Phần chuyển gen ở thực vật bậc cao chương MỞ ĐẦU


Triển vọng và hướng phát triển



tải về 297.25 Kb.
trang7/7
Chuyển đổi dữ liệu30.08.2016
Kích297.25 Kb.
#29507
1   2   3   4   5   6   7

3.3. Triển vọng và hướng phát triển


Hiện nay ở nước ta lĩnh vực nghiên cứu tạo sinh vật biến đổi gen, nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng (GM) đang được tiếp cận, đầu tư và triển khai nghiên cứu, ứng dụng với sự chú trọng đặc biệt. Nhiều gen quý có giá trị ứng dụng như năng suất, chất lượng, khả năng chống chịu đã được phân lập và nghiên cứu nhằm chuyển vào cây trồng để tạo nên những giống lý tưởng. Nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau như phương pháp bắn gen, phương pháp sử dụng vi khuẩn. A.tumefaciens... đã được áp dụng thành công trên hàng loạt cây trồng quan trọng như lúa, cà chua, cà tím, đậu xanh, cà-phê, thuốc lá, khoai lang. Những vấn đề thiết kế vector cũng như hoàn thiện các quy trình tái sinh cây khởi đầu cho nghiên cứu chuyển gen cũng nhận được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học.

Các nhà khoa học đã tiến hành thu nhập và phân lập được nhiều nguồn gen quý có giá trị nông nghiệp như gen chịu hạn, lạnh ở lúa;  gen cry, gen mã hóa protein bất hoạt hóa ở cây mướp đắng và gen mã hóa của cây đậu cô ve có hoạt tính diệt côn trùng; gen kháng bọ, hà khoai lang của vi khuẩn Bt; gen mã hóa protein vỏ của virus gây bệnh đốm vòng ở cây đu đủ... Hiện các nhà sinh học Việt Nam đang tiếp tục nghiên cứu để chuyển gen vào cây hoa, cây bông và cây lâm nghiệp, nhằm nâng cao sức chống chịu với sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh bất lợi.

 

Những nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn và chịu mặn ở cây lúa bằng công nghệ GM, chuyển gen kháng virus đốm vòng vào cây đu đủ, chuyển gen chịu hạn vào cây bông... cũng đang được triển khai hiệu quả với một số loài cây GM.



 

Nhà nước ta đã xác định công nghệ sinh học là một ngành khoa học quan trọng. Từ năm 1990, Chương trình công nghệ sinh học quốc gia đã được cấp kinh phí cho các dự án nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt trong cải tiến giống cây trồng. Từ năm  2001, Chính phủ đã đầu tư nhiều dự án, đề tài nghiên cứu GM liên quan đến nhiều cây trồng quan trọng của Việt Nam. Một số phòng thí nghiệm công nghệ sinh học đã và đang được Nhà nước đầu tư trang thiết bị hiện đại và triển khai các kỹ thuật cơ bản của công nghệ gen như phân lập và xác định trình tự gen, thiết kế và biến nạp gen vào tế bào vi sinh vật, động vật, nghiên cứu biểu hiện gen... Nhờ các biện pháp và chính sách khuyến khích, đầu tư hiệu quả đó, công nghệ sinh học ở nước ta vài năm gần đây đã có những bước phát triển mạnh mẽ.

Công nghệ di truyền thực vật là một bước ngoặt quyết định. Một số cây trồng quan trọng đã được biến nạp gen; một vài vấn đề kỹ thuật vẫn đang còn tồn tại, nhưng chúng đang dần dần được giải quyết. Để có kết quả cần phải thay đổi dần dần sang một phạm vi khác, như là phát hiện và tạo dòng các gen mang các tính trạng đa gen (multigenic traits). Một điều không thể quên là vấn đề nhận thức của xã hội và dự báo nguy cơ tác động xấu đến môi trường do các sản phẩm có nguồn gốc từ công nghệ tái tổ hợp DNA mang lại.

Cây biến nạp gen đầu tiên thu được vào năm 1983. Điều này cho phép nhận xét rằng mới chỉ hơn hai thập niên, các công cụ của công nghệ DNA tái tổ hợp và sinh học tế bào đã giúp ích rất nhiều cho các nhà tạo giống thực vật. Việc lựa chọn phương thức sử dụng các cây trồng thu được từ công nghệ DNA tái tổ hợp có thể cung cấp thêm nguồn tài nguyên mới cho công nghiệp và người tiêu dùng, như vậy có thể mở rộng cơ sở kinh tế ở cả các nước công nghiệp lẫn các nước đang phát triển.


3.4. Thực hành chuyển gen vào cây thuốc lá bằng Agrobacterium tumefaciens

3.4.1. Dụng cụ


- Bình tam giác (250 ml), ống nghiệm có nắp vặn

- Giấy thấm vô trùng

- Forceps, kéo, dao mổ

- Que cấy vi sinh

- Đĩa petri (plastic và thủy tinh) vô trùng

- Giấy parafilm

- Giấy nhôm

- Tube eppendorf (1,5-2 ml)

- Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette

3.4.2. Thiết bị


- Nồi khử trùng

- Tủ sấy

- Laminar

- Tủ lạnh

- Microwave

- Cân phân tích 10-4g

- Cân kỹ thuật 10-2g

- Máy cất nước 2 lần

- Máy ly tâm lạnh (14000 rpm) cho tube 1,5-2 ml

3.4.3. Hóa chất


- Môi trường cơ bản MS

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB

- Các loại kháng sinh: kanamycin, rifampicin và cefotaxim

- Agar


- MgSO4 10mM

- Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: NAA và BAP

- Cồn 90%

- Nước cất vô trùng


3.4.4. Phương pháp tiến hành

3.4.4.1. Nguyên liệu


- E. coli chủng TOP 10 có mang pRK 2013 (helper plasmid)

- E. coli chủng TOP 10 có mang vector pBI 121+ insert DNA (gen ngoại lai mang tính trạng mong muốn)

- Agrobacterium tumenfaciens chủng LBA 4404.

- Cây thuốc lá in vitro.


3.4.4.2. Chuẩn bị môi trường


*Môi trường LB

- Bacto-tryptone 3 g

- Yeast-Extract 1,5 g

- NaCl 3 g

- Nước cất đến đủ 300mL.

* Môi trường LB đặc

Môi trường LB bổ sung 1,5 % agar/100 mL.

* Môi trường LB-R

Môi trường LB bổ sung 100 µg/mL rifampicin.

* Môi trường LB-K

Môi trường LB bổ sung 50 µg/mL kanamycin.

* Môi trường LB-RK

Môi trường LB bổ sung 100 µg/mL rifampicin và 50 µg/mL kanamycin.

* Môi trường MSO

- MS đầy đủ

- Agar 0,8 %

- Saccharose 3 %

- pHmôi trường ~ 5,8

* Môi trường nuôi cấy (MS 104)

- MS đầy đủ

- Agar 0,8 %

- Saccharose 3 %

- BAP 2 mg/mL

- NAA 0,2 mg/mL

- pHmôi trường ~ 5,8

* Môi trường chọn lọc (MS SEL)

- MS đầy đủ

- Agar 0,8 %

- Saccharose 3 %

- BAP 2 mg/mL

- NAA 0,2 mg/mL

- Kanamycin 1,5 mL

- Cefotaxim 2 mL

- pHmôi trường ~ 5,8

* Môi trường tạo rễ (MSR)

- MS đầy đủ

- Agar 0,8 %

- Saccharose 3 %

- Kanamyin 1,5 mL

- Cefotaxim 2 mL

- pHmôi trường ~ 5,8

Môi trường có bổ sung cefotaxim cần được bảo quản trong điều kiện không có ánh sáng. Chất kháng sinh được bổ sung sau khi đã khử trùng môi trường (để nhiệt độ môi trường hạ xuống khoảng 55-60oC) ở điều kiện vô trùng của laminar.


3.4.5. Tiến hành

3.4.5.1. Triparental mating (giao phối bộ ba)


* Nuôi cấy vi khuẩn

Các môi trường LB lỏng được chuẩn bị trong các ống nghiệm có nắp vặn, khử trùng để tiến hành nuôi cấy các vi khuẩn. Các bước như sau:



  • Nuôi A. tumenfaciens trong môi trường LB-R trong tổi, ở 28oC, thời gian 48 giờ (nuôi trước khi tiến hành triparental mating 2 ngày).

  • Nuôi E. coli có mang plasmid helper (pRK 2013) và E. coli có mang vector pBI 121 + insert DNA trong môi trường LB-K (nuôi trước khi tiến hành lai bộ ba 1 ngày).

* Nuôi cấy chung 3 loại vi khuẩn

Các bước tiến hành:



  • Lấy mỗi ống nghiệm nuôi các loại vi khuẩn 1 mL, ly tâm tốc độ khoảng 10.000 rpm, trong 5 giây.

  • Loại bỏ thể nổi, thêm 1 mL môi trường LB, lắc nhẹ để trộn (để loại bỏ chất kháng sinh).

  • Lập lại 2 bước trên 2 lần. Thêm 300 µl môi trường LB.

  • 3 loại vi khuẩn trên được cấy lên mặt đĩa chứa môi trường LB đặc (đã được chuẩn bị trước các đĩa petri chứa môi trường LB bổ sung 1,5 % agar) không bổ sung chất kháng sinh, mỗi loại vi khuẩn lấy 100 µl. Dàn đều trên bề mặt môi trường đến khi khô hoàn toàn.

Nuôi cấy từ 1-2 ngày tại 26-28oC, đến khi các “thảm” vi khuẩn được hình thành.

* Chọn lọc vi khuẩn nuôi cấy bằng cách trộn 3 loại vi khuẩn, sử dụng chất kháng sinh

Các bước tiến hành:



  • Lấy 5 mL MgSO4 10 mM cho lên đĩa petri mới, lấy một ít vi khuẩn trong “thảm” đã nuôi cấy ở trên cho vào để có một dịch lỏng.

  • Chuẩn bị 4 tube eppendorf vô trùng, cho vào mỗi tube 900 µL MgSO4 10 mM.

  • Tiến hành pha loãng vi khuẩn thành các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4.

  • Lấy 100 µl mỗi loại vi khuẩn đã pha loãng dàn đều lên 5 đĩa petri chứa môi trường LB-RK bổ sung 2 % agar.

  • Nuôi trong 2-3 ngày tại 26-28oC trong điều kiện tối để phát triển khuẩn lạc.

  • Nuôi cấy 1 khuẩn lạc trong 5 mL môi trường LB-RK tại 26-28oC từ 1-2 ngày để thu được sinh khối E. coli, xác định Agrobacterium đã được chuyển gen (nếu chưa sử dụng ngay, thêm vào 15% glycerin và bảo quản ở -70oC).


3.4.5.2. Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium


Các bước tiến hành:

  • Lấy 1 khuẩn lạc ở trên cấy chuyển vào 5 mL môi trường LB-K lỏng, nuôi cấy lắc ở điều kiện tối, nhiệt độ từ 27-28oC trong 2-3 ngày.

  • Thu tất cả các tế bào đã nuôi cấy ở trên bằng cách cho môi trường LB-K lỏng chứa khuẩn lạc vào tube eppendorf, ly tâm từ 0,5-1 phút, tốc độ 12.000 rpm. Lặp lại nhiều lần.

  • Loại bỏ môi trường LB ở phía trên, các tế bào thu được hòa tan trong 1 mL môi trường MSO lỏng.

  • Chuẩn bị 20 mL môi trường MSO trên đĩa petri.

  • Lá thuốc lá in vitro cắt thành các mảnh lá có kích thước ước chừng khoảng 0,5-0,7 cm  0,5-0,7 cm (loại bỏ các gân lá), chuyển lên đĩa petri chứa môi trường MSO.

  • Tế bào Agrobacterium hòa trong 1 mL môi trường MSO được cấy chuyển sang môi trường MSO có chứa các mảnh lá, lắc nhẹ bằng tay và ủ trong 10 phút.

  • Sau khi đồng nuôi cấy, làm khô các mảnh lá bằng cách chuyển chúng lên giấy lọc vô trùng trong 0,5-1 phút. Các mảnh lá đó được nuôi trên môi trường nuôi cấy (MS 104) trong 2 ngày trong tối.

  • Các mảnh lá sau đó được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc (MS SEL) và nuôi cấy trong 3 tuần để tái sinh chồi ở điều kiện chiếu sáng.

  • Các chồi tạo thành được cấy chuyển lên môi trường MSR để tạo rễ. Các cây hoàn chỉnh được chuyển sang nuôi cấy trong các bình. Các cây này là các cây đã được tiến hành chuyển gen. Để biết việc chuyển gen có thành công hay không cần phải tiến hành các thí nghiệm kiểm tra (tách chiết DNA của Agrobacterium, chạy PCR với cặp primer đặc hiệu cho insert DNA và điện di sản phẩm PCR trên agarose gel 1 %).


TÀI LIỆU THAM KHẢO


Tài liệu tiếng việt:

  1. Đái Duy Ban, 1998, Công nghệ ADN trong điều trị gen và các bệnh hiểm nghèo, Nhà xuất bản y học

  2. Đái Duy Ban, 2004, Công nghệ gen, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật

  3. Nguyễn Bá, 2006, Hình thái học thực vật, Nhà xuất bản Giáo dục.

  4. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1996, Sinh học phân tử, Nhà xuất bản giáo dục

  5. Nguyễn Đình Huyên, 1998, Sinh học phân tử ADN, Nhà xuất bản khoa học kĩ thuật

  6. Lê Văn Hoàng, 2004,Các quá trình và thiết bị Công nghệ sinh học trong Công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội

  7. Phạm Thành Hổ, 2000, Di truyền học, Nhà xuất bản giáo dục

  8. Nguyễn Như Hiền.2002. Di truyền và Công nghệ tế bào xoma. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật

  9. Võ Thị Hương Lan, 2002, Sinh học phân tử, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội

  10. Nguyễn Thị Lang, 2002, Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học, Nhà xuất bản nông nghiệp

  11. Lê Đình Lương, 1994, Cơ sở di truyền học, Nhà xuất bản giáo dục

  12. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên,2002, Công nghệ tế bào, Nhà xuất bản ĐHQG TP HCM

  13. Trần Văn Minh, 1999, Công nghệ tế bào thực vật, Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh- Trường ĐH Nông Lâm.

  14. Phan Cử Nhân, 1998, Sinh học đại cương, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội

  15. Nguyễn Đức Thành, 2000, Nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu và ứng dụng, Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội

  16. Lê Ngọc Tú, Đỗ Ngọc Liên, Đặng Thị Thu, 2002, Tế bào và các quá trình sinh học, Nhà xuất bản khoa học kĩ thuật Hà Nội

  17. Khuất Hữu Thanh, 2003, Cơ sở di truyền phân tử và kĩ thuật gen, Nhà xuất bản khoa học kĩ thuật

  18. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tố kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm, 2003, Công nghệ Enzym. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật

  19. Quyền Đình Thi. 2005, Những kỹ thuật cơ bản trong phân tích DNA, Nhà xuất Bản Khoa học và Kỹ thuật

  20. Trần Thị Xô, Nguyễn Thị Lan, 2004, Cơ sở di truyền và công nghệ gen, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật

  21. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp,2005, Công Nghệ Sinh Học, Tập Hai Công Nghệ Sinh Học Tế Bào, Nhà xuất bản Giáo Dục,.

  22. Vũ Văn Vụ, Vũ Thành Tâm, Hoàng Minh Tấn, 2001, Sinh Lý Học Thực Vật, Nhà xuất bản Giáo Dục

  23. Đỗ Năng Vịnh. Công nghệ sinh học cây trồng,2002, Nhà xuất bản Nông Nghiệp

  24. Nguyễn Văn Uyển,1995-1996, Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật. Tập 1 (1995), Tập 2 (1996), Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh

Tài liệu tiếng anh:





  1. Ammirato PV, Evans DA, Sharp WR and Bajaj YPS. 1990. Handbook of plant cell culture. Vol.5, McGraw-Hill Publishing Company.

  2. Chrispeels MJ and Sadava DE., 2003, Plants, genes, and crop biotechnology. 2nd. Jones and Bartlett Publishers, Sudbury, Massachusetts.

  3. Dodds J.H và Robert L.W., 1999, Experiment in plant tissue culture. Cambridge University Press,

  4. Gamborg OL. Kumar AS, Hanning GE and Nabors MW. ,1989, Tissue culture and biotechnology applied to stress tolerance in plants. In: Proceedings of the International Confrence on in vitro Selection and Propagation of Economic Plants. Univ. of Peshawar, Pakistan.

  5. Hartmann HT, Kester DE, Davies FT, 993, Plant propagation: Principles and Practices. 5th Edition. Pretice-Hall of India Private Limited, New Delhi.

  6. Heywood V.H., 1985. Flowering plants of the word, Croom Helm, London &Sydney.

  7. James C. "Global Review of Commercializied Transgenic Crops 2001", ISAAA Briefs N'24

  8. Jain SM, Gupta PK, Newton RJ, 1994, Somatic embryogenesis in woody plants. Vol 3. Forestry Sciences 44, Kluwer Academic Publishers.

  9. Razan MK ., 1994, An introduction to plant tissue culture. Oxford & IBH Publishing Co. Pvt. Ltd. New Delhi.

  10. Russell GE., 1988, Biotechnology of higher plants. Intercept Ltd. Wimborne, Dorset, England.

  11. Ting I.P., 1985. Plant physiology. University of California.

  12. Thomas E. Barman. Enzyme handbook. Supplement I Springer - Verlag Berlin Heidelberg NewYork, 1974

  13. Trigiano R.N và Gray D.J., 1999, Plant tissue culture concept and laboratory exercises. CRC Press.Florida, America,.

  14. Trigiano RN and Gray DJ., 2000, Plant tissue culture concepts and laboratory exercises. CRC Press, New York.

  15. Razan MK. 1994. An introduction to plant tissue culture. Oxford & IBH Publishing Co. Pvt. Ltd. New Delhi.

Каталог: Data -> News -> 388 -> files
News -> Nghị quyết của quốc hội số 23/2003/QH11 ngàY 26 tháng 11 NĂM 2003 VỀ nhà ĐẤT DO nhà NƯỚC ĐÃ quản lý, BỐ trí SỬ DỤng trong quá trình thực hiện các chính sáCH
News -> QuyếT ĐỊnh về việc ban hành Quy định về trang phục đối với Sinh viên Trường Đại học Lạc Hồng
News -> BỘ chính trị ĐẢng cộng sản việt nam
files -> Phần nuôi cấy tế BÀo chương giới thiệu chung và LỊch sử phát triểN
files -> Chương MỘt số phưƠng pháp canh tác hiệN ĐẠI 1 Thủy canh
files -> Chương nuôi cấy tế BÀo và chọn dòng tế BÀo nuôi cấy tế bào đơn
files -> Chương những khái niệm cơ BẢn học thuyết tế bào
files -> Chương thu nhận và nuôi cấy phôi in vitro phôi soma

tải về 297.25 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
1   2   3   4   5   6   7




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương