Phần chuyển gen ở thực vật bậc cao chương MỞ ĐẦU
Tính bảo thủ của gen về di truyền và biến dị
tải về 297.25 Kb.
|
- Điều hướng trang này:
- Chương 2 . CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO
- 2.1.2 Cắt DNA bằng Enzim giới hạn
- 2.1.3 Điện di DNA và các sản phẩm cắt DNA trên gel agaroze
- 2.1.4 Nối các đoạn bằng DNA ligase
- 2.1.5. Dòng hóa gen
1.6. Tính bảo thủ của gen về di truyền và biến dịHiện tượng di truyền và biến dị là 2 mặt mâu thuẫn thống nhất của sự sống, nhờ đó sự tiến hóa có thể thực hiện. Bản chất của 2 hiện tượng này có liên quan chặt chẽ với sự hình thành tồn tại axit deoxyribonucleic (DNA) . Vì vậy DNA là phân tử của sự sống, sợi chỉ của sự sống, chuỗi xoắn kép của sự sống. Cơ chế sinh tổng hợp DNA, vai trò khuôn mẫu của DNA trong tổng hợp protein (enzim) thông qua các phân tử axit ribonucleic (RNA) dần dần đã được khám phá để lí giải hiện tượng di truyền và biến dị, các p/p CN gen, hầu hết là các p/p xử lý DNA hoặc RNA. Di truyền và biến dị nằm trong sự thể hiện của gen trong quá trình phát triển của sinh vật. Ngày nay gen đã được đo đạc, chụp ảnh và xác định chính xác ở mức phân tử , là 1 hay nhiều đoạn DNA tương ứng với 1 tính trạng. Cơ chế sinh tổng hợp DNA theo khuôn mẫu đảm bảo tính bảo thủ của hiện tượng di truyền qua các thế hệ. Những thay đổi dù nhỏ, trên đoạn DNA tương ứng với 1 gen, ít nhiều cũng dẫn đến sự thay đổi tính trạng, cơ sở của hiện tượng biến dị.
2.1. Xác định và dòng hóa gen2.1.1. Chiết suất và tinh sạch DNA từ mô thực vậtCó rất nhiều phương pháp tùy theo mục đích sử dụng DNA để làm gì hoặc chiết xuất loại mô nào. Khuynh hướng chung hiện nay là tìm phương pháp đơn giản nhất, thời gian thao tác ngắn nhất nhưng DNA thu được vẫn có đủ độ tinh khiết và độ nguyên vẹn 50 – 100 KG cần thiết cho các thao tác tiếp theo trong công nghệ gen thực vật như cắt bằng E giới hạn, chạy phản ứng PCR ….Muốn thu DNA có chiều dài 100 – 5.000 KG phải dùng phương pháp điện di có điện trường không liên tục *Chiết suất và tinh sạch DNA tổng số Tế bào thực vật được nghiền vỡ trong điều kiện lạnh làm cho DNA được hòa vào đệm chiết SDS (sodium dedecyl sulfatc) hoặc CTAB (celytrimethyl amonium bromide) được thêm vào để giúp DNA hòa dễ hơn, đầy đủ hơn vào dịch đệm. EDTA có tác dụng gắn chặt các ion Mg+ là yếu tố cần cho sự hoạt động của nucleotit phân huỷ DNA trong quá trình chiết. Protein được tách khỏi DNA bằng phenol hoặc chloroform Nếu tránh được chấn động xé, xoáy quá mạnh, có thể thu được DNA với chiều dài 50 – 100 KG. Ngoài ra, CTAB còn có tác dụng tách các polysaccarit ra khỏi DNA, do chúng có độ hòa tan khác nhau trong môi trường có mặt CATB
Lá nghiền với đệm chiết CATB có chứa mercabthoethamol. DNA được chiết bằng hỗn hợp cloroform izoamila, kết tủa bằng izphopanol, sau đó qua 1 số bước để rửa và tinh khiết DNA.
Mẫu lá được sử dụng ở lượng rất ít. Quá trình chiết được đơn giảm hóa nhiều để thao tác nhanh và làm cùng 1 lúc nhiều mẫu, tuy vậy DNA được chiết ra hoàn toàn đủ độ lớn và độ sạch để chạy PCR tiếp theo. 2.1.2 Cắt DNA bằng Enzim giới hạn* Các enzim giới hạn Enzim giới hạn là nhóm endonucleoaza chỉ cắt phân tử DNA ở những vị trí có dãy mã nucleotit nhất định mà chúng có khả năng nhận ra. Thuộc tính rất quan trọng này của enzim giới hạn cho phép cắt phân tử DNA ở các vị trí chọn sẵn. Mỗi enzim giới hạn hoạt động tối thích trong các điều kiện khác nhau (cho nên các công ty cung cấp enzim thường cung cấp các dung dịch tương ứng) 1. Enzim giới hạn rất đắt tiền, vì vậy phản ứng cắt thường thực hiện với 1 lượng DNA tối thiểu, trong 1 thể tích phản ứng tối thiểu. Kết quả hoạt động của enzim giới hạn phụ thuộc vào độ sạch của DNA 2. Enzim giới hạn được chuyên chở và bảo quản lạnh (-200C). Nếu lấy khỏi tủ lạnh trong thời gian ngắn cần phải để E trên đó. 3.Các đoạn cắt DNA do enzim giới hạn có thể có các đầu sole hoặc đầu bằng. Các melylaza có khả năng làm thay đổi tính chất của sợi DNA ở điểm tác động bằng cách gắn 1 gốc metyl vào đó, Ứng dụng chủ yếu của melylaza là để bảo vệ 1 số vị trí trên DNA mà người ta không muốn bị cắt bởi enzim giới hạn. 2.1.3 Điện di DNA và các sản phẩm cắt DNA trên gel agarozeCác đoạn DNA được cắt từ phân tử DNA có khối lượng khác nhau và diện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của máy điện di trong 1 điện trường có điện thế và cường độ thích hợp 2.1.4 Nối các đoạn bằng DNA ligaseDNA ligase là các enzim nối đoạn DNA lại với nhau. Điểm nối lại là đầu 3’ của một đoạn DNA và đầu 5’ của đoạn còn lại. Năng lượng để nối là ATP
DNA ligase A(DNAOH) + B (pDNA) DNA (AtB) + Pi Ứng dụng quan trọng nhất của ligase là trong cấu trúc của các vector plasmid và các cấu trúc DNA khác đã có đủ các dãy mã cần thiết cho việc chuyển gen, biểu hiện gen, sàng lọc các tế bào đã chuyển gen. 2.1.5. Dòng hóa genDãy mã tự nucleotit của gen thường được biết thông qua tìm hiểu dãy mã tự axit amin của sản phẩm của nó, các protein. Sau khi chiết xuất, tinh sạch protein để giải mã, dãy mã tự axit amin của chúng *Nhân dòng gen Nhân dòng gen là một tiến trình trong đó gen mục tiêu được định vị và nhân lên từ DNA được tách chiết từ một cá thể. Khi tách chiết DNA khỏi một cá thể thì tất cả gen của nó cũng được tách ra khỏi cá thể. DNA này chứa đến hàng ngàn gen khác nhau nên nhà di truyền học phải tìm ra gen chuyên biệt mã hoá cho protein mục tiêu. Một trong những hướng phát triển gần đây nhất của nuôi cấy mô và tế bào thực vật là biến nạp và biểu hiện các gen ngoại lai trong tế bào thực vật. Biến nạp của các tế bào vi khuẩn được thực hiện bằng cách chuyển DNA từ một vi khuẩn khác và sự hợp nhất sau đó của DNA ngoại lai này trong nguyên liệu di truyền của vật chủ đã được thiết lập tốt. Tuy nhiên, việc cải biến di truyền ở thực vật bậc cao bằng cách đưa DNA ngoại lai vào trong các tế bào của chúng là một quá trình rất phức tạp. Sử dụng enzyme hạn chế (restriction endonucleases) để cắt phân tử DNA sợi đôi thành những đoạn nhỏ riêng rẽ, phát triển kỹ thuật lai DNA-DNA và các gen chỉ thị (marker genes) cho phép chọn lọc các tế bào biến nạp có khả năng hợp nhất DNA ngoại lai trong tế bào ở monera, nấm, động vật, và thực vật bậc cao. Những nghiên cứu gần đây cho thấy thông tin di truyền mới được biến nạp vào các thực vật eukaryote biểu hiện không chỉ ở mức độ tế bào và sau đó mức độ cơ thể hoàn chỉnh mà còn có thể truyền lại cho các thế sau của chúng. Thành tựu nổi bật của công nghệ gen ở thực vật bậc cao là tái sinh được cây biến nạp gen đầu tiên vào đầu thập niên 1980. Đến nay, các kỹ thuật phân tử đã được ứng dụng thành công ở nhiều loài khác nhau. Lúc đầu người ta sử dụng các gen chỉ thị để biến nạp, nhưng nay đã thay thế bằng các gen quan trọng có giá trị kinh tế nhằm mục đích cải thiện phẩm chất cây trồng. Hai nhân tố then chốt thúc đẩy sự phát triển của công nghệ gen (gene transformation technology) ở thực vật bậc cao là: các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ những tế bào biến nạp và các phương pháp đưa DNA ngoại lai vào các loài thực vật khác nhau. Muốn chuyển một gen thành công cần phải chứng minh hiệu quả của phương pháp biến nạp gen, nhưng đôi khi các loài được nghiên cứu hoặc không thể tái sinh được cây từ các mô không phân hóa, hoặc có thể tái sinh nhưng sau đó khó phát triển thành cây hoàn chỉnh. Do đó, hai nhân tố nói trên thường được nghiên cứu phát triển song song. Các thí nghiệm biến nạp gen đầu tiên đã sử dụng Agrobacterium tumefaciens để đưa vào cây thuốc lá các gen kháng kháng sinh. Agrobacterium là vật truyền hữu hiệu để đưa các DNA ngoại lai vào trong các loài thuộc họ Solanaceae, nhưng ở một số cây trồng khác quan trọng hơn việc sử dụng nó còn gặp nhiều hạn chế. Trở ngại lớn nhất là tính đặc trưng vật chủ của Agrobacterium, mặc dù những tiến bộ gần đây đã cho phép ứng dụng thành công trên một số giống cây trồng. Sự phát triển của các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ callus và protoplast đã mở ra một hướng mới cho công nghệ di truyền thực vật thông qua các phương pháp biến nạp gen trực tiếp. Nhờ sự phát triển của phương pháp bắn gen (particle bombardment)-dựa trên cơ sở tăng gia tốc của các hạt kim loại nặng mang nguyên liệu di truyền vào trong mô thực vật-việc biến nạp ở các loài cây trồng đã gặp nhiều thuận lợi hơn. Các phương pháp biến nạp khác cũng có hiệu quả đối với từng trường hợp đặc biệt, nhưng khả năng ứng dụng rộng rãi của chúng bị hạn chế. Chẳng hạn: các phương pháp biến nạp gen bằng xung điện (electroporation) vào các mô được cắt nhỏ từng phần, phương pháp xử lý hóa học bằng PEG (polyethylene glycol), phương pháp vi tiêm (microinjection) đưa DNA ngoại lai trực tiếp vào tế bào, phương pháp dùng silicon carbide lắc với tế bào có tác dụng như các mũi kim nhỏ giúp DNA bên ngoài xâm nhập vào bên trong tế bào, phương pháp biến nạp gen qua ống phấn... Ngân hàng gen Bởi vì không thể định vị gen trên DNA bằng mắt thường, các nhà khoa học phải tạo ngân hàng gen. Ngân hàng gen là một tập hợp khuẩn lạc vi khuẩn sống có mang nhiều đoạn của DNA từ một cá thể. Đây chính là nguồn của gen mục tiêu.
Xây dựng ngân hàng gen Xây dựng ngân hàng gen cần DNA tách chiết, enzyme cắt giới hạn và plasmid. Bước 1: DNA tách chiết từ cá thể có chứa gen mục tiêu được cắt bởi enzyme giới hạn thành nhiều mảnh có kích thước của một gen. Bước 2: plasmid của vi khuẩn cũng được xử lý bởi cùng enzyme giới hạn. Bước 3: DNA có kích thước một gen và plasmid đã được xử lý được trộn chung với nhau trong một tube. Một số các đoạn DNA đã được cắt bằng enzyme sẽ nối với plasmid và tạo thành plasmid tái tổ hợp. Bước 4: plasmid tái tổ hợp sau đó được chuyển vào tế bào vi khuẩn bằng điện biến nạp hoặc hoá biến nạp. Bước 5: vi khuẩn tăng trưởng trên đĩa môi trường và cho phép hình thành khuẩn lạc. Tất cả khuẩn lạc trên đĩa môi trường được gọi là ngân hàng gen. Bước 6: ngân hàng gen được sàng lọc để tìm ra khuẩn lạc nào có chứa gen mục tiêu bằng cách phát hiện trình tự DNA của gen mục tiêu hay một protein mà gen đó mã hoá hay sử dụng mẫu dò. Vì vậy, trước khi sàng lọc ngân hàng gen, nhà khoa học phải biết được trình tự của gen mục tiêu hay gen gần giống nó nhất hay protein mà gen đó mã hoá hoặc một mẫu dò được thiết kế cho gen đó. Khi vi khuẩn được nhân lên sẽ tạo nhiều DNA tái tổ hợp dẫn đến số lượng bản sao của gen cũng tăng lên, nhờ đó việc phát hiện gen hay protein dễ dàng hơn. Sau khi xác định được khuẩn lạc có chứa gen mục tiêu, vi khuẩn có thể được nhân dòng để tạo hàng triệu bản sao của plasmid tái tổ hợp có chứa gen đó.
Ứng dụng Trong kỹ thuật gen, nhân dòng gen là một bước rất quan trọng vì tách chiết được một gen có thể giúp đánh giá trình tự nucleotide của nó. Từ đó có thể xác định được những giới hạn bên trong một gen, ví dụ như số intron và vị trí của chúng hay các yếu tố hoạt hóa. Không chỉ vậy, với nguồn gen có được, nhà khoa học có thể so sánh trình tự DNA giữa các gen để làm rõ hơn tiến hoá của gen hoặc dịch trình tự DNA của một gen thành trình tự amino acid nhờ vào bảng mã di truyền qua đó có thể đoán được cấu trúc của protein được mã hoá cũng như chức năng của gen đó. Bên cạnh đó, nhờ kỹ thuật gen, nhà khoa học có thể chuyển gen mục tiêu vào một cá thể tạo thành cá thể chuyển gen. Cá thể chuyển gen được dùng cả trong nghiên cứu về các tiến trình sinh học ở phòng thí nghiệm cũng như ứng dụng trong phát triển cây kháng côn trùng hoặc sản xuất insulin cho người từ vi khuẩn mang gen tương ứng với gen của người.
Каталог: Data -> News -> 388 -> files News -> Nghị quyết của quốc hội số 23/2003/QH11 ngàY 26 tháng 11 NĂM 2003 VỀ nhà ĐẤT DO nhà NƯỚC ĐÃ quản lý, BỐ trí SỬ DỤng trong quá trình thực hiện các chính sáCH News -> QuyếT ĐỊnh về việc ban hành Quy định về trang phục đối với Sinh viên Trường Đại học Lạc Hồng News -> BỘ chính trị ĐẢng cộng sản việt nam files -> Phần nuôi cấy tế BÀo chương giới thiệu chung và LỊch sử phát triểN files -> Chương MỘt số phưƠng pháp canh tác hiệN ĐẠI 1 Thủy canh files -> Chương nuôi cấy tế BÀo và chọn dòng tế BÀo nuôi cấy tế bào đơn files -> Chương những khái niệm cơ BẢn học thuyết tế bào files -> Chương thu nhận và nuôi cấy phôi in vitro phôi soma tải về 297.25 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|
