3.2. Chuyển gen ở các cây trồng chính 3.2.1. Cây ngô
Cây ngô biến nạp gen đầu tiên tái sinh từ protoplast được biến nạp bằng xung điện đã bất thụ (Rhodes và cs 1988). Có thể dùng phôi ngô trong nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh các cây hữu thụ mang gen biến nạp, sử dụng phương pháp bắn gen và chọn lọc bằng chất diệt cỏ “bialaphos” đã cho kết quả là mô callus phát sinh các phôi được biến nạp gen. Các cây biến nạp gen hữu thụ đã được tái sinh, ổn định di truyền và biểu hiện gen bar (kháng chất diệt cỏ glufosinate không chọn lọc) cùng với hoạt tính chức năng của enzyme phosphinothricin acetyltransferase quan sát được trong những thế hệ sau. Hiện nay, biến nạp gen ở ngô bằng phương pháp bắn gen được sử dụng rộng rãi. Gần đây, các kết quả biến nạp gen gián tiếp ở ngô nhờ Agrobacterium cũng đã được thông báo. Các thể biến nạp gen của dòng ngô lai gần (inbredline) A188 đã được tái sinh sau khi nuôi cấy chung (cocultivation) giữa vector “super-binary” với phôi non. Tần số được thông báo ở dòng A188 là khoảng 5-30%. Các thể lai thế hệ thứ nhất giữa dòng A188 và 5 dòng lai gần khác được biến nạp với tần số khoảng 0,4-5,3% (tính theo số cây biến nạp gen độc lập/phôi).
Bảng 3.1. Các cây trồng chính đã được biến nạp gen
Stt
|
Loài
|
Phương pháp
biến nạp gen
|
Thử nghiệm trên đồng ruộng
|
1
|
Chuối
|
Bắn gen/Agrobacterium
|
-
|
2
|
Luá mạch
|
Bắn gen
|
Kháng vi rus
|
3
|
Đậu tây
|
Bắn gen
|
-
|
4
|
Canola
|
Bắn gen/Agrobacterium
|
Chống chịu chất diệt cỏ, điều khiển sự thụ phấn
|
5
|
Sắn
|
Bắn gen/Agrobacterium
|
-
|
6
|
Ngô
|
Bắn gen/Agrobacterium
|
Kháng côn trùng, chống chịu chất diệt cỏ
|
7
|
Bông
|
Bắn gen/Agrobacterium
|
Kháng côn trùng, chống chịu chất diệt cỏ
|
8
|
Đu đủ
|
Bắn gen/Agrobacterium
|
Kháng virus
|
9
|
Đậu phụng
|
Bắn gen/Agrobacterium
|
Kháng virus
|
10
|
Bạch dương
|
Bắn gen/Agrobacterium
|
Chống chịu chất diệt cỏ
|
11
|
Khoai tây
|
Agrobacterium
|
Kháng côn trùng, kháng virus, chống chịu chất diệt cỏ
|
12
|
Lúa
|
Bắn gen/Agrobacterium
|
Chống chịu chất diệt cỏ
|
13
|
Đậu tương
|
Bắn gen/Agrobacterium
|
Chống chịu chất diệt cỏ
|
14
|
Bí
|
Bắn gen/Agrobacterium
|
Kháng virus
|
15
|
Củ cải đường
|
Agrobacterium
|
Chống chịu chất diệt cỏ
|
16
|
Mía
|
Bắn gen
|
-
|
17
|
Hướng dương
|
Bắn gen
|
-
|
18
|
Cà chua
|
Agrobacterium
|
Quả chín muộn, kháng virus
|
19
|
Lúa mì
|
Bắn gen
|
-
|
3 .2.2. Cây lúa
Phương pháp bắn gen cho phép thực hiện biến nạp gen hiệu quả ở lúa trong các kiểu gen độc lập, và hiện nay hơn 40 giống đã được biến nạp gen thành công. Mẫu vật sử dụng là phôi non và các callus có nguồn gốc từ hạt trưởng thành. Hygromycin B là marker chọn lọc thường được dùng cho lúa. Tần số biến nạp có thể cao tới 50% (tính theo số cây biến nạp gen có nguồn gốc độc lập/số mẫu được bắn gen).
Hình 3.1. Chọn lọc giống lúa chịu hạn bằng cách chuyển gen chịu hạn cho lúa
Gần đây, kỹ thuật biến nạp gen ở lúa thông qua Agrobacterium cũng đã có những cải tiến quan trọng có hiệu quả tương đương với kỹ thuật bắn gen.
3.2.3. Cây lúa mì
Phương pháp bắn gen cũng được sử dụng để biến nạp gen ở lúa mì. DNA ngoại lai được bắn vào trong các vảy nhỏ (scutellum) của phôi non của hai giống mùa xuân và một giống mùa đông. Các callus chống chịu được chọn lọc bằng phosphinothricin hoặc các nhân tố ức chế trao đổi chất tương tự như basta, bialaphos hoặc glufosinate amonium. Chọn lọc bằng các hợp chất như thế không hiệu quả lắm và kết quả là một số lớn cây thất thoát. Phân tích di truyền và phân tử đã xác nhận sự hợp nhất ổn định của các gen biến nạp. Nói chung, công nghệ di truyền lúa mì vẫn còn tập trung ở một hoặc hai giống đặc trưng có khả năng tái sinh cây nhanh, thích hợp với phương pháp bắn gen.
3.2.4. Cây lúa mạch
Wan và Lemaux (1994), đã tái sinh một số lượng lớn các cây lúa mạch biến nạp gen độc lập, tự thụ phấn. Các phôi hợp tử non, các callus mới hình thành và các phôi có nguồn gốc từ tiểu bào tử hạt phấn đã được dùng để bắn gen với plasmid mang gen bar và gusA đơn độc hoặc phối hợp với plasmid khác mang gen protein vỏ của virus gây bệnh lùn vàng ở lúa mạch. Kiểm tra khả năng nảy mầm của phôi non để phân lập các cây biểu hiện hoạt tính bar bằng môi trường chứa bialaphos, mặc dù đây chưa phải là một chất chỉ thị tốt cho sự có mặt hoặc không của gen.
3.2.5. Cây đậu tương
Kết quả đầu tiên ở đậu tương là phục hồi thành công cây biến nạp gen nhờ Agrobacterium. Phương thức này dựa vào sự phát sinh chồi từ lá mầm của giống Peking chọn lọc cho tính mẫn cảm với Agrobacterium. Các mẫu lá mầm được xâm nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kháng kanamycin và có hoạt tính gusA, hoặc kháng kanamycin và chống chịu glyphosate. Có thể biến nạp gen hiệu quả vào protoplast đậu tương bằng các phương thức thông dụng nhưng rất khó tái sinh được cây.
Để biến nạp gen vào các giống đậu tương khác nhau người ta đã phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản - phương thức tái sinh cây độc lập (dựa trên cơ sở sự tăng sinh của cụm chồi từ vùng chung quanh mô phân sinh của trụ phôi) với sự tăng gia tốc của vi đạn (particle) có phóng điện để phân phối DNA ngoại lai. Hàng trăm cây đậu tương có nguồn gốc độc lập đã thu được và kết quả biến nạp đã cho nhiều phenotype khác nhau. Nói chung, ở các dòng đậu tương biến nạp gen có nhiều bản sao của các gen biến nạp (số bản sao khoảng từ 1-50 nhưng thường thay đổi từ 2-10). Phân tích DNA (southern blot) ở thế hệ sau của các bản sao gen phức cho thấy tất cả các bản sao cùng tách rời, như thế mỗi thể biến nạp sơ cấp chỉ hiện diện một kết quả biến nạp độc lập và có thể sự tái tổ hợp thống nhất đã không xuất hiện thường xuyên.
3.2.6. Cây bông
Phương thức biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens là kỹ thuật đầu tiên được sử dụng để biến nạp gen vào cây bông giống Coker 312 (Umbeck 1987). Cây bông biến nạp gen cũng của giống trên đã được phục hồi sau khi bắn gen vào dịch huyền phù nuôi cấy phát sinh phôi (Finer và McMullen 1990). Hầu hết các giống bông có giá trị kinh tế khác không thể tái sinh cây từ giai đoạn callus. Một số ít các giống đó có thể tái sinh cây nhưng quá trình này thiên về biến dị dòng vô tính.
Chia sẻ với bạn bè của bạn: |
