PHÂn lậP, tuyển chọn và nghiên cứu VI khuẩn lactic sinh β- galactosidase từ SÁp ong



tải về 225.22 Kb.
trang1/2
Chuyển đổi dữ liệu15.10.2017
Kích225.22 Kb.
#33669
  1   2


PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU VI KHUẨN LACTIC SINH β- GALACTOSIDASE TỪ SÁP ONG

Trần Thị Thúy, Nguyễn Thị Vân

Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

Tóm tắt

Sáp ong là nguồn nguyên liệu tự nhiên có giá trị dinh dưỡng và phòng trị nhiều bệnh. Từ nguồn nguyên liệu tự nhiên này, chúng tôi đã tiến hành phân lập và tuyển chọn được 12 chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp enzyme β- galactosidase. Trong số các chủng tuyển chọn, chủng vi khuẩn lactic LT12 sinh enzyme β- galactosidase cao nhất, được tuyển chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Các nghiên cứu về đặc tính sinh học, sinh lý và sinh hóa cho thấy chủng LT12 là vi khuẩn Gram dương, tế bào hình que, không sinh nội bào tử, hoạt tính catalase âm, lên men lactic dị hình. Khả năng sinh enzyme của chủng LT12 là tốt nhất sau 36 giờ nuôi cấy (đạt 0,47 IU/ml) trong điều kiện môi trường MRS dịch thể (pH= 7) và nhiệt độ là 30ºC. Để sản xuất enzyme β- galactosidase với giá thành rẻ hơn, môi trường 25% bắp cải : 75% MRS hoặc 50% bắp cải : 50% MRS có thể được sử dụng để thay thế môi trường MRS.



Từ khóa: β-galactosidase, vi khuẩn lactic (LAB), sáp ong

1. Đặt vấn đề

Sữa là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giầu protein và khoáng chất, đóng vai trò quan trọng trong chế độ dinh dưỡng của mọi lứa tuổi, đặc biệt là trẻ em và người già [4]. Phần lớn đường trong sữa động vật có vú là đường lactose (β-D-galactopyranosyl-(1-4)-α-D-glucopyranose, loại đường đôi gồm hai đơn phân glucose và galactose liên kết với nhau bởi liên kết 1-4 glucoside). Khoảng 75% dân số thế giới, trong đó có khoảng 46% người ở độ tuổi 50 trở lên gặp tình trạng bất dung nạp lactose hay còn gọi là thiểu năng chuyển hóa lactose (khi uống sữa, xuất hiện hiện tượng đầy hơi, chướng bụng, nôn, tiêu chảy). Tình trạng này là do khả năng tổng hợp β-galactosidase (enzyme thủy phân lactose thành glucose và galactose) ở người bị mất dần khi qua tuổi cai sữa [1, 4]. Kết quả là đại đa số người trưởng thành và người già trên thế giới đều mắc bệnh thiểu năng chuyển hóa lactose. Vì vậy, sản phẩm sữa cho những người không hấp thụ được lactose thường phải được xử lý với enzyme β-galactosidase trước khi đến tay người tiêu dùng.

Vi khuẩn lactic (LAB) được coi là nguồn vi khuẩn hữu ích sinh β-galactosidase, chúng còn được coi là vi khuẩn an toàn trong chế biến thực phẩm (GRAS). Ngoài khả năng sinh axit hữu cơ, vi khuẩn lactic còn sinh ra nhiều chất có tác dụng kháng khuẩn như: acetaldehit, cacbondioxit, hydrogen peroxit, polisaccarit, bacteriocin... [1, 12]. Do vậy, rất nhiều loài vi khuẩn lactic được sử dụng trong lên men sữa chua, rau quả, bảo quản thực phẩm và làm lợi khuẩn (probiotic). Tìm kiếm các vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme β-galactosidase nhằm hướng tới mục tiêu sử dụng vi khuẩn này trong chế biến sữa cho cộng đồng người thiểu năng chuyển hóa lactose là yêu cầu thực tiễn của ngành công nghiệp chế biến sữa.

Dân gian ta từ lâu đã biết đến sáp ong với vai trò điều trị các bệnh như viêm loát dạ dày và đường ruột. Sáp ong còn được coi như một chất kháng khuẩn, kháng nấm tự nhiên, điều hòa hệ miễn dịch, giảm cholesterol trong máu và giảm đau.Trong bài báo này, chúng tôi báo cáo các kết quả phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh β-galactosidase từ nguồn cơ chất tự nhiên ban đầu là sáp ong, nhằm tìm kiếm các chủng vi khuẩn lactic có giá trị sử dụng trong chế biến thực phẩm.



2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Vi sinh vật, các hóa chất và môi trường


- Vi khuẩn lactic được phân lập từ các mẫu sáp ong nuôi lấy mật hoặc tự nhiên trên rừng; thu từ các địa phương khác nhau ở miền bắc Việt Nam.

- Các chủng VSV kiểm định gồm: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Lactobacillus plantarum.

- Hóa chất và môi trường được mua của Trung Quốc, Việt Nam, đạt tiêu chuẩn môi trường vi sinh. Môi trường MRS (Difco), X-gal và ONPG (Sigma) đạt tiêu chuẩn phân tích.

Phương pháp nghiên cứu


Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic

Phân lập theo phương pháp pha loãng cấp số mũ của Pasteur và trải VSV trên môi trường MRS thạch đĩa có bổ sung 1% CaCO3. Khuẩn lạc vi khuẩn sinh acid với các vòng phân giải CaCO3 xung quoanh được cấy truyền trên môi trường MRS để tiếp tục nghiên cứu.



Đánh giá khả năng sinh acid lactic của các chủng vi khuẩn lactic

Khả năng sinh acid của các chủng vi khuẩn lactic khi nuôi trong môi trường MRS dịch thể ở các điều kiện thí nghiệm khác nhau được xác định bằng sự giảm pH của dịch nuôi cấy so với pH ban đầu của môi trường. Độ pH được xác định bằng máy đo pH (pH mettle delta 320)]. Acid tổng số trong môi trường dịch thể được chuẩn độ bằng dung dịch 0,1 M NaOH với chất chỉ thị là phenolphthalein.



Phát hiện hoạt tính catalase [12]

Nhỏ dung dịch H2O2 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên cứu đã được nuôi ở 30ºC trong 24 giờ trên môi trường MRS thạch đĩa. Nếu thấy hiện tượng sủi bọt thì chủng đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +), nếu không sủi bọt thì chủng đó không có hoạt tính catalase (catalase -).



Phát hiện khả năng sinh khí từ glucose [2. 12]

Chủng nghiên cứu được nuôi trong các ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS dịch thể, bên trong có đặt sẵn ống Durham chứa đầy môi trường MRS dịch thể, các ống nghiệm được nút chặt bằng nút cao su. Sau 48 giờ nuôi cấy, nếu chủng đó sinh khí khi phân giải glucose thì khí sẽ đẩy dịch trong ống Durham ra ngoài và tạo thành một khoảng trống chứa khí trong ống Durham.



Xác định hoạt tính enzyme β- galactosidase bằng chỉ thị X-Gal [5]

Sự có mặt của enzyme -galactosidase được xác định dựa trên nguyên tắc sau: -galactosidase xúc tác thuỷ phân X-Gal hình thành nên kết tủa màu xanh da trời. Vi khuẩn dương tính với enzyme này tạo khuẩn lạc màu xanh khi nuôi cấy với sự có mặt của chỉ thị X-Gal trong môi trường nuôi cấy.

X-Gal được hoà tan trong dimethyl sulphoxide ở nồng độ 20 g/μl. Dung dịch gốc này phải được bảo quản trong tối ở nhiệt độ -20ºC. Môi trường MRS thạch đĩa ( bổ sung 2 gam glucose/lít) được hấp vô trùng, để tủ ấm 300C qua đêm, sau đó gạt đều 40 l chỉ thị X-Gal trên bề mặt môi trường MRS thạch đĩa. Cấy chấm điểm các chủng LAB phân lập được trên đĩa thạch có chỉ thị X-Gal. Sau 24 giờ nuôi cấy ở 300C, các chủng LAB tạo khuẩn lạc có màu xanh trên đĩa chỉ thị là các chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme -galactosidase.

Xác đinh hoạt độ enzyme -galactosidase trên cơ chất ONPG (o-nitrophenyl--D-galactopyranoside)

Hoạt tính của enzyme -galactosidase được xác định bằng phương pháp Mahoney và Whiteker [7,13]. Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ ONP (0 đến 0,9 mM) trong dung dịch và giá trị A420. Một đơn vị hoạt tính (IU) được quy định là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1μM ONP trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm.



3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ sáp ong

Sáp ong là phần vỏ của tổ ong, thường dính cả mật ong nên có hàm lượng cao, tính kháng khuẩn mạnh. Trong 8 lần thu mẫu và phân lập (Bảng 1) trên môi trường MRS có bổ sung CaCO3, chúng tôi đã thu được 61 chủng vi khuẩn lactic được ký hiệu từ LT1 đến LT61.



Bảng 1. Kết quả phân lập vi khuẩn lactic

STT

Ký hiệu mẫu

Loại sáp ong

Thời gian thu mẫu

Địa điểm thu mẫu

Số chủng vi khuẩn lactic phân lập được

1

SO1

Ong nuôi lấy mật

21-06-2013

Ngọc Thanh- Vĩnh Phúc

3 (kí hiệu LT1 đến LT3)

2

SO2

Ong nuôi lấy mật trong rừng Điện Biên

02-07-2013

Điện Biên- Điện Biên

5 (kí hiệu LT4 đến LT8)

3

SO3

Ong ruồi tự nhiên

02-07-2013

Điện Biên- Điện Biên

4 (kí hiệu LT9 đến LT 12)

4

SO4

Ong mật trên rừng

18-07-2013

Tam Đảo- Vĩnh Phúc

2 (kí hiệu LT 13 đến LT14)

5

SO5

Ong nuôi lấy mật

17-08-2013

Xuân Trường- Nam Định

10 (kí hiệu LT15 đến LT24)

6

SO6

Ong nuôi lấy mật

21-09-2013

Hải Hậu- Nam Định

5 (kí hiệu LT25 đến LT29)

7

SO7

Ong nuôi lấy mật, nuôi trong rừng

26-10-2013

Lương Sơn- Hòa Bình

13 (kí hiệu LT30 đến LT42)

8

SO8

Ong nuôi lấy mật

25-10-2013

Từ Hồ- Hưng Yên

19 ( kí hiệu LT43 đến LT61)

Tổng













61

Trong số 61 chủng vi khuẩn lactic phân lập được, có 13 chủng (21,31%) có tế bào hình que ngắn hoặc dài xếp thành chuỗi hoặc theo cặp; 48 chủng (78,69%) có tế bào hình cầu với các kích thước khác nhau. Các chủng này đều là vi khuẩn Gram (+), có khả năng sinh acid. Khả năng sinh acid của chúng rất khác nhau, chỉ có 32 chủng có khả năng làm giảm pH môi trường ban đầu từ 7,0 xuống dưới 5,0. Trong số đó, chỉ có 6 chủng (LT36, LT37, LT11, LT43, LT45, LT60) sinh axit tổng số lớn hơn 0,04 g/ml. Điều đó chứng tỏ phần lớn các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ sáp ong là các vi khuẩn lac tic lên men dị hình.

3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh β-galactosidase

Nuôi cấy các chủng vi khuẩn lactic phân lập được trên môi trường có bổ sung chất chỉ thị X-Gal, chúng tôi tuyển chọn được 12 chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme β- galactosidase làm chuyển mầu chất chỉ thị xang mầu xanh (LT27, LT28, LT32, LT45, LT48, LT10, LT15, LT24, LT12, LT13, LT14, LT31), chiếm 19,67% tổng số các chủng vi khuẩn lactic đã phân lập được. Khi nuôi trên môi trường có chất chỉ thị X-Gal, một số chủng có khuẩn lạc chuyển mầu xanh trong thời gian hình thành khuẩn lạc rất ngắn (sau 6- 8 giờ nuôi cấy); một số chủng lại có khuẩn lạc chuyển mầu xanh chậm hơn (sau 24 giờ nuôi cấy).

Căn cứ vào thời gian xuất hiện màu xanh của khuẩn lạc, độ đậm nhạt của mầu xanh khuẩn lạc, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ enzyme -galactosidase của 6 chủng LT10, LT24, LT12, LT13, LT14, LT31 trên cơ chất ONPG. Kết quả thu được ghi ở bảng 2.

Bảng 2. Hoạt tính β-galactosidase của một số chủng vi khuẩn lac tic được tuyển chọn


Tên chủng

IU/ml

LT10

0,04

LT12

0,26

LT13

0,13

LT14

0,13

LT31

0,23

LT24

0,08

Trong số 6 chủng trên, chủng vi khuẩn lactic LT12 có hoạt tính enzyme β-galactosidase (0,26 IU/ml) mạnh nhất. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chủng này cho các nghiên cứu tiếp theo. Tuy nhiên, hoạt tính của chủng LT12 còn thấp so với một số nghiên cứu của các tác giả khác như Nguyễn Thị Vân Linh và cộng sự (1,534 IU/ml) [1, 10] do đó cần có các nghiên cứu tiếp theo để cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme của chủng này.

3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, sinh lý và sinh hóa của chủng LT12

Đánh giá đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng LT12 sau 24-48 giờ nuôi cấy ở 30ºC trên môi trường MRS dịch thể hoặc trên thạch đĩa. Kết quả thu được ghi lại ở Bảng 3 và Hình 1. Chủng LT2 sinh khí khi lên men glucose, do vậy đây là chủng vi khuẩn lên men lactic dị hình.



Bảng 3.3 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng LT12

Các chỉ tiêu của chủng LT12

Đặc điểm

  1. Tế bào

Hình dạng

Hình que, thành cặp hoặc đơn lẻ

Nhuộm Gram

G+

  1. Khuẩn lạc

Hình dạng

Tròn, lồi, trơn nhẵn

Màu sắc

Trắng sữa

Kích thước khuẩn lạc, sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường MRS

Đường kính khuẩn lạc (d): 1-1,5mm

  1. Sinh bào tử

-

  1. Hoạt tính catalase

-

  1. Khả năng sinh khí từ glucose

+

  1. Phổ ức chế với các VSV kiểm định

Bacillus subtilis

+

Escherichia coli

+

Salmonella typhimurium

+

Lactobacillus plantarum

-

Chú thích: - : không + : có



Hình 1. Hình thái khuẩn lạc (a) và tế bào dưới kính hiển vi với độ phân giải 1:1000 (b)

3.4. Vị trí của enzyme β-galactosidase do chủng LT12 sinh tổng hợp

Kết quả kiểm tra vị trí sinh tổng hợp của β- galactosidase trong tế bào vi khuẩn LT2 cho thấy: Enzyme β- galactosidase của chủng LT12 có mặt chủ yếu ở nội bào (Bảng 4), không có mặt ở xoang chu chất và dịch ngoại bào. Kết quả này phù hợp với các báo cáo của các tác giả khác về vị trí enzyme β- galactosidase trong tế bào vi khuẩn lactic [8, 10, 11]



Bảng 4. Vị trí của enzyme β- galactosidase trong tế bào chủng LT12

Vị trí enzyme

Hoạt tính tổng số (IU/ml)

Dịch ngoại bào

0%

Xoang chu chất

0%

Nội bào

67.96%

Thành, màng tế bào

32.04%

3.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme β- galactosidase của chủng LT12

pH ban đầu là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme β- galactosidase của các vi sinh vật nói chung và vi khuẩn lactic nói riêng. Các số liệu thu được ở Bảng 5 cho thấy: Chủng LT12 có khả năng sinh trưởng tốt trong dải pH rộng từ 3,5 đến 8. Ở dải pH từ 5 đến 8, chủng LT12 sinh acid mạnh (pH ban đầu đến pH cuối giảm từ 3,33 đến 1,02 đơn vị). Ở pH 7, chủng LT12 sinh enzyme β- galactosidase với hoạt tính cao nhất (0,47 IU/ml), sau đó giảm dần. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hải Yến [9] và Nguyễn Thị Vân Linh [10] khi nghiên cứu thu nhận và tinh sạch -galactosidase từ Lactobacillus acodophilus đều thu được hoạt tính của enzyme cao nhất ở pH 7-7,5. Shaikh và cộng sự [6] cũng thu được hoạt tính enzyme-galactosidase từ nấm Rhizomucor sp. cao nhất ở pH 7.



Bảng 5. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme β- galactosidase của chủng LT12

pH ban đầu

pH cuối

Mật độ quang

(λ= 620nm)

Số lượng tế bào (x109)

Hoạt tính tổng số IU/ml

3,5

3,41

3,071 ±0,003

1,86

0,02 ±0,008

4

3,67

4,931 ±0,013

2,98

0,12 ±0,017

4,5

3,87

5,603 ±0,007

3,38

0,44 ±0,019

5

3,98

5,533 ±0,002

3,34

0,25 ±0,003

5,5

4,1

4,614 ±0,011

2,79

0,33 ±0,002

6

4,09

3,915 ±0,004

2,36

0,15 ±0,019

6,5

4,27

4,262 ±0,009

2,57

0,33 ±0,006

7

4,35

3,633 ±0,012

2,19

0,47 ±0,017

7,5

4,48

3,442 ±0,006

2,09

0,38 ±0,018

8

4,67

3,572 ±0,017

2,16

0,37 ±0,020

Каталог: app -> webroot -> files -> hoithao
hoithao -> Kandelia obovata Sheue, Liu & Yong
hoithao -> Đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng (Meloidogyne spp.) của dịch chiết từ cây mầm súp lơ xanh
hoithao -> KẾt quả ĐIỀu tra bưỚC ĐẦu về nguồn lợi cá VÙng ven biển huyện cẩm xuyêN, TỈnh hà TĨNH
hoithao -> Chi trâm hoàng – kayea wall. (HỌ BỨA – clusiaceae lindl.) Ở việt nam
hoithao -> Nguyễn Đăng Hội1, Kuznetsov A. N. 1, Kuznetsova S. P. 1, Lê Thị Nguyệt2
hoithao -> Vũ Văn Liên Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, vast
hoithao -> Xác đỊnh và thiẾt kẾ khung biẾn nẠp nhẰm loẠi bỎ gen translin Ở nẤm Mucor circinelloides
hoithao -> Nghiên cứU Ảnh hưỞng của chế phẩm VI sinh và phân hữu cơ VI sinh đẾn một số chỉ tiêu sinh lí – HÓa sinh và SỰ TÍch lũy kim loại chì (Pb) CỦa câY ĐẬu bắP
hoithao -> PHÂn tích tính đa dạng và thành lập bảN ĐỒ thảm thực vật khu vực trạM Đa dạng sinh học mê linh, VĨnh phúC
hoithao -> Genus pycnarrhena miers ex Hook f. & Thomson,

tải về 225.22 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
  1   2




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương