng sinh tổng hợp thermonucleasse




Kiểm tra

2.2. Phương pháp hiện đại:

2.2.1. Phương pháp ELISA (enzyme – linked immunosorbent assay):

 Phương pháp Elisa: (Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay ) là 1 kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể (KT) hay kháng nguyên (KN) trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay, Elisa được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp đặc biệt là trong kiểm tra an toàn trong các sản phẩm sinh học.

 Có 2 loại phương pháp Elisa:

+ Phương pháp Elisa trực tiếp (direct Elisa): dùng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm.

+ Phương pháp Elisa gián tiếp (indirect Elisa): dùng dể phát hiện kháng thể chuyên biệt trong huyết thanh.
 Ưu điểm: Phương pháp này được sử dung cho các loại kháng nguyên với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể phát hiện được phức hợp nhỏ KN-KT, cho phép phát hiện sớm tác nhân gây bệnh ở giai đoạn sớm khi mầm bệnh mới xâm nhiễm.

+ Nhanh, thao tác đơn giản.

+ Ít tốn sinh phẩm, hóa chất, số lượng mẫu lớn, rất thích hợp với việc phân tích đối với nguyên liệu thô.

 Nhược điểm: Độ chính xác không cao.

 Nguỵên tắc kỹ thuật Elisa:

Sử dụng KT đơn dòng (Mabs) phủ bề mặt những đĩa giếng và sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng các kháng thể thứ cấp như: horeseradich perosidase hay alkaline phosphatase). Nếu có sự hiện diện của KN trong mẫu, KN sẽ tạo phức hợp với KT cố định trên giếng và KT tự do có gắn enzyme tạo thành một phức hợp kép (sandwich). Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thuỷ phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng.

Khi bổ sung các cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thuỷ phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi sự đổi màu có thể phát hiện sự hiện diện của KN. Cần tăng sinh chọn lọc trước khi thực hiện phản ứng. Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 10⁶CFU/ml.

2.2.1.1. Qui trình ELISA trực tiếp dùng để xác định Staphylococcus Aureus:

Phương pháp trực tiếp Elisa đã được chứng minh là rất phổ biến để chuẩn đoán các bệnh truyền nhiễm nhất như: ở người viêm gan siêu vi, HIV … và ở động vật như: viêm vú, nhiễm khuẩn xuất huyết…(Nickerson và các cộng sự, 1989. Rehmant et al, 2002).

 Vật liệu và phương pháp:

+ Chuẩn bị các KN: S. aureus được nuôi cấy trên môi trường Staph.110 ủ ở 37⁰C trong 24h. Thu chủng vi khuẩn với nước muối đệm phosphate (pH 6.8) có chứa formalin 0.3% và đun nóng ở 100⁰C trong 1h (Heddleston et al, 1972; Zia và cộng sự, 2000).

+ Sản xuất KT: ba con thỏ được tiêm dịch huyền phù nói trên ở dưới da với lượng 0.5;1;1.5 và 2ml khoảng 4 ngày. Sau 7 ngày tiếp tục tiêm 1ml S.aureus được nuôi cấy trong môi trường canh thịt vào thỏ. Sau đó 14 ngày tiêm môi trường giống như trên, thu nhận máu và huyết thanh khi giết thỏ (Relman và cộng sự, 2002).

+ Tinh chế và ước lượng Protein: KT thỏ được phân lập và tinh khiết một phần thông qua phương pháp kết tủa ammonium sulfate (Hudson và Hay, 1980) và hàm lượng protein đã được ước tinh bằng phương pháp Biuret sau khi tiêu bản theo đường chuẩn của huyết thanh bò albumin (Zia và cộng sự, 2001).

+ Sự tiếp hợp: Enzyme peroxidase từ đậu tương (10mg) đã được tiếp hợp với một phần KT tinh khiết của thỏ, sử dụng bước hai trong phương pháp glutaradehyde (Zia và cộng sự, 2000).

+ Lớp vỏ KT: 100µl KT thỏ (pha loãng 1/10 trong dung dịch đệm phủ) được đổ vào từng giếng, polystyrene, tấm microtitration gồm 96 giếng ủ ở 4⁰C trong 24h. Sau đó, tấm được rửa năm lần với đệm rửa. Các tấm được giữ cố định bởi 100µl PSB đổ vào từng giếng và ủ ở 37⁰C trong 24h. Sau khi ủ, tấm đã được rửa sạch bằng đệm rửa (Horadagoda et al, 1993).

+ Phân tích thống kê: các dữ liệu được phân tích qua Duncan’s Multiple Range (DMR) kiểm tra hoàn toàn theo thiết kế ngẫu nhiên (CRD) (Steel và Torrie,1984).

 Kết quả và thảo luận:

+ Các xét nghiệm huyết thanh khác nhau đã được sử dụng cho các KN phát hiện như là thử nghiệm nhanh chóng làm ngưng kết, thử nghiệm agar gel phát hiện, nhưng tốt nhất là phương pháp ELISA để phát hiện KN. Nề tảng của phương pháp ELISA là dựa trên sự thay đổi màu sắc, có lợi thế hơn các xét nghiệm khác như ngưng kết, huỳnh quang hoặc phóng xạ trong phản ứng KN-KT có thể được đo đều đặn khách quan trong sắc độ kế đơn giản. Ngoài ra, sử dụng các tấm microtitre ELISA cho phép một số lượng lớn phản ứng để được đọc trong thời gian ngắn (Dawkins et al,1990).

+ Có nhiều enzyme khác nhau được sử dụng trong phương pháp ELISA nhưng peroxidase được ưu tiên hơn những loại khác bởi sự tinh khiết, hoạt tính đặc hiệu, nhạy cảm của chất nền thăm dò, dễ tiếp hợp, tính hiệu quả khi tiếp hợp và sự ổn định về sự tiếp hợp (Kemeny và Challacombe, 1989). Peroxidase là một chất oxy hóa sinh học quan trọng và phổ biến trong các vật liệu từ thực vật. Trong thực vật thì nó có mặt trong cà chua (Zia et al,2001), cải ngựa, đậu tương (Ambreen et al, 2001), khoai tây, củ cải, cà rốt, lúa mì, lê, chuối (Reed và cộng sự, 1975).

+ Peroxidase được chiết xuất từ đậu tương do tính hoạt động cao và dễ dàng tìm, kiếm. Hoạt động của peroxidase thô đã được chứng tỏ 146.12U/ml. Đậu tương là một nguồn phong phú của peroxidase được báo cáo bởi Ambreen et al, 2000. Sau đó peroxidase một phần được tinh khiết bằng cách sử dụng phương pháp làm kết tủa ammonium sulfate. Kỹ thuật này sử dụng vì nó phổ biến nhất, sử dụng thuốc thử có muối trong các protein, độ hòa tan cao và độ phân giải ion cao (Voet et al, 1999). KT được sản xuất bằng cách tiêm các KN S. aureus vào thỏ và sử dụng phương pháp kết tủa ammonium (Hudson và Hay, 1980). Lượng protein đã được ước tính bằng cách sử dụng phương pháp biuret cũng như phương pháp U.V. và kết quả của hai phương pháp đã được ghi trong bảng .

+ Trong trường hợp mẫu B, pha loãng ở 1:100 OD từ 1,406-1,205 trong khi pha loãng ở 1:200 OD dao động từ 1,185-1,103. Trong 1:400 OD dao động từ 0,714-0,72. Trong 1:800 giá trị pha loãng được hấp thụ từ 0,99-0,93.

Mẫu C, tỷ lệ 1:100 OD pha loãng từ 1,74-1,61. Trong pha lõang 1:200 OD từ 1,36-1,23.

+ Trong 1:400 OD từ 1,21-1,40. Trong 1:800 giá trị pha loãng hấp thụ là 1,26-1,39.

Có một sự giảm đáng kể của mẫu về giá trị OD ở độ pha loãng 1:100 so với dung dịch pha loãng 1:200, 1:400 và 1:800 là pha loãng 1:100 cho kết quả tốt nhất.

+ Kết luận và kiến nghị: 1:100 là tôt nhất cho ELISA trực tiếp chống lại S.aureus. Kết luận tương tự đã được rút ra khi thống kê phân tích thông qua thử nghiệm DRM theo thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên.

+ Mẫu: Trong nghiên cứu này, 50 mẫu kem và 50 mẫu pho mát trắng ( mỗi mẫu 250g) được lấy từ Burdur, Turkey. Kem và pho mát thường được nông dân sản xuất với phương pháp truyền thống và công khai bán ở chợ. Tất cả các mẫu được thu thập trong các túi nhựa vô trùng và vận chuyển đến phòng thí nghiệm.

+ Đếm tổng vi khuẩn hiếu khí mesophilic bacteria: Tổng vi khuẩn hiếu khí (TAMB) được xác định bằng phương pháp thông thường (Maturin và Peeler, 1998). Mỗi mẫu 10g huyền phù trong 90ml nước môi trường peptone vô trùng ( 0.85% NaCl 0.1% peptone) và nhỏ 0.05ml ở các độ pha loãng 10^-1- 10^-6 vào đĩa thạch ( Merck, Darmstadt, Germany). Sau 48 ± 2h ủ ở 30±1⁰C, CFU, tính cho mỗi gram mẫu.

+ Đếm Staphylococcus spp. và S. Aureus: 10g mẫu được pha loãng với 90ml nước môi trường peptone vô trùng và đồng nhất trong máy đồng nhất mẫu (Masticator, IUL Instruments – Spain). Pha loãng dung dịch mẫu 10^-1- 10^-6 lấy 0.1ml ở mỗi độ pha loãng, câý trang trên bề mặt thạch Baird – Parker (BD, Becton Dickinson, công ty Pháp), có thêm lòng đỏ trứng. Ủ các đĩa thạch này ở 370 C trong 24-48h. Các khuẩn lạc được phân lập đặc trưng là S.aureus (có tâm đen, trơn nhẵn, lồi, mép rìa tròn, mờ đục và có vòng sáng xung quanh), (Bennet và Lancette, 1998). Mười khuẩn lạc được tuyển chọn từ mỗi mẫu và chuyển đến từng ống nghiệm chứa môi trường TSB agar (như dung dịch gốc). Một loạt các thử nghiệm sau đó gồm : nhuộm Gram, catalase, coagulase, lên men kỵ khí của glucose và manitol, phân hủy đĩa thạch máu, sản xuất acetoin, methyl bred, vosges-proskauer, urase test, DNase, TNase (Bennet và Lancette, 1998).

+ Sự có mặt của Staphylococcal enterotoxins (A, B,C, D, E) được xác định bởi phương pháp Sanwich ELISA với bộ kit enterotoxins staphylococcal (RIDASCREEN ® set A, B, C, D, E ; R-Biopharm AG, Darmstadt, Đức).

Trong thực phẩm các độc tố này được xác địnhgần như chính xác với bộ kit từ 0,2-0,7ppb.

+ Nền tảng của sự nhạy cảm của RIDASCREEN ® set A, B, C, D, E dựa trên thí nghiệm di truyền miễn dịch ở giới hạn 0,1mg/ml. Kết quả và các bước thử nghiệm được hướng dẫn phía sau lời hướng dẫn của bộ kit của nhà sản xuất.

+ Cho 15ml đệm PSB (pH7.4) được cho vào 10g mẫu, lắc trong 15 phút để hòa lẫn chúng với nhau. Sau khi lắc đem ly tâm 3500 vòng/10 phút ở 150C.

+ Thu dịch nổi bằng màng lọc (0,2µm), (SM 16534, Sartorius, Minisart), để loại những mảnh vụn của thực phẩm ra. Sau đó cho 100µl dịch lọc vào các giếng từ A-G (từ giếng A-E được phủ với kháng thể đặc hiệu chống lại Staphylococcal enterotoxins, giếng từ F-G được kiểm tra và phủ với kháng thể không miễn dịch của động vật).100µl mẫu đối chứng dương tính được đưa vào giếng H. Sự hiện diện của độc tố bị giữ lại bởi các KT đặc hiệu. Đĩa được lắc bằng tay một cách nhẹ nhàng và giữ ở nhiệt độ phòng trong 1h. Sau đó các giếng được rửa lại 3 lần, mỗi lần với 250µl đệm rửa cho mỗi giếng. Thêm 100 µl enzyme liên kết vào các giếng rồi lắc nhẹ nhàng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1h. Rồi rửa l lại 3 lần với 250 µl đệm rửa. Thêm 50 µl chất nền và 50 µl chất tạo màu vào. Hòa trộn các đĩa nhẹ nhàng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Cuối cùng thêm 50 µl thuốc dừng vào mỗi giếng rồi lắc nhẹ nhàng. Sử dụng máy đo mật độ quang ở bước sóng 450nm với vi đĩa đọc ( ELX 800, Universal Microplate Reader, BIO – TEK).

 Phân tích thống kê:

Kết quả phân tích sử dụng phần mềm thống kê Minitab 15 ( Minitab version 15.1.0.0,2006) với các mô tả thống kê.

 Kết quả :

+ Sự có mặt của các VSV được phân lập từ các mẫu pho mát và kem (log₁₀cuf/g) được cho trong bảng 1 và 2.

cheese samples; SE: Standart error.

cream Samples; SE: Standart error.

+ Kiểm tra 50 mẫu pho mát có 3 mẫu (6%) được xác định là có độc tố Staphylococcal enterotoxins. Sự phân loại S. aureus và sự sản sinh enterotoxin của nó được phân lập từ các mẫu phop mát được cho trong bảng 3

Bảng 3: The count and enterotoxin type of S. aureus isolated from cheese samples.

No. of cheese samples	Count of S. aureus (cfu/g)	Type of Staphylococcal enterotoxin
28	2.6x105	B
32	5.5x107	C
48	8.0x105	E

+ Tuy nhiên không có mẫu kem nào phát hiện có Staphylococcal enterotoxins.



2.2.2. Phương pháp PCR:

- PCR là phương pháp dùng enzyme khuếch đại chọn lọc một đoạn DNA theo luật số mũ. Phản ứng được thực hiện với enzyme DNA chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Mỗi chu kỳ phản ứng gồm 3 chu kỳ:

+ Biến tính DNA có tác dụng tách 2 sợi đơn từ sợi khuôn khép, nhiệt độ biến tính khoảng 95⁰ C trong 30-60 giây.

+ Bắt cặp hai mồi và hai sợi đơn của khuôn, nhiệt độ khoảng 40-70⁰ C, kéo dài 30-60 giây.

+ Bước tổng hợp, kéo dài chuỗi nhiệt độ 72⁰ C giúp cho enzyme DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất.

- Ưu điểm của phương pháp này là:

+ Thời gian cho kết quả nhanh.

+ Có thể phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy.

+ Ít tốn kém về mặt nhân sự.

+ Hóa chất dễ tìm kiếm và tồn trữ.

- Khuyết điểm:

+ Tất cả các tế bào chết và tế bào sống đều cho kết quả dương tính trong kỷ thuật PCR.

+ Mật độ vi sinh vật hiện diện trong mẫu thường thấp, nên cần phải có thêm bước nuôi cấy để có mật độ đủ để phát hiện bằng PCR.

- Ứng dụng:

+ Dòng hóa các gene hay một đoạn gene, đoạn RNA.

+ Tạo đột biến.

+ Định lượng những khác biệt trong thể gene RT-PCR.

+ Điều tra hình sự.

+ Kiểm tra chất lượng, sự lẫn tạp sinh học.
Bảng: Hỗn hợp một phản ứng PCR (Bùi Đức Trí 2006).

Hóa chất	Thể tích	Nồng độ
10xPCR buffer	5µl	1X
10xdNTPs (2nM)	5µl	200µM
Primer xuôi (10pmol s/µl	5µl	1µM (50pmol s/50µl)
Primer ngược (10pmol s/µl)	5µl	1µM (50pmol s/50µl)
Mẫu DNA	2µl	1µM
Tap DNA polymerase (2U/µl)	0.5µl	1µg
H2O	27.5µl	1unit

- Một vài nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện gene độc lực của S.aureus.

+ Ở Akineden, 2001 đã dùng kỹ thuật PCR khuếch đại phát hiện gene độc lực của S.aureus trong sữa bò có độc tố ruột A (SEA), SEC, SED, SEG, SEI, SẸ, TSST-1 nhưng không thấy SEB, SEE, SHE và có cả sự hiện diện của hai độc tố màng ngoài là ETA và ETB.

+ Abdulmula E1-Ghodban, 2005 đã khảo xác 63 dòng S.aureus (40 từ nguồn bệnh sốc độc tố và 23 nguồn từ thức ăn) tìm độc tố TSST-1 bằng PCR. Chỉ có 3 dòng được phát hiện có sự hiện diện của TSST-1.

+ L.Chapaval, 2006 khảo xác 132 dòng vi khuẩn được phân lập từ sữa nguyên kem có sự hiện diện của độc tố ruột và TSST-1.

 Phương pháp PCR xác định coaguase của S.aureus trong sữa.

- Vật liệu:

+ 628 mẫu sữa được lấy từ các trang trại nuôi bò ở Murrah. Vi khuẩn kiểm tra: lấy 10 µl sữa từ mỗi mẫu rồi cấy ria 5% đĩa thạch máu cừu và cấy trên đĩa thạch lactose của Mac Conkey sau đó ủ trong 24 giờ ở 37⁰C

+ Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc : Gram dương, catalase dương tính, oxidase âm tính → xác định là Staphylococcus. ssp. Tụ cầu phân lập được tiếp tục phân loại coalugase (+) và (-) bằng thử nghiệm Citrate trên môi trường huyết tương thỏ (Gibbs và Skinner, 1966). Lấy mẫu coalugase (+) tiếp tục xác định đặc điểm sinh hóa theo thử nghiệm enzyme chịu nhiệt (Faruki và Mumbai, 1986). Sau đó kiểm tra bằng ngưng kết Latex (Staph Latex Test Kit, Himedia , Mumbai) và lên men Mannitol.

+ DNA lấy trực tiếp từ sữa bằng phương pháp Phuektes (2001). Lấy 1,5 ml sữa li tâm với 600 ml đệm NTE. Vorter mẫu và ổn định dịch bằng 100 µl (24% sodium dodecyl sulphate) và giữ trong bể nước (80⁰C, trong 10´). Sau đó cho thêm 12µl protein asek (20mg/ml, Fermentas, USA) và ủ tiếp trong bể nước (56⁰C, 2h)

- Hút 100µl NaCl 5M và 80µl CTAB-NaCl cho thêm vào ủ (56⁰C, 10´). Sau đó cho thêm PCI (phenol chloroform isoamyl alcohol) và CI (chloroform isoamyl alcohol) cho đến khi mẫu được làm sạch.

- Thu nhận kết quả ở 1/10 thể tích sodium acetate 3M (pH=5.2) và thêm 2 thể tích ethanol 100% lạnh vào, giữ ở -20⁰C để kết tủa DNA. Sau đó li tâm 15000 vòng/15´ ở 4⁰C để tách ethanol và thu DNA, sau đó rửa DNA 2 lần bằng ethanol 70%, cuối cùng làm khô.

- Sau đó, DNA được hòa tan trong 50µl đệm TE và giữ ở -20⁰C đến khi sử dụng tiếp.

- Tách DNA từ vi khuẩn nuôi cấy:

+ DNA được tách ra từ những vi khuẩn đã được phân lập trước đó. Những dòng khuẩn lạc riêng rẻ được để qua đêm trong 25µl dung dịch đệm TE và đun sôi đến 99⁰C trong 15´ sau đó làm lạnh nhanh bằng cách đặt trên băng.

+ Các mẫu kết quả DNA thu được, được bảo quản ở -20⁰C và 5µl của mỗi mẫu được sử dụng để phân tích PCR.

- Phản ứng PCR thực hiện với MgCl₂, Tap DNA polymerase, mồi. Cặp mồi:

F: ACCACAAGGTACTGAATCAACG

R: TGCTTTCGATTGTTCGATGC

(Aarestrupetal., 1995)

- Phản ứng PCR của Martineau et.al (1998): Sử dụng cặp mồi

F: AATCTTTGTCGGTACACGATATTCTTCACG.

R: CGTAATGAGATTTCAGTAGATAATACAACA.

- PCR được thực hiện trong bể luân nhiệt. DNA phân lập từ chủng S.aureus ATCC25923.

- Phân tích sản phẩm PCR: sau khi khuếch đại sản phẩm PCR sẽ được chạy trên gel agarose 2% trong đệm 0,5X Tris Borate EDTA (ethidium bromide 0,2µl/ml)

- Gen 100bp được sử dụng làm mục tiêu.

- Hiệu điện thế được sử dụng 6,5V và chạy điện di trong 1h. Sử dụng tia UV để xác định sự hiện diện của vi khuẩn. Độ nhạy của mồi được đánh giá bằng cách sử dụng các dung dịch pha loãng khác nhau (CFU/ml) của vi khuẩn.

- Kết quả:

Lane 1, 9, 11, 12: 610 bp; Lane 13: Negative control;

Lane 5, 6, 8, 10: 740bp; Lane L: 100bp Ladder

Lane 2, 7: 870bp;

Lane 3: 960 bp;

Lane 4: coa negative;

- Hỗn hợp phản ứng tối ưu hóa của gen coalugase dựa trên thí nghiệm chứa 200µl dNTP mix, 1 dung dịch đệm PCR với 10mMTris – HCL, pH = 8,8 , 50nM KCl và 0,8% Nonidet P40); 1,5 mM MgCl₂; 20pmol của mỗi mồi; 2,5U Taq DNA polymerase và 200µl DNA được tách chiết từ sữa và 25µl DEPC.

- Biến tính DNA ở 95⁰C trong 5´, 36 chu kì. Sau đó ủ ở 55⁰C trong 1´ và kéo dài ở 72⁰C trong 1.´.

- Phản ứng PCR được tối ưu hóa khi nồng độ MgCl₂ là 2,5mM.

- Kiểm tra 628 mẫu sữa thì có 238 mẫu chiếm (37, 89%) các chủng dương tính. Dựa vào đặc điểm gram và haemolysis có 156 mẫu chứa tụ cầu (65,55%).

- Tụ cầu được phân lập từ các chủng tiếp tục phân thành 128 coalugase (+) (53,78%) và 28 coalugase (-) (11,78%). Trên cơ sở thử nghiệm citrate coalugase huyết tương thỏ các coalugase (+) được phân lập và xác định sinh hóa như S.aureus.

- S.aureus được phân lập và sàng lọc bằng gen coalugase dựa trên những điều kiện tối ưu của phản ứng PCR thường có độ nhạy 100%.

- S.aureus được phân lập có sản phẩm khuếch đại có kích thước 108bp.

- Kết quả:

Lane 5: Staphylococcus aureus ATCC 25923;

Lane 6: Negative control with Nuclease free water;

Lane L: 100bp Ladder;

Phương pháp này được ứng dụng cho việc xác định sự sản sinh enterotoxin của Staphylococus aureus trong thực phẩm và trong môi trường nuôi cấy lỏng.

+ Thực phẩm nhiễm độc S.aureus thường chứa ít hơn 10ng độc tố/ 1g thực phẩm. Để phát hiện enterotoxin với mức độ thấp như trên mà không dùng biện pháp cô đặc cao độ, chỉ có phương pháp RIA (Radio Immuno Assay); enzyme liên kết khảo nghiệm miễn dịch ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay); khảo nghiệm ngưng kết huyết thụ động đảo ngược RPHA (Reverse passive hemagglutiation assay) là đủ nhạy. RPHA là biện pháp đơn giản nhất để thực hiện nhưng đôi khi nó cũng cho ra những phản ứng không đặc hiệu với những loại thực phẩm nhất định. Để khắc phục những vấn đề này khảo nghiệm ngưng kết latex thụ động đảo ngược RPLA đã được phát triển. Trong thử nghiệm này, kháng thể phủ hạt nhựa polystyrence thay thế cho các tế bào máu được sử dụng trong phương pháp RPHA. Phương pháp RPLA được dùng để phát hiện độc tố tụ cầu A, B,C, D (SEA, SEB, SEC, SED).

+ Kits là tên thương mại của bộ dụng cụ để thực hiện khảo nghiệm khảo nghiệm này.

Sau đây là mô tả về phương pháp RPLA.

+ Lưu ý: các thiết bị sử dụng trong Phương pháp RPLA phải được chuẩn bị và khử trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

+ SET_RPLA: Kit cho độc tố A, B, C, D.(được sản xuất từ Oxoid Canada hoặc Fisher Scientific). Gồm các chất thử sau đây đủ để thực hiện thử nghiệm trên 20 mẫu.

+ Huyền phù latex có độ nhạy sáng với kháng nguyên SEA, SEB, SEC, SED 5ml/lọ.

+ Huyền phù latex đối chứng 5ml/lọ.

+ SEA, SEB, SEC, SED được đông khô và bổ sung 0.5ml dung dịch chất làm loãng.

+ Dung dịch pha loãng (muối đệm phosphate chứa 0.5% (w/v)) huyết thanh bò và 50ml sodium azide 0.1 %.

+ Muối đệm phosphate (phosphate 0.05M, NaCl 0.15M, chứa 0.05% sodium azide pH 7.4).

+ Sodium hypochloride 2%(NaOCl).

+ Sodium hydroxide 4N (NaOH).

+ Acid hydrochloride 4N (HCl).

+ Tấm vi chuẩn (loại hình chữ V, có 8×12 giếng) và nắp đậy.

+ Micropipette (25µl) và các tip.

+ Platform shaker (nền lắc).

+ Blender hoặc homogenizer (máy trộn, máy làm đồng nhất).

+ Refrigerate centrifuge (máy li tâm làm lạnh).

+ Kit SET-RPLA phải được bảo quản ở nhiệt độ 2-8⁰C. Trong điều kiện này các chất thử sẽ giữ lại khả năng phản ứng đến ngày ghi trên hộp kit. Sau khi hoàn nguyên, những đối chứng enterotoxin nên được bảo quản ở nhiệt độ 2-8⁰C. Những đối chứng enterotoxin hoàn nguyên sẽ được giữ lại khả năng phản ứng trong 3 tháng hoặc đến ngày ghi trên hộp kit.

+ Những chất thử có nhiều nồng độ khác nhau vì vậy không nên đổi chổ lẫn nhau.

+ Những chất thử và chất làm loãng chứa sodium azide 0.1% và được sử dụng như chất bảo quản.

+ Một thùng chứa chất thải của sodium hypochloride 2% nên được chuẩn bị và sử dụng cho việc xử lý tất cả các mẫu dịch từ môi trường, mẫu dịch chiết thực phẩm, đối chứng độc tố…

*Chuẩn bị mẫu:

+ Đối với những thực phẩm có độ ẩm cao (thịt đông lạnh, hải sản, nấm đóng hộp,…). Cho 50g mẫu và 50ml muối đệm phosphate vào một máy xay. Trộn lẫn với tốc độ cao trong 2 phút, sau đó để yên đồng nhất trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Đối với thực phẩm bán khô (pho mai, giăm bong, xúc xích, bánh ngọt,…). Cho 50g mẫu và 100ml muối đệm phosphate vào một máy xay. Trộn với tốc độ cao trong 2 phút, sau đó để yên đồng nhất trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Đối với những thực phẩm khô (mì khô, bột sữa,…). Cho 50g mẫu vào và 150ml muối đệm phosphate vào một máy xay. Trộn với tốc độ cao trong 2 phút, sau đó để yên đồng nhất trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. (Với mì khô, đầu tiên mẫu được trộn riêng tốc độ cao trong 2-3 phút đến khi mẫu chuyển thành bột , sau đó thêm muối đệm phosphate và trộn các thành phần với nhau, để yên 1-2 giờ ở nhiệt độ 4⁰C. Trộn lại một lần nữa với tốc độ cao trong 2-3 phút, sau đó để yên đồng nhất trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Chuẩn bị xong, ly tâm đồng nhất với tốc độ 10000 vòng/phút, trong 20 phút ở 4⁰C.

+ Gạn bỏ phần nổi trên mặt.

+ Nếu phần nổi vẫn còn (như trong pho mai và các sản phẩm từ sữa khác), điều chỉnh pH đến 4.6 với HCl 4N. Ly tâm như trên và trung hòa dịch huyền phù bằng NaOH 4N. Nếu huyền phù vẫn còn, tiếp tục ly tâm nữa. Phương pháp RPLA yêu cầu mẫu dịch chiết thực phẩm không chứa vẫn đục để giảm thiểu phản ứng không đặc hiệu.

+ Một vài thực phẩm như mì khô thường cho các kết quả dương tính giả bằng thí nghiệm trực tiếp. Như vậy dịch chiết từ thực phẩm phải được tiến hành làm sạch hoặc cô đặc của sắc ký ái lực chelate kim loại. (Xem bảng 1).

+ Mỗi mẫu dịch chiết từ thực phẩm được khảo nghiệm ở 20 giếng của tấm vi chuẩn như sau:

 Mỗi trong 4 độc tố (enterotoxin) SEA, SEB, SEC, SED được cho vào 4 giếng và 1 giếng đối chứng latex.

 Mỗi mẫu dịch chiết có thể cần 6 hoặc nhiều hơn 6 giếng cho 1 trong 4 độc tố (enterotoxin) phụ thuộc vào lượng độc tố được sinh ra trong dịch chiết đó.

 Ghi kí hiệu trên tấm vi chuẩn: các lọai độc tố SEA, SEB, SEC, SED và latex đối chứng theo chiều dọc; độ pha loãng (0, 2X, 4X, 8X…) theo chiều ngang.

Chú ý: Mỗi ngày khảo nghiệm, hoạt động của mẫu huyền phù latex có độ nhạy sáng với kháng nguyên SEA, SEB, SEC, SED. Các mẫu huyền phù latex đối chứng được kiểm tra sự chống lại những enterotoxin tương ứng của chúng như đối chứng dương và dung dịch pha loãng như chứng âm. Không cần lặp lại những đối chứng này cho mỗi mẫu nếu các mẫu được khảo sát trong cùng một ngày. Loại bỏ những chất thử không đảm bảo yêu cầu về độ nhạy và độ đặc hiệu.

+ Cho 25µl dung dịch pha loãng vào mỗi giếng trừ giếng đầu tiên- giếng chứa những mẫu không pha loãng để xác định mỗi loại enterotoxin và đối chứng latex.

+ Thêm 25µl dịch chiết từ thực phẩm vào giếng đầu tiên và giếng thứ 2 (2X) để xác định mỗi loại enterotoxin và đối chứng latex (kí hiệu là A, B, C, D và L, một cách tương ứng).

* Xác định SEA:

+ Trộn kỹ hỗn hợp ở giếng thứ 2 (2X) (kí hiệu A) bằng cách bơm dung dịch vào ra micropipette ít nhất 5 lần.

+ Chuyển 25µl từ giếng 2 sang giếng thứ 3(4X), trộn tương tự như trên.

+ Chuyển 25µl từ giếng 3 sang giếng thứ 4(8X), trộn tương tự như trên.

+ Tiếp tục pha loãng 2 lần đến giếng thứ 5, 6 nếu thấy cần thiết.

+ Lặp lại tương tự các bước cho việc xác định SEB, SEC, SED và đối chứng Latex (kí hiệu B, C, D và L).

+ Lắc mạnh mỗi huyền phù latex trước khi sử dụng.

+ Thêm 25µl huyền phù latex nhạy với kháng nguyên A vào một trong 4 giếng ở loạt đầu tiên (A).

+ Thêm 25µl huyền phù latex nhạy với kháng nguyên B vào một trong 4 giếng ở loạt 2 (B).

+ Thêm 25µl huyền phù latex nhạy với kháng nguyên C vào một trong 4 giếng ở loạt 3 (C).

+ Thêm 25µl huyền phù latex nhạy với kháng nguyên D vào một trong 4 giếng ở loạt 4 (D).

+ Thêm 25µl huyền phù đối chứng latex vào một trong 4 giếng ở loạt 5 (L).

+ Đặt vạch tấm vi chuẩn xuống đáy của một cái hộp với 2 lớp giấy lọc nước bão hòa lốt hộp để duy trì ở 1atm. Ngoài ra, các giếng thí nghiệm được bịt lại bằng nắp hoặc một tấm phủ bằng nhựa để ngăn cản sự bốc hơi nước. Trong trường hợp này không cần thiết để tấm vi chuẩn trong một hộp ẩm.

+ Lắc tấm vi chuẩn trong hộp chứa nó 100 vòng/phút trên một nền lắc hoặc bằng tay khoảng 1-2 phút. Phải cẩn thận để không làm tràn các thành phần trong các giếng.

+ Để yên tấm vi chuẩn trên một bề mặt dao động tự do ở nhiệt độ phòng trong 20-24 giờ.

+ Kiểm tra các giếng có ngưng kết latex với một nền đen.

*Giải thích kết quả:

So sánh mức độ ngưng kết của các hạt latex.

+ Những giếng có khả năng ngưng kết ở mức độ từ (+) đến (+++) đươc xem là dương tính cho loại độc tố đặc hiệu.

+ Nếu phản ứng ngưng kết không rõ ràng, quan sát phản ứng bằng kính nhìn nổi 3 chiều hoặc kính lúp với độ phóng đại 10 lần (10X).

+ Các đối chứng latex nên là âm tính.

+ Trường hợp xảy ra ngưng kết không đặc hiệu trong các giếng đối chứng latex. Nếu điều này xảy ra các giếng mẫu vẫn có thể đọc là dương tính (nếu giếng mẫu dương tính có nồng độ pha loãng cao hơn so với giếng đối chứng có ngưng kết không đặc hiệu).

+ Nếu tất cả các giếng của độc tố A, B, C, D đều hiển thị các kết quả là dương tính với mức độ ngưng kết như nhau, thí nghiệm này được xem là dương tính giả.

+ Trong trường hợp này, mẫu dịch chiết thực phẩm phải qua bước làm sạch hoặc cô đặc liên quan đến sắc ký ái lực chelate kim loại.

+ Lượng enterotoxin tồn tại trong mẫu có thể ước tính bằng cách so sánh những kết quả ngưng kết với khả năng cô đặc chuẩn của các độc tố. Độ nhạy của thí nghiêm này là 0.5-1ng độc tố/ml mẫu dịch chiết. Nếu các enterotoxin không có giá trị, một mức độ ngưng kết dương tính (+) có thể ước lượng là 0.5-1ng độc tố/1ml mẫu dịch chiết.

BẢNG 1: CÁCH TIẾN HÀNH SẮC KÝ CHELATE KIM LOẠI.

- Bước 1:

Trộn hỗn hợp gel của giếng trong chai chứa iminodiacetate liên kết cộng hóa trị với Sepharose-6B và chuyển 8ml gel (cho 100-150ml dịch chiết thực phẩm) hoặc 5ml gel (cho 50-99ml dịch chiết thực phẩm) vào một cái phễu thủy tinh nung kết (a sentered glass funnel). Rửa gel với 100ml nước cất.

- Bước 2:

CuSO₄.5H₂O 0.5% được hòa tan bằng cách cho 1.25g CuSO₄.5H₂O tinh thể vào 250ml nước cất (cho 2 mẫu).

- Bước 3:

Thêm 100ml dung dịch CuSO₄.5H₂O vào phễu nung kết chứa gel đã được rữa.(Các gel sẽ chuyển sang màu xanh).

- Bước 4:

Sau khi gel chuyển sang màu xanh (do ion Cu²⁺). Rữa gel bằng 100ml nước cất để loại bỏ những ion Cu²⁺ thừa.

- Bước 5:

Chuyển gel sang chai chứa 100ml dung dịch pha loãng và dich chiết thực phẩm (50-100ml dịch chiết thực phẩm, pH 7.4), tạo điều kiện cho dịch chiết phản ứng với gel bằng cách trôn lẫn dung dịnh nhờ máy lắc trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

- Bước 6:

Chuyển hỗn hợp sang phễu nung kết và rữa 10 lần bằng dung dịch muối đệm phosphate hoặc BPS (buffer có sodium phosphate 0.05M chứa NaCl 0.15M, pH 6.5).

- Bước 7:

Giữ ống tiêm thủy tinh chứa 10ml và đặt miếng thấm tròn dưới đáy ống (miếng giấy lọc dày 0.6- 0.8mm) và thêm 2ml gel (unchared)

2.2.4. Lai phân tử:

- Phương pháp lai phân tử còn gọi là phương pháp mẫu dò, probes. Phương pháp này dùng để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là quá trình lai phân tử. Quá trình này bao gồm sự tách rời của hai mạch đôi của chuổi xoắn kép DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có nóng chảy tm của phân tử DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có trình tự nucleortide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Một trong hai mạch DNA bổ sung được cố định trên một giá thể rắn. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với trình tự DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt.

- Mục đích sử dụng gene trak S.aureus là một phương pháp dùng để phát hiện S.aureus trong thực phẩm. Thử nghiệm DNA hybridization sử dụng đầu dò DNA S.aureus và thiết bị đo màu để phát hiện S.aureus trong thực phẩm sau khi đã làm giàu mẫu. Phương pháp này dùng để định lượng xác định sự hiện diện của S.aureus ở mức độ ô nhiễm > 3 tế bào/g trong mẫu thực phẩm gốc. Một mẫu được xem là không có sự hiện diện của S.aureus nếu giá trị hấp thụ thu được ít hơn hoặc bằng giá trị giới hạn mà thử nghiệm đã thành lập. Một mẫu được xem là có sự hiện diện của S.aureus nếu giá trị hấp thụ thu được lớn hơn giá trị giới hạn mà thử nghiệm đã thiết lập.

- Thao tác thực hiện:

+ Làm phong phú các mẫu thực phẩm.

+ Lấy 0,5 ml mẫu cho vào 12x0,75 ống nghiệm.

+ Cho 0,1 ml thuốc thử để xử lý sơ bộ mỗi ống và lắc trong 5 giây, sau đó ủ trong bồn nước 37⁰C trong 30 phút.

+ Cho thêm 0,1 ml thuốc thử phân giải vào mỗi ống nghiệm và lắc trong 5 giây. Thay nước và ủ trong bồn nước 37⁰C trong 45 phút.

+ Thêm 0,5 ml mẫu dò S.aureus vào mỗi ống nghiệm.

+ Đặt dipstick vào mẫu, nâng lên, hạ xuống 5 lần để trộn và ủ ở 65⁰C trong 1 giờ.

+ Rửa dipsticks hai lần mỗi lần 1 phút, lần đầu 65⁰C, sau đó ở nhiệt độ phòng.

+ Chuyển tiếp vào ống chứa 0,75 ml enzyme liên kết và ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút.

+ Rữa dipsticks hai lần trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Chuyển dipsticks đến ống chứa 0,75ml chất nền tạo màu và ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút.

+ Lấy dipsticks ra và thêm 0,25ml thuốc dừng.

+ Đọc kết quả bằng cách sử dụng Gene Trak quang kế. Đo ở bước sóng 450 nm, mẫu âm tính thì OD < = 0,1, mẫu dương tính OD > 0,1. Để có kết quả chính xác nhất thì có thể thử nghiệm lại các phản ứng sinh hóa.

- Thuốc thử phân giải là: NaOH 0,75M.

- Hóa chất rửa: 50mM Tris-HCl (pH=7,5); 2mM EDTA; 100mM NaCl.

- Chất nền tọa màu: Tetramethylbenzidine, bảo quản ở nhiệt độ 2-8⁰ C.

- Enzyme liên kết: Antifluorescein antibody, bảo quản ở nhiệt độ 2-8⁰ C.

- Mẫu dò phát hiện chứa fluorescein isothiocyanate.

- Thuốc dừng: sulfuric acid 2M.

- Độ nhạy 1-5gCFU/25g.

- Thời gian thử 3h (sau khi làm giàu 24h).

- Các xét nghiệm cho mỗi kit lên đến 98.

- Hệ thống dò gene trak (Framingham, USA): mẫu dò là những đoạn oligomer DNA đánh dấu bằng hóa chất phát quang.

- Kỹ thuật khuếch đại bacteriophage để dò tìm S.aureus và xem thử vi khuẩn này có nhạy cảm hay đề kháng với methicillin hay không.

- Bộ thử nghiệm này do công ty Microphage sản xuất. Mẫu cấy máu được trộn đều trong hai ống tách rời và đặt trong lò ủ 5 giờ. Sau đó lấy hai ống nghiệm ra và lấy mỗi ống 6 giọt nhỏ vào giấy thử. Một ống tìm xem có S.aureus hay không, ống kia xem vi khuẩn có nhạy cảm hay đề kháng với kháng sinh không. Thử nghiệm nhận diện S.aureus có độ nhạy 93% và tính đặc thù 98%. Thử nghiệm chủng nhạy cảm với methicillin có độ nhạy 99% và đặc thù 99%.

- Phương pháp là dùng vài giọt mẫu máu hoặc đàm của bệnh nhân với dịch cấy có chứa một số lượng nhỏ bacteriophage. Nếu có vi trùng sống hiện diện trong mẫu phân tích thì bacteriophage sẽ xâm nhập vào vi trùng và sẽ sản sinh rất nhanh trong vòng vài tiếng đồng hồ và phóng thích ra môi trường thật nhiều phage. Sự hiện diện của phage sẽ được định bằng immunoassay. Còn nếu muốn xem coi nó có kháng với MRSA thì phải làm 2 thử nghiệm song song. Thử nghiệm một là thử nghiệm để phát hiện có sự hiện diện của vi khuẩn. Thử nghiệm hai cho thuốc kháng sinh vào mẫu có vi khuẩn trước khi đưa vào môi trường có phage. Như vậy nếu có vi khuẩn thì vi khuẩn sẽ bị kháng sinh giết chết hết và khi cho phage vào phage sẽ không sản sinh được. Kết quả âm chứng tỏ vi trùng nhạy thuốc. Ngược lại nếu vi trùng kháng thuốc mạnh mẽ chúng sẽ không bị giết chết bởi thuốc và khi cho vào môi trường cấy có phage, phage sẽ xâm nhập vào vi khuẩn để tăng trưởng sinh sản thật nhiều và cho kết quả dương tính. Có nghĩa là vi khuẩn kháng với thuốc dùng.

- Ngoài ra một số S.aureus có độc lực mạnh còn có khả năng kháng kháng sinh như penicillins, methicillin, dicloxacillin, nafcillin, oxacillin, cephalosporins… người mắc bệnh có nguy cơ tử vong cao. Nguyên nhân chủ yếu là do sự lạm dụng quá nhiều kháng sinh, chất kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi. Cho nên, thực phẩm trước khi đưa ra thị trường cần được kiểm định kỹ lưỡng và chặt chẽ.

1. Lê Ngọc Bích Vương _ Khóa luận tốt nghiệp _ Tổng quan về các vi sinh vật chỉ thị và biện pháp kiểm soát vi sinh vật trong thực phẩm.

2. Trần Linh Thước _ Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẫm.

3. Ths. BsckII Trần Văn Hưng, Ths. Bs Nguyễn Thị Đoan Trinh _ Vi Sinh Y Học

4. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương _ Thí nghiệm vi sinh vật thực phẩm.

5. PGSTS Nguyễn Hùng Tiến, PGSTS Bùi Minh Đức, PGSTS Nguyễn Văn Dịp _ Vi sinh vật thực phẩm kĩ thuật kiễm tra và chỉ tiêu đánh giá an toàn thực phẩm.

6. Ths Phạm Minh Nhựt _ Giáo trình phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm.

7. www.healthinfotranslations.org/pdfDocs/MRSA_VIET.pdf

9.http://www.iasvn.org/content/detail.php?subcatid=229&catid=108&contentid=964&langid=0

10. www.yduocngaynay.com

11.http://iascnsh.org/CNSH%C4%90%E1%BB%99ngV%E1%BA%ADt/CNSHTrongTh%C3%BAY/tabid/60/BlogDate/2009-08-31/DateType/month/Default.aspx

13. http://web.mit.edu/7.02/virtual_lab/PBC/PBC5virtuallab.html

14. http://tcyh.yds.edu.vn/2008/2008%20PB%20T12%20so%204%20-%20YTCC/@YTCC%2008%20Dan%20trang/T%E1%BA%A0O%20KH%C3%81NG%20TH%E1%BB%82%20%C4%90A%20D%C3%92NG%20V%C3%80%20X%C3%82Y%20D%E1%BB%B0NG%20QUI%20TR%C3%8CNH%20ELISA.htm

15. http://moodle.yds.edu.vn/tcyh/?Content=ChiTietBai&idBai=1043