Phần chuyển gen ở thực vật bậc cao chương MỞ ĐẦU

2.2. 1. Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium

2.2.1.1. Agrobacterium

2.2.1.2. Ti-Plasmid

Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng vào công nghệ gen thực vật ở hai dạng vector cis và trans. Đây là hai dạng vector rất thuận lợi để tái tổ hợp gen ngoại lai và chuyển vào tế bào thực vật. Dạng cis chỉ sử dụng Ti-plasmid và tế bào vật chủ là Agrobacterium tumefaciens mà không có sự tham gia của plasmid và vi khuẩn khác. Vùng T-DNA của Ti-plasmid được thiết kế lại để gắn những gen ngoại lai mong muốn, các phần còn lại của Ti-plasmid vẫn được giữ nguyên. Agrobacterium tumefaciens được dùng làm tế bào vật chủ để nhân lên nhiều bản sao của Ti-plasmid và chuyển gen. Dạng trans hay binary là dạng sử dụng hai hay nhiều loại plasmid và vi khuẩn cùng lúc, ví dụ: vi khuẩn E. coli và Agrobacterium, plasmid trong trường hợp này thích ứng với cả E. coli và Agrobacterium. Trước tiên, plasmid của E. coli chứa đoạn T-DNA được giới hạn bởi bờ phải (right border-RB) và bờ trái (left border-LB) mang gen ngoại lai (gen đích) được thiết kế và nhân lên trong vi khuẩn E. coli. Tiếp đến plasmid mang gen ngoại lai được chuyển nạp vào vi khuẩn Agrobacterium nhờ một helper plasmid (quá trình triparental matting). Vi khuẩn Agrobacterium đã mang sẵn một loại plasmid khác chứa vùng vir (virulence region) có chức năng quan trọng trong quá trình chuyển gen ngoại lai. Sự tồn tại song song hai plasmid này đã tương tác lẫn nhau trong việc chuyển gen vào tế bào thực vật. Như vậy, gen ngoại lai và vùng DNA giúp quá trình chuyển gen (vùng vir) không nằm trên cùng một plasmid nên hệ chuyển gen này được gọi là hệ trans.

2.2.1.3. T-DNA

Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA, được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD, virD2, virC1... Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn.

Khi cây nhiễm A. tumefaciens, do T-DNA nạp vào trong hệ gen của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại “thức ăn”. Nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmid. Cơ chế lây nhiễm của A. rhizogenes đối với cây hai lá mầm cũng tương tự, nhưng trong vùng T-DNA của A. rhizogenes chỉ có gen sản sinh ra auxin, vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm bệnh.

Trên thực tế bệnh cây, Agrobacterium chỉ gây hại ở cây hai lá mầm, vì vậy người ta cho rằng chúng chỉ có thể đưa T-DNA vào hệ gen các cây hai lá mầm. Gần đây, nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn, các cây một lá mầm cũng có thể sản xuất opine và có thể khai thác khả năng biến nạp gen của Agrobacterium vào cây một lá mầm.

2.2.1.4. Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào và mô thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens

Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u (trường hợp A. tumefaciens) hoặc rễ tơ (trường hợp A. rhizogenes). Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn.

Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. tumefaciens phải tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được thực hiện nhờ các gen chvA và chvB. Gen chvB mã hoá một protein liên quan đến hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β-1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA.

Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào genome của cây chủ.

Thực chất chỉ riêng T-DNA của Ti-plasmid được chuyển vào genome tế bào thực vật, mà không còn phần nào khác. Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA. Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, đặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật. Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền. Trước hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir được phosphoryl hoá nhờ tác động của các hợp chất phenol như acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật tổn thương. Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE. Trước đó, khi gen virD được hoạt hoá, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB và LB của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của Ti-plasmid thành các sợi đơn. Đồng thời quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi thẩm xuất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng. Các sợi đơn T-DNA được gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn. Ngay sau đó, sợi T-DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính là sự tiếp hợp (conjugation) giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T-DNA đã được chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng xâm nhập vào genome tế bào thực vật (integration) được ổn định và di truyền như các gen bình thường khác.

2. 2.1.5. Các gen chỉ thị chọn lọc và gen chỉ thị sàng lọc

Các gen chỉ thị chọn lọc chung nhất mã hóa các protein khử độc các nhân tố ức chế trao đổi chất như các kháng sinh hoặc chất diệt cỏ (herbicide). Các gen chỉ thị sàng lọc thường được sử dụng là các gen β-glucuronidase (gusA), luciferase và gần đây hơn là gen mã hóa protein phát huỳnh quang màu xanh lục (green fluorescent) của sứa.

Bằng các phương pháp sinh học phân tử có thể tạo ra các cấu trúc DNA plasmid, trong đó ngoài các gen khởi động (promoter gene), các gen của vi khuẩn Agrobacterium giúp cho DNA plasmid gắn được vào bộ gen thực vật, gen ngoại lai cần chuyển vào... còn có các gen giúp phân lập ra tế bào hoặc mô thí nghiệm. Các gen được lắp ghép vào DNA plasmid với mục đích này được gọi là gen chỉ thị chọn lọc hay gen chỉ thị sàng lọc.

Gen chỉ thị chọn lọc thường dùng nhất là các gen mã hóa cho một số enzyme chỉ có trong vi khuẩn ở điều kiện tự nhiên mà không có trong giới thực vật. Sau khi chuyển gen, nếu thấy enzyme vi khuẩn hoạt động thì có thể suy ra là toàn bộ DNA plasmid đã được gắn vào bộ gen của thực vật và gen ngoại lai mà ta cần chuyển đã trở thành một bộ phận của bộ máy di truyền thực vật.

Các gen chỉ thị thường dùng nhất là các gen gus A (β-glucuronidase), gen npt II (neomycin phosphotransferase), gen lux (luciferase), gen cat (chloramphenicol acetyltransferase), gen nos (nopaline synthase)

Bảng 2.1. Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes) và các gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes)

A. Một số gen chỉ thị chọn lọc
Kí hiệu gen	Enzyme tương ứng	Chất dùng để chọn lọc
npt II	Neomycin phosphotransferase	Kanamycin
hyg	Hygromycin phosphotransferase	Hygromycin
gent	Gentamycin acetyl transferase	Gentamycin
aat	Streptomycin phosphotransferase	Streptomycin
bleo	Enzyme kháng bleomycin	Bleomycin
bar	Phosphinothricin acetyltransferase	Phosphinothricin
bxn	Bromoxynil nitrilase	Bromoxynil
Một số gen chỉ thị sàng lọc
Kí hiệu gen	Enzyme tương ứng	Chất dùng để phát hiện
gus A	β-glucuronidase	X-Gluc
lacZ	β-galactosidase	X-Gal
luc	Luciferase đom đóm	Lumis Phos
lux	Luciferase vi khuẩn	Lumi Phos
cat	Chloramphenicol acetyltransferase	Chloramphenicol đánh dấu
nos	Nopaline synthase	Nopaline

Gen npt II. Enzyme neomycin phosphotransferase (npt II) là một enzyme vi sinh vật có trọng lượng phân tử khoảng 25 kD, xúc tác cho phản ứng phosphoryl hóa một số kháng sinh gốc aminoglycoside như neomycin, kanamycin và G148. Trong phản ứng này, nhóm γ phosphate của ATP được gắn vào phân tử chất kháng sinh làm nó trở nên bất hoạt do ngăn trở sự liên kết của kháng sinh với ribosome.

Gen bar. Gen bar là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyltransferase (PAT), có tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT), là hoạt chất chính của thuốc trừ cỏ như Bialaphos và Basta. Gen bar được tạo dòng đầu tiên từ một dòng vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus. Phương pháp đơn giản nhất để kiểm tra sự có mặt của gen bar là phương pháp trực tiếp. Mô, tế bào hoặc cây chuyển gen được đặt trên môi trường có các nồng độ phosphinothricin khác nhau (hoặc các thuốc trừ cỏ tương ứng) và so sánh sinh trưởng của mô, tế bào hoặc cây đối chứng đặt trên cùng môi trường.

Gen gus A. là gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm rất đặc trưng.

Gen lacZ. Enzyme β-galactosidase (lacZ) trọng lượng phân tử 116 kD, pH tối thích 7-7,5 được mã hóa do gen lacZ. Gen lacZ ở E. coli được dùng rất phổ biến trong công nghệ gen vi sinh và đã có sẵn các hệ thống phương pháp kiểm tra rất nhạy với thuốc thử X-Gal. Sự tồn tại hoạt động của lacZ trong tế bào thực vật đã được khẳng định. Vì vậy trước khi kiểm tra sự có mặt của gen lacZ ngoại lai, cần phải bất hoạt gen lacZ nội sinh bằng glutaraldehyde.

Gen cat. Được phân lập và tạo dòng từ dòng vi khuẩn Tn9, là gen gây khả năng kháng chloramphenicol ở vi khuẩn nói chung. Gen cat đã được dùng rộng rãi trong công nghệ gen động vật và thực vật vì gen cat mã hóa cho enzyme chloramphenicol acetyltransferase (CAT). Enzyme này xúc tác phản ứng acetyl hóa hai vị trí trên phân tử chloramphenicol và làm nó bất hoạt.

2.2.2. Chuyển gen bằng phương pháp bắn gen

Đây là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới. Phương pháp này được Sanford (Cornell University, USA) đề xuất lần đầu tiên vào năm 1987. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng các viên đạn có kích thước hiển vi, có tỷ trọng cao để đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào.

Hạt tungsten hoặc vàng có đường kính 1-1,5 μm được dùng làm vi đạn (microprojectile). Vi đạn được trộn với DNA theo một tỷ lệ thích hợp cùng với các chất phụ gia và sau khi kết tủa DNA bao quanh vi đạn, hỗn hợp được làm khô trên trên một đĩa kim loại mỏng kích thước 0,5-0,8 cm. Đĩa kim loại được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) vừa khít với nòng súng. Thường đạn lớn làm bằng nhựa hoặc bông nén hay các vật liệu nhẹ. Khi bắn, áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao. Ra khỏi đầu nòng, một lưới thép mịn cản viên đạn lớn lại, nhưng các vi đạn vẫn tiếp tục quỹ đạo với gia tốc lớn đến đích và xuyên vào tế bào. Một tỷ lệ nhất định DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào và biểu hiện, thực hiện quá trình biến nạp gen

Hình 2.5. Sơ đồ súng bắn gen.

*Làm viên đạn.

Viên đạn được trộn với DNA 1 tỷ lệ tích hợp cùng với các chất phụ gia và sau khi kết tủa DNA bao quanh viên đạn, hỗn hợp được làm khô trên 1 dĩa kim loại mỏng, kích thước 0,5 – 0,8 cm. Đĩa kim loại được gắn vào đầu một viên đạn lớn vừa khít với nòng súng. Thường đạn lớn làm bằng nhựa hay các vật liệu nhẹ. Khi bắn áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao ra khỏi đầu nòng súng một lưới thép mịn cản viên đạn lớn đạn lại, nhưng các hạt vi đạn vẫn tiếp tục quĩ đạo với gia tốc lớn đến đích và nguồn vào tế bào. Một tỉ lệ nhất định DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào và biểu hiện, thực hiện quá trình chuyển gen.

* Các mẫu súng bắn gen

1. 
   Súng bắn gen PDS-1000
   

Áp lực đẩy viên đạ lớn được tạo ra bằng thuốc súng, vận tốc đầu nòng đạt 800m/giây. Tốc độ viên đạn có thể đạt trên 1300m/giây ở cách lưới chắn 2cm.


Hình 2.6. Cấu tạo súng Hình 2.7. Phóng đại phần đầu bắn gen PDS-1000 nòng và lưới chắn

1.kim hoả 1.đầu nòng

2.thuốc súng 2.bệ chắn

3.viên đạn lớn 3.lưới chắn

4.nòng súng 4.viên đạn lớn

5.lưới chặn 5.viên đạn.

6.mô thực vật.
2. Súng bắn gen PDS-1000He.

Trong đó helum nén được dùng để gia tốc viên đạn lớn thay cho thuốc súng, một lưới chắn bằng kim loại được cài đặt trên bệ chặn. Viên đạn được trộn với DNA và làm khô trên 1 đĩa kim loại nhỏ, sau đó gắn lên đầu viên đạn lớn. Loại này được dùng phổ biến hiện nay.

A. Phần đầu pipton bằng nhựa, thể tích khoảng 1ml. Đoạn đầu nhọn của pipton chứa agarose (tô đen) có hoà DNA ngoại lai, áp vào đỉnh sinh trưởng của 1 chồi phụ bị chậu này chứa đất trồng, đất ẩm nối với cực dương của hệ điện di.

Hình 2.8. Cấu tạo PDS-1000He







Hình 2.9. Cấu tạo PDS-1000HC

1.Bình chứa HC áp suất cao, 2.Màng giữ áp suất HC trong bình 1,màng này sẽ tách khi áp suất HC tăng vọt và cho khí HC thoát ra với tốc độ cao, 3.Viên đạn lớn, là đĩa kim loại mỏng, trên đó hỗn hợp DNA và vi đạn được kết tủa và làm khô, các vi đạn nằm ở mặt dưới nước đĩa, 4. Bệ bắn, 5.Lưới chắn, 6.Buồng bắn gen dưới áp chân không, 7.Mô thực vật.

2. 
   Súng bắn gen Sautter 1991
   

Để tránh các yếu tố gây ra sự không đồng đều về vận tốc vi đạn. không dùng viên đạn lớn mà tạo ra các điều kiện để các hạt vi đạn lơ lửng trong không khí ngay trước khi chúng được gia tốc.

Ống pipton là 1 ống thép, trong có 1 ống nhỏ thẳng góc với trục đầu ống nhỏ nằm trên trục ống. Trong ống nhỏ chứa 20l hỗn hợp vi đạn bằng vàng và DNA. Ở áp suất 60bar và tốc độ khí 2m/giây, hỗn hợp sẽ lán thành sương mù có kích thước cơ XMIRON, các hạt này được thổi qua ống vi quản bằng thuỷ tinh có =300m-400m và dài 10mm. Các hạt sương mù chứa vi đạn và DNA được gia tốc khi chuyển qua ống vi quản và dướI ảnh hưởng của chân không ở buồng 9. Lượng hỗn hợp vi đạn và DNA được đo chính xác bằng bơm vi tiêm 6.

Hình 2.10. Súng bắn gen của Biorad.

2.2.3. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào protoplast bằng xung điện

Thiết bị điện xung (electroporator) là thiết bị có khả năng tạo ra các xung điện trong thời gian rất ngắn (5-6 phần nghìn giây) và ở điện thế (pulse strenght) chính xác (500 V/cm) với thời gian tắt dần (decay time) 20 ms. Protoplast được đặt giữa hai tấm kim loại cách nhau từ 1-4 mm trong một cuvette bằng nhựa. Ở điện thế cao, xung điện tạo các lỗ tạm thời (cỡ 30 nm) trên màng protoplast và DNA bên ngoài có thể xâm nhập vào chất nguyên sinh.

Xung điện được tạo ra khi giải phóng dòng điện chứa trong một điện dung (capacitor) từ điện cực này qua điện cực khác. Các vật nằm trong không gian giữa hai điện cực chịu tác động tắt dần của xung điện. Xung điện được xác định bởi hai giá trị là sự chênh lệch điện thế và thời gian tắt dần. Ở các thiết bị điện xung hiện đại, thời gian tắt dần được thu lại rất ngắn và trên biểu đồ xung điện được biểu diễn gần như một cột vuông. Nói chung, các thiết bị điện xung hoàn chỉnh được nhiều hãng cung cấp để thực hiện chuyển gen vào vi sinh vật, protoplast thực vật hoặc tế bào động vật.

2.2.4. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào protoplast bằng kỹ thuật vi tiêm

Vi tiêm (microinjection) là kỹ thuật sử dụng phổ biến trong công nghệ tế bào động vật. Trên hiển vi thường, DNA plasmid có thể được tiêm vào protoplast và thực hiện biến nạp gen thành công ở khá nhiều đối tượng thực vật. Tuy nhiên, Kỹ thuật này hiện nay ít được các phòng thí nghiệm sử dụng, vì thao tác vi tiêm dưới kính hiển vi đòi hỏi thiết bị vi thao tác cực nhạy, thiết bị kéo và mài kim tiêm từ các ống thủy tinh. Ngoài ra, nó còn đòi hỏi kỹ năng thao tác và sự kiên nhẫn cao của kỹ thuật viên.



Hình 2.11. Chuyển gen bằng vi tiêm

2.2.5. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào protoplast bằng PLO và PEG

PEG (polyethylene glycol) cùng với sự có mặt của Ca²⁺ là tác nhân dung hợp được sử dụng phổ biến nhất trong lai soma. Krens và cs (1982) là những người đầu tiên chứng minh có thể dùng PEG để chuyển trực tiếp DNA vào trong protoplast thực vật. Kỹ thuật này đòi hỏi phải nuôi protoplast với DNA trần có mặt PEG và CaCl₂. Sau khi hòa tan dần dần hỗn hợp, các protoplast được phân lập, rửa và cuối cùng dàn trải trên môi trường chọn lọc. Tần số chuyển nạp trung bình ở protoplast thuốc lá khoảng từ 10^-2 và 10^-5.

Cách tiến hành:

- Bổ sung PEG sau DNA

- Xử lý shock nhiệt protoplast ở 46^oC rồi làm làm lạnh trên băng.

Каталог: Data -> News -> 388 -> files
News -> Nghị quyết của quốc hội số 23/2003/QH11 ngàY 26 tháng 11 NĂM 2003 VỀ nhà ĐẤT DO nhà NƯỚC ĐÃ quản lý, BỐ trí SỬ DỤng trong quá trình thực hiện các chính sáCH
News -> QuyếT ĐỊnh về việc ban hành Quy định về trang phục đối với Sinh viên Trường Đại học Lạc Hồng
News -> BỘ chính trị ĐẢng cộng sản việt nam
files -> Phần nuôi cấy tế BÀo chương giới thiệu chung và LỊch sử phát triểN
files -> Chương MỘt số phưƠng pháp canh tác hiệN ĐẠI 1 Thủy canh
files -> Chương nuôi cấy tế BÀo và chọn dòng tế BÀo nuôi cấy tế bào đơn
files -> Chương những khái niệm cơ BẢn học thuyết tế bào
files -> Chương thu nhận và nuôi cấy phôi in vitro phôi soma

tải về 297.25 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: