CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN

Trong quá trình thực hiện đề tài này, chúng tôi tiến hành tách chiết và phân tích song song protein ty thể và protein microsome của tế bào từ mô gan ung thư (mẫu bệnh) và mô gan bình thường (mẫu đối chứng).

Mẫu mô được nghiền rồi thực hiện các bước ly tâm với những tốc độ khác nhau để phân tách ty thể và microsome của tế bào từ mô gan. Sau đó tách chiết protein và điện di SDS-PAGE để kiểm tra kết quả tách chiết.

Trong điện di SDS-PAGE, mỗi protein hoặc một vài protein có cùng khối lượng phân tử được hiện lên dưới dạng từng băng vạch khác nhau. Băng protein bắt màu thuốc nhuộm càng đậm chứng tỏ hàm lượng protein loại đó càng lớn. Số lượng băng trong một giếng điện di càng nhiều, thành phần protein của mẫu càng đa dạng phong phú.

Trong kết quả điện di lần 1, chúng tôi đã thấy có sự xuất hiện của các băng vạch protein. Tuy nhiên, sự biểu hiện của các băng vạch là chưa rõ ràng, đặc biệt với các băng vạch phía trên biểu hiện các protein có khối lượng lớn. Do đó, chúng tôi tiến hành tủa mẫu với dung dịch acetone với tỉ lệ 1 thể tích mẫu với 5 thể tích acetone trong 60 phút ở -20^oC.

Kết quả điện di kiểm tra lần 2 cho thấy các băng protein phân tách rõ ràng, với những băng trải đều từ trên xuống dưới và đặc biệt đã hạn chế được hiện tượng kéo vệt như ở bản gel điện di trước tủa (Hình 3).



Hình 3: Điện di trên gel polyacrylamide mẫu trước và sau khi tủa

với acetone tỷ lệ 1:5

Giếng 1: dịch chiết ty thể mô gan đối chứng trước tủa; giếng 2: dịch chiết ty thể mô gan đối chứng sau tủa; giếng 3: dịch chiết ti thể mô gan ung thư trước tủa; giếng 4: dịch chiết ti thể mô gan ung thư sau tủa; giếng 5: dịch chiết microsome mô gan đối chứng trước tủa; giếng 6: dịch chiết microsome mô gan đối chứng sau tủa; giếng 7: dịch chiết microsome mô gan ung thư trước tủa; giếng 8: dịch chiết microsome mô gan ung thư sau tủa.

Kết quả như trên đã cho thấy, với kỹ thuật tách ty thể và microsome, đã thu được các dịch protein phù hợp cho các bước tiếp theo của quá trình phân tích proteomics.

3.2. PHÂN TÍCH HỆ PROTEIN TY THỂ VÀ MICROSOME TÁCH TỪ MÔ GAN TRÊN BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU

Cho đến nay, điện di hai chiều (2-DE) vẫn là kỹ thuật được dùng phổ biến nhất để phân tách các protein trong một mẫu phức tạp. Kỹ thuật 2-DE cho phép phân tách các protein khác nhau chỉ đến 0.1 đơn vị pI và 1 kDa về khối lượng phân tử. Protein trong dịch chiết mô gan bình thường và mô gan ung thư của bệnh nhân ung thư gan cùng được phân tách bằng điện di hai chiều. Trên bản gel điện di, các protein trong mẫu được phân tách thành các spot riêng rẽ hoặc các dãy spot của một loại protein, đây là kết quả của việc cải biến protein, có thể do sự sắp xếp ARN hay biến đổi sau dịch mã, tạo ra các đồng phân có khối lượng phân tử tương tự nhau và điểm đẳng điện gần nhau.

Sau khi thu được protein, chúng tôi tiến hành điện di hai chiều để phân tách protein trong khoảng pH 4-7. Kết quả điện di cho thấy các protein đã được phân tách thành từng điểm (spot), hiện lên rõ ràng, riêng rẽ và phân bố trải khắp bản gel (hình 4 và 5).

Chiều 1: Điện di đẳng điện, sợi IPG strip pH 4-7 dài 17cm; Chiều 2: Điện di SDS-PAGE, gel polyacrylamide 10% có SDS

A: mẫu mô bình thường, B: mẫu mô ung thư




Hình 5. Điện di hai chiều mẫu protein microsome tách từ mô gan

Chiều 1: Điện di đẳng điện, sợi IPG strip pH 4-7 dài 17cm; Chiều 2: Điện di SDS-PAGE, gel polyacrylamide 10% có SDS

A: mẫu mô bình thường; B: mẫu mô ung thư

Phần mềm Phoretix cho phép so sánh sự biểu hiện của các protein thuộc mô gan ung thư so với mô gan bình thường thông qua sự biểu hiện của các spot trên các bản gel điện di hai chiều. Phần mềm giúp xác định các spot tương ứng trên các bản gel và tính toán giá trị cường độ khối trung bình của các spot, đây là cơ sở để so sánh mức độ biểu hiện của từng spot trên bản gel. Bằng phần mềm này, chúng tôi đã phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, và đã xác định được các spot trên mỗi bản gel.

Thống kê các spot protein ty thể biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thư so với bản gel mô gan bình thường, chúng tôi nhận thấy có 43 spot khác biệt rõ ràng giữa hai bản gel, bao gồm: 1 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thư, 1 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô bình thường, 21 spot biểu hiện tăng ở bản gel mô ung thư, 20 spot biểu hiện giảm ở bản gel mô ung thư. Hình 6, 7 và 8 minh họa một số spot protein ty thể biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thư và bản gel mô bình thường.



Hình 6. Hình ảnh một số spot protein ty thể biểu hiện khác biệt giữa hai bản gel điện di 2-D

A: bản gel mô bình thường; B: bản gel mô ung thư

A : bản gel mô bình thường; B : bản gel mô ung thư

Trên các bản gel phân tách protein microsome, chúng tôi đã xác định được 148 spot trên bản gel mô bình thường và 201 spot trên bản gel mô ung thư. Thống kê các spot protein microsome biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thư so với bản gel mô gan bình thường, chúng tôi nhận thấy có 27 spot khác biệt rõ ràng giữa hai bản gel, bao gồm: 6 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thư, 12 spot biểu hiện tăng ở bản gel mô ung thư, 9 spot biểu hiện giảm ở bản gel mô ung thư. Một số spot protein microsome biểu hiện khác biệt được thể hiện ở hình 9, 10 và 11.

A: bản gel mô bình thường; B: bản gel mô ung thư

A: bản gel mô bình thường; B: bản gel mô ung thư

3.3. XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MALDI-TOF MS

Sau khi phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, những spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường được cắt và thủy phân, thu được hỗn hợp peptide sử dụng cho phân tích khối phổ. Mỗi protein cho kết quả là một tập hợp dữ liệu về khối lượng của các peptide khác nhau sau khi bị phân cắt bởi enzyme trypsin. Trypsin là một protease thuộc nhóm serine, được sử dụng phổ biến nhất trong phân tích proteomics. Enzyme này phân cắt các protein tại đầu C của lysine và arginine. Thông thường, một protein 10 kDa sẽ bị trypsin phân cắt thành 30 đoạn peptide có khối lượng phù hợp để phân tích khối phổ. Một đặc điểm thuận lợi của trypsin đối với phân tích proteomics là enzyme này thể hiện hoạt tính mạnh ngay cả trong dung dịch lẫn khi thủy phân trong gel. Bằng kỹ thuật MALDI-TOF MS chúng tôi đã xác định được các peptide trong mẫu thủy phân protein và biểu thị bằng các đỉnh trên đồ thị. Với mỗi đỉnh trên đồ thị, trục hoành biểu diễn khối lượng của peptide (đơn vị dalton) và trục tung biểu thị độ lớn của tín hiệu tương ứng peptide đó khi phân tích khối phổ (đơn vị mV) (hình 12).



Hình 12. Phân tích khối phổ các peptide thu được sau khi thủy phân protein bằng trypsin: spot 49HCC thuộc bản gel điện di hai chiều mẫu mô gan bình thường

Sau khi phân tích khối phổ, protein được nhận dạng theo phương pháp PMF (Peptide mass fingerprint), khối lượng của các peptide được tạo ra sau khi thủy phân được so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI, sử dụng phần mềm Mascot (hình 13).

Kết quả cho thấy với mẫu protein ty thể chúng tôi đã nhận dạng được 18 protein trong đó có 13 protein đã được định danh và 5 protein giả thiết (bảng 3).

Kết quả với mẫu protein microsome, chúng tôi đã nhận dạng được 21 protein trong đó có 16 protein đã được định danh và 5 protein giả thiết (bảng 4).

Những điểm protein khác biệt, kể cả những protein biểu hiện tăng hay giảm trong mô gan ung thư đều là những đặc trưng về bệnh và có thể là những protein chỉ thị ung thư. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nhận dạng được 18 spot protein tương ứng với 13 protein đã được định danh và 5 protein giả thiết ở bản gel protein ty thể và ở bản gel protein microsome là 16 protein đã được định danh, 7 protein giả thiết trong tổng số 23 spot. Các protein đã được định danh được mô tả tóm tắt trong bảng 5 và bảng 6.

Trong nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy, các protein sốc nhiệt (Hsp) biểu hiện tăng lên ở người bệnh so với người bình thường gồm có: Chain A, Crystal Structure of The Human 70 kDa Heat Shock Protein 5, 60 kDa heat shock protein, 78 kDa glucose-regulated protein ở protein ty thể và Heat shock 70 kDa protein 8 isoform 2 variant ở protein microsome.

Như chúng ta đã biết, Hsp còn được gọi là các stress protein, là một nhóm các protein có mặt ở tất cả các tế bào sống, được đặt tên theo khối lượng phân tử của chúng. Chúng xuất hiện hiện khi tế bào phải trải qua những dạng stress của môi trường như nóng, lạnh hay thiếu oxy. Ở điều kiện bình thường, các HSP cũng xuất hiện trong tế bào và hoạt động như các chaperone đảm bảo cho các protein của tế bào hoàn thiện về cấu trúc phù hợp với chức năng tại một vị trí vào một thời điểm thích hợp. Ví dụ, các HSP giúp cho các protein mới tổng hợp được cuộn lại để thể hiện chức năng cơ bản của chúng. Chúng cũng giúp đưa các protein từ chỗ này qua chỗ khác của tế bào đồng thời vận chuyển các protein già đến “thùng rác” trong tế bào. Các protein này cũng có vai trò trong trình diện kháng nguyên giúp hệ miễn dịch nhận ra các tế bào bệnh. Thông thường, các protein này ở bên trong tế bào nhưng khi chúng được tìm thấy bên ngoài tế bào thì có nghĩa là tế bào đã bị phá vỡ do tổn thương hoặc hoại tử. Sự xuất hiện của HSP bên ngoài tế bào là tín hiệu rõ ràng nhất về sự nguy hại gửi đến hệ miễn dịch để hình thành các phản ứng của cơ thể nhằm chống lại sự viêm nhiễm hoặc bệnh tật [54].

Tế bào ung thư được xem như các peptide kháng nguyên đặc thù không được phát hiện và loại trừ bởi hệ miễn dịch, các protein sốc nhiệt vận chuyển cả những peptide bình thường và ung thư trong mọi tế bào, do đó nếu ta phân tách được các phức hệ peptide-HSP từ các khối u theo trật tự có thể sẽ giúp cho hệ miễn dịch nhận ra ung thư [54].

Một số chất ức chế HSP được chỉ ra như là chất chống ung thư. Hiện nay, khả năng ức chế của 17-AAG (17-N-Allylamino-17-demethoxygeldanamycin) với HSP 90 đang được nghiên cứu trong các thử nghiệm lâm sàng điều trị một số dạng ung thư như leukemia và đặc biệt là ung thư thận [50].

Trong nhiều thập kỉ, người ta đã nghiên cứu phòng ngừa bằng tiêm chủng từ các khối u tế bào đã làm yếu được tiêm như vaccine vào cơ thể chuột thí nghiệm. Bằng các thử nghiệm với các tế bào khối u được phá vỡ sau đó thu các phần của tế bào thành các phân đoạn có chứa HSP và sử dụng các phân đoạn đó như vaccine trong phòng chống sự tiến triển ung thư trên chuột. Khi đó, cơ thể chuột sẽ loại bỏ các khối u bị làm yếu này và ung thư sẽ không tiến triển. Trong nghiên cứu về tác dụng của HSP trong vaccine phòng chống ung thư, Srivastava (2005) đã chỉ ra rằng: HSP luôn liên kết với một hoặc một số peptide khác trong hoạt động của mình và HSP chỉ có tác dụng chống lại ung thư khi chúng liên kết với các peptide. Tóm lại, các protein sốc nhiệt đã được khẳng định như là một chỉ thị ung thư và có thể trở thành yếu tố trong chế tạo vaccine phòng ngừa ung thư [50]. Cơ chế hoạt động của Hsp70 như hình 14

Hsp70 ức chế apoptosis bằng cách điều chỉnh sự thoái giảm protein và trình diện kháng nguyên. Hsp70 ức chế apoptosis theo cách can thiệp vào sự hình thành apoptosome bằng cách gắn vào Apaf, do đó ngăn cản sự hoạt hóa của caspase-9 và caspase-3. Nó cũng ức chế apoptosis bằng cách tương tác trực tiếp với ASK-1 hoặc JNK. Hsp70 có thể hỗ trợ trong quá trình làm thoái giảm protein đã bị ubiquin bằng cách chuyển chúng cho proteasome. Hsp70 cũng liên kết với các peptide còn lại từ các protein bị thoái giảm và giúp trình diện peptide lên bề mặt tế bào với phức hệ lớp I (MHC I). Phức hợp peptide-Hsp70, cũng được trình diện lên bề mặt tế bào nhờ phức hệ lớp II (MHC II) [55].

Nhằm tìm hiểu mối quan hệ họ hàng ở mức độ phân tử, chúng tôi tiến hành phân tích chủng loại phát sinh của HSP70 bằng chương trình Phylip sử dụng phương pháp maximum likehood và maximum parsimony. Kết quả được trình bày ở hình 15, 16, 17.

Kết quả so sánh trình tự protein Hsp70 của người với các trình tự khác trong cơ sở dữ liệu protein bằng chương trình Blast đã cho thấy có 18 loài động vật có trình tự tương đồng ở mức trên 93%. Phân tích mối quan hệ về trình tự Hsp70 giữa các loài động vật trên sử dụng chương trình Phylip đã cho thấy cả hai phương pháp maximun parsimony và maximum likelihood đều cho kết quả Hsp70 người cùng nhóm với Hsp của Xenopus laevis, Bos taurus, Oryctolagus cuniculus, Megalobrana amblycephala, Mus musculus, Rattus norvegicus. Tuy nhiên, theo phương pháp ClustalX thì Hsp70 của người lại gần gũi hơn với Hsp70 của Rattus norvegicus (chuột cống).

Theo kết quả nhận dạng protein từ bản gel protein ty thể, protein Celllular tumor antigen p53 biểu hiện giảm ở mô ung thư so với mô đối chứng. Celllular tumor antigen p53 (TP53) thuộc họ p53 tham gia vào các quá trình sinh học: chết theo chu trình, sao mã, điều hòa sao mã và tương tác virus-vật chủ. Protein này hoạt động như là một chất ức chế khối u, ức chế phát triển hoặc chết theo chu trình phụ thuộc tình trạng và loại tế bào. TP53 liên quan đến sự điều hòa chu trình phân bào như là một yếu tố hoạt hóa dịch mã để điều hòa âm tính bằng việc điểu khiển một nhóm gene cần thiết cho quá trình này. Một trong số các gene được hoạt hóa là một chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin. TP53 trong chết theo chu trình biểu hiện trung gian bằng cách hoặc là kích thích biểu hiện kháng nguyên BAX và FAS hoặc biểu hiện lại Bcl-2.

Trong in vitro, tương tác giữa TP53 với ung thư liên quan đến các protein virus trong đó có protein lõi HCV làm suy giảm TP53 khiến cho sự điều hòa sinh trưởng tế bào bị rối loạn. Lượng TP53 giảm trong tế bào với mức độ lớn, đột biến hoặc bị bất hoạt khoảng 60% sẽ là ung thư khi tế bào bị biến đổi. Điều này cũng liên quan đên các tế bào ung thư thực quản (ESCC). Suy giảm TP53 là nguyên nhân của hội chứng Li-Fraumeni (LFS) [51].

P53 có thể gây ra apoptosis bằng hai cơ chế độc lập (hình 18). Một con đường phụ thuộc vào chức năng của p53 thông qua sự tăng tỉ lệ phiên mã làm tăng biểu hiện của Bax, IGF-BP3 và protein Fas, và giảm sự biểu hiện của BCL2, IGF-1R và IGFII. Điều hòa tăng và giảm các protein liên quan này dẫn tới apoptosis. Con đường thứ hai độc lập với chức năng phiên mã p53 nhưng phụ thuộc vào tương tác protein-protein p53: protein p53 có thể gắn vào protein của tế bào tham gia vào quá trình tổng hợp DNA như protein kháng nguyên tái tạo (RPA), và trong sửa chữa DNA như TFIIH [15].

Một số đột biến của gen p53 có thể tạo ra một loại protein không thể liên kết đặc hiệu với DNA, và do đó mất đi khả năng hoạt hóa phiên mã của nó. Mặc dù đã tìm thấy một số đột biến như 175Pro, kết quả dẫn đến mất khả năng của protein p53 gây ra apoptosis trong một số tế bào, nhưng các tế bào này vẫn có thể gây ức chế sinh trưởng [45]. Ba loại biến đổi gen có thể ảnh hưởng đến chức năng của protein p53: (i) xóa một phần hoặc toàn bộ gen là đủ để loại bỏ các chức năng ức chế khối u, góp phần vào sự phát triển của khối u, như đã được biết đến trong mô hình chuột bị bất hoạt p53, (ii) Một tính trạng trội làm vô hiệu ảnh hưởng của một số đột biến quan trọng mà có thể bất hoạt chức năng của protein p53 loại hoang dại thông qua ức chế khả năng liên kết ADN của nó và do đó tăng cường chức năng. Nghiên cứu về chuyển gen mang một allele đột biến, mã hóa protein p53 đột biến ở vị trí 135Val, kết quả mất chức năng ức chế khối u và góp phần tăng sự phát triển khối u [8]. (iii) Một số đột biến của p53 làm tăng chức năng gây ung thư. Ví dụ, 175His của protein p53 được đặc trưng bởi sự mất chức năng ức chế khối u, tính trạng trội làm vô hiệu ảnh hưởng tăng chức năng tới xu hướng tạo ung thư và khả năng di căn của các tế bào ung thư thiếu protein p53 loại hoang dại [33].

Phân tích đột biến của gen p53 giúp cho việc điều tra nguyên nhân, dịch tễ học, và sinh bệnh học của ung thư ở người [34]. Đây là đột biến gen phổ biến nhất trong ung thư ở người [32].

Bốn dạng ung thư chiếm 80% xảy ra liên quan đến đột biến TP53 ở tế bào mầm gồm: ung thư vú, u não, u xương và ung thư thận. Ngoài ra, suy giảm TP53 có thể liên quan đến ung thư gan và cũng tìm thấy ở ung thư phổi. Tóm lại, đây là một chỉ thị cho rất nhiều bệnh và đặc thù cho ung thư khi protein này biểu hiện giảm ở các đối tượng nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra là phù hợp với các công bố trên thế giới.

Nhằm tìm hiểu mối quan hệ họ hàng ở mức độ phân tử của P53, chúng tôi cũng tiến hành phân tích chủng loại phát sinh của p53 bằng chương trình Phylip sử dụng phương pháp maximum likehood và maximum parsimony. Kết quả được trình bày ở hình 19, 20, 21.



Hình 19. Cây chủng loại phát sinh của protein p53 theo phương pháp maximum parsimony



Hình 20. Cây chủng loại phát sinh của protein p53 theo phương pháp maximum likehood



Hình 21. Cây chủng loại phát sinh của protein p53 theo ClustalX2

Kết quả phân tích chủng loại phát sinh bằng các phương pháp Maximum parsimony, Maximum likelihood và ClustalX đều cho thấy trình tự của P53 của người cùng nhóm với Macaca mulatta (khỉ vàng). Vì vậy, kết quả này bảo đảm độ tin cậy.

Ty thể là một bào quan quan trọng, nó được coi là nhà máy sản xuất năng lượng của tế bào. Tại đây xảy ra quá trình hô hấp tế bào, chuyển ôxy và chất dinh dưỡng thành adenosine triphosphate (ATP). ATP là “dòng” năng lượng hóa học của tế bào để cung cấp năng lượng cho mọi hoạt động của mình. Không có ty thể, động vật bậc cao đã có thể không tồn tại vì nếu vậy tế bào của chúng chỉ có thể thu nhận năng lượng thông qua hô hấp yếm khí, một quá trình kém hiệu quả hơn nhiều. Trên thực tế, ty thể giúp tế bào có thể sản xuất năng lượng nhiều hơn gấp 15 lần so với khi tế bào không có bào quan này. Các động vật có cấu trúc phức tạp, bao gồm cả con người, đều cần một lượng lớn năng lượng mới có thể tồn tại được.

ATP synthase là một protein nằm trên màng trong ty thể có vai trò chính trong việc tổng hợp adenosine triphosphate (ATP) từ adenosine diphosphate (ADP) và phosphat vô cơ.

ATP synthase được cấu tạo bởi hai phần chính là F0 và F1. Phần F1 bao gồm các tiểu đơn vị: 3 alpha, 3 beta, 1 gamma, 1 epsilon, và 1 delta. Phần F0 bao gồm 2 tiểu đơn vị b2, và c từ 9 đến 12 được sắp xếp đối xứng. Phần F0 và F1 liên kết nhau bởi lõi trung tâm (dưới đơn vị gamma và epsilon) và nhánh bên (b và delta). Dòng electron sẽ kích hoạt đĩa trên màng và lõi trung tâm quay, sự quay này tiếp theo đó điều khiển ái lực của tiểu đơn vị beta với nucleotide (ADP và ATP) đẫn đến tạo năng lượng ATP (hình 22).



Hình 22. Mô hình phân tử ATP synthase [7]

Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy sự biểu hiện tăng mạnh của protein ATP synthase. Sự biểu hiện tăng của protein này trong mẫu protein ty thể phù hợp với giả thiết rằng sự tăng sinh nhanh chóng của các tế bào ung thư đặc biệt là ung thư gan đòi hỏi một nguồn năng lượng lớn và sự tăng cường của enzyme ATP synthase sẽ giúp tổng hợp năng lượng nhanh chóng.

Trong nghiên cứu này, Hexokinase cũng biểu hiện tăng. Hexokinase là một enzyme phosphoryl hóa đường 6 cacbon thành hexose phosphate, có trong phần lớn các các sinh vật, glucose là một cơ chất quan trọng của hexokinase, và glucose-6-phosphate là sản phẩm quan trọng nhất của chúng. Đây là một enzyme tham gia vào quá trình đường phân trong tế bào. Quá trình đường phân là một quá trình không thể thiếu trong tế bào vì quá trình này cung cấp năng lượng ATP cho tế bào hoạt động [48].

Ở động vật có vú, hexokinase gồm bốn dạng isozyme quan trọng, nằm ở các vị trí khác nhau trong tế bào và có động học khác nhau về cơ chất, các điều kiện và chức năng sinh lý. Chúng được kí hiệu lần lượt là hexokinase I, II, III và IV hoặc A, B, C và D. Hexokinase I, II và III là isozyme có ái lực cao với glucose trong đó hexokinase II/B là dạng chủ yếu giữ vai trò điều hòa trong các kiểu tế bào của động vật có vú và hàm lượng được tăng lên ở nhiều loại bệnh ung thư. Hexokinase II/B có liên quan đến năng lượng sinh học và quá trình apoptosis của tế bào. Theo nghiên cứu của Kim và Cộng sự (2007), họ đã chỉ ra mối liên quan của HK II trong quá trình làm ổn định ty thể trong tế bào HCC. Những phát hiện chính trong nghiên cứu này liên quan đến sự tham gia của HK II trong trong điều hòa sự ổn định của ti thể trong tế bào ung thư gan. Đặc biệt, nghiên cứu này cho thấy tình trạng thiếu oxy sẽ làm tăng sự ổn định của ty thể theo HK II, ngoài ra HK II ức chế hoạt hóa các tín hiệu apoptosis qua ty thể. Hơn nữa hệ thống HK II ức chế biểu hiện tính hiệu quả kháng u gây ra apoptosis. Theo nghiên cứu này, họ cũng thấy rằng sự thiếu hụt oxy gián tiếp tăng HK II gây ra ổn định ty thể và 3-BrPA gây ra sự thay đổi cấu trúc trong PTPC đưa đến hoạt hóa các tín hiệu apoptosis ty thể. Các cơ chế hoạt hóa phụ thuộc tín hiệu apoptosis của ty thể là phức hệ và nhiều cơ chế dẫn đến giải phóng Cytochrome C. Ví dụ, họ protein proapoptosis Bcl2, chẳng hạn như tBid, Bax/Bak và Bim điều hòa apoptosis bằng sự tương tác với VDAC ở màng ngoài ty thể [38]. Nó cũng có thể mở lỗ thay đổi tính thấm của ty thể làm thủng màng ngoài và giải phóng các protein phía trong màng như Cytochrome C, AIF và Smac/DIABLO. Mặc dù cấu trúc lỗ bán thấm của ty thể không hoàn toàn giải thích trọn vẹn, PTPC là một phức hợp của nhiều loại protein gồm VDAC, ANT, CypD và HK II. Trong nghiên cứu này, người ta nhận thấy HK II ức chế 3-BrPA bằng sự phân hủy HK II từ PTPC và nó là nguyên nhân PTPC mở và giải phóng Cytochrome C ở trong bào tương. Do đó, những quan sát chung cho thấy HK II gây ra một cơ chế chính của các tế bào còn lại trong môi trường thiếu oxy, cũng như tăng tính thấm HCC và HK II ức chế có thể biểu hiện tính hiệu quả kháng u bằng sự hoạt hóa các tín hiệu apoptosis ty thể trong sự phát triển các khối u. Nghiên cứu này cũng cho thấy sự biểu hiện quá mức của HK II ở mô u so với mô bình thường. Vì vậy, để ngăn sự phát triển của các khối u cần giảm lượng HK II [57].

Chúng ta đều biết, tế bào gan có tốc độ phân chia và phát triển rất nhanh, đặc biệt là khi chúng chuyển sang trạng thái ung thư. Điều này đòi hỏi các protein tham gia điều hòa kiểm soát việc sao chép, phiên mã và dịch mã trong các tế bào phải tăng cường hoạt động. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nhận dạng được các protein tham gia vào các quá trình phiên mã và dịch mã. NAD-dependent deacetylase sirtuin-6, Rho guanine nucleotide exchange factor, Neural retina-specific leucine zipper protein, Zinc finger protein 806 trong ty thể và các protein Myelin transcription factor 1-like protein, Translin-associated factor X-interacting protein 1 trong microsome. Tất cả các protein này đều có biểu hiện tăng ở mô ung thư.

Yếu tố Rho là một protein gồm có 6 tiểu đơn vị có ái lực cao với ARN đơn, có hoạt tính helicaza và ATP-aza để tháo xoắn sợi lai ADN-ARN. Khi bám vào ARN, yếu tố Rho sẽ phân giải ATP. Năng lượng được giải phóng giúp nó chuyển dọc sợi ARN mới sinh tới bong bóng phiên mã, sau đó yếu tố Rho tách đôi ADN-ARN và giải phóng ARN.

NAD-dependent deacetylase có khả năng tác động tới 'Lys-9' và 'Lys-56' của histone H3. Sự acetyl hóa của histone H3 trong dị nhiễm sắc ở giai đoạn S của chu kỳ tế bào. Deacetylates 'Lys-9' của histone H3 tại đích NF-Kappa-B và có thể điều hòa giảm sự biểu hiện của một tập hợp các gen đích NF-Kappa-B. Sự deacetyl hóa của nucleosome ngăn cản RELA liên kết với ADN đích. Điều này cần thiết cho liên kết giữa ADN với telomere trong giai đoạn-S và để duy trì telomere bình thường và giúp cho sự ổn định di truyền.

Họ protein Zinc finger là những protein tham gia vào việc điều hòa phiên mã. Zinc finger protein gắn với ADN tại vị trí liên kết với các yếu tố phiên mã, các protein điều hòa, do đó protein này biểu hiện tăng sẽ ngăn cản hoạt động phiên mã trong tế bào ung thư [51].

Trong quá trình miễn dịch chống ung thư, dường như vai trò của sự đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào thường xuyên chiếm ưu thế. Quá trình này có sự tham gia của các phức hệ phù hợp tổ chức mô chủ yếu (MHC), ở người gọi là HLA. Trong phân tích proteomics microsome này, chúng tôi nhận dạng được protein MHC class I (MHC I). Protein này biểu hiện giảm ở mô gan ung thư so với mô gan bình thường. Protein MHC được tích lũy trong lưới nội chất và làm nhiệm vụ như là nơi trung chuyển phân tử. Trong tế bào mang virus hay tế bào ung thư, các kháng nguyên nội sinh nằm trong tế bào chất, sẽ được các vi thể proteasome chế biến thành các peptide kháng nguyên. Các peptide này được TAP vận chuyển vào khoang lưới nội chất để liên kết với rãnh của MHC I. Sau đó, phức hệ MHC I- peptide kháng nguyên được đóng gói bằng cách bọc màng và được vận chuyển lên bề mặt tế bào để trình diện cho tế bào TCD8⁺, kích thích tế bào T sản sinh ra Lymphokin để tiêu diệt tế bào mang kháng nguyên nội sinh. Khi tế bào bị nhiễm virus nội sinh, lượng MHC I luôn được tổng hợp dư thừa, sẵn sàng làm nhiệm vụ trình diện kháng nguyên nội sinh. Trong nghiên cứu của chúng tôi, protein MHC I giảm, điều này gợi ý rằng, quá trình tiến triển thành ung thư ở tế bào gan đã làm ảnh hưởng tới sự đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, tế bào ung thư không bị tiêu diệt do thiếu hụt sự nhận diện kháng nguyên nội sinh [2].

Beta-actin là những protein tham gia cấu trúc tế bào, có tính bảo thủ cao, nó liên quan đến các dạng vận động tế bào khác nhau và biểu hiện ở tất cả các tế bào nhân chuẩn. Sự polymer hóa actin hình cầu (G-actin) dẫn tới hình thành một cấu trúc sợi (F-actin) trong cấu trúc xoắn kép. Mỗi actin có thể gắn với 4 phân tử khác. Thiếu hụt actin gây rối loạn vận động liên quan đến thần kinh từ đó dẫn đến rối loạn trương cơ thể hiện ở sự kéo dài co cơ trơn là nguyên nhân của tư thế cũng như vận động bất bình thường. Trong nghiên cứu của chúng tôi, beta-actin biểu hiện tăng rõ rệt trên bản gel mô ung thư, đây có thể là kết quả của việc tế bào gan ung thư tăng sinh nhanh chóng kéo theo các thành phần tham gia cấu tạo tế bào cũng tăng [47].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng nhận thấy có sự biểu hiện của Major vault protein trên mô ung thư. Major vault protein là một protein màng được mã hóa bởi gene MVP. Vaults là một cấu trúc gồm nhiều tiểu đơn vị, có vai trò tham gia kênh vận chuyển các chất giữa nhân và tế bào chất. Protein này gián tiếp tham gia kháng lại thuốc có thể thông các quá trình vận chuyển. Nó được phân bố rộng rãi trong các mô bình thường, và biểu hiện quá mức trong các tế bào ung thư đa kháng thuốc. Sự biểu hiện quá mức của protein này là một chỉ thị đầy tiềm năng trong việc khám và điều trị bệnh [45].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy sự biểu hiện đa dạng của những protein khác biệt không chỉ là đặc trưng của riêng một bệnh. Những chỉ thị riêng cho bệnh có thể được hình thành trong một chuỗi các tác động tổng hợp với các bệnh khác, điều này góp phần bổ sung cho ý kiến chỉ thị ung thư có thể không đặc hiệu với riêng một loại ung thư nào mà phản ánh mối liên quan chặt chẽ giữa sự tiến triển của bệnh ung thư với các quá trình viêm và bệnh lý khác trong cơ thể.

Qua quá trình phân tích proteomics của mô gan từ bệnh nhân ung thư gan, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

1. Bằng kỹ thuật điện di hai chiều kết hợp với khối phổ MALDI-TOF MS, chúng tôi đã xác định được sự biểu hiện khác biệt của các protein ty thể và microsome tách từ mô gan ung thư và mô gan bình thường:

- Phân tích protein ty thể đã xác định được 43 spot protein biểu hiện khác biệt giữa 2 bản gel và đã nhận dạng được 18 protein, trong đó có 13 protein đã được định danh và 5 protein giả thiết.

- Phân tích protein microsome đã xác định được 27 spot protein biểu hiện khác biệt giữa 2 bản gel và đã nhận dạng được 23 protein, trong đó có 16 protein đã được định danh và 7 protein giả thiết.

2. Các protein đã được nhận dạng trong ty thể bao gồm các protein cấu trúc tế bào, các protein tham gia vào quá trình miễn dịch bảo vệ cơ thể, quá trình trao đổi chất, phiên mã, dịch mã. Đặc biệt trong đó có các protein: HSP 70, HSP 60, ATP synthase biểu hiện tăng, và các protein p53, MHC I có biểu hiện giảm rõ rệt ở mô ung thư.

3. Các protein đã được nhận dạng trong bản gel microsome bao gồm các protein tham gia vào các quá trình trao đổi chất, điều hòa phiên mã, miễn dịch và protein cấu trúc tế bào. Đặc biệt là các protein: HSP 70, MVP, Zinc finger và Beta-actin đều có biểu hiện tăng ở mô ung thư.

4. Trên cơ sở phân tích chủng loại phát sinh ở mức phân tử bằng chương trình phylip đã cho thấy Hsp70 của người thuộc cùng nhóm với Hsp70 của một số động vật khác như Xenopus laevis, Bos taurus, Oryctolagus cuniculus, Megalobrana amblycephala, Mus musculus, Rattus norvegicus, còn P53 của người gần gũi hơn với P53 của khỉ vàng (Macaca mulatta).