ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
Bảng 2.3. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR
tải về 1.28 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- Bảng 2.4. Chương trình chạy của phản ứng PCR
- 2.2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%
- 2.2.3.4. Phương pháp phân tích kết quả trên gel polyacrylamide
- 2.2.4. Phương pháp phân loại dưới loài
- 2.2.5. Phân tích và xử lý số liệu
Bảng 2.3. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR
Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau: Bảng 2.4. Chương trình chạy của phản ứng PCR
(*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi SSR cụ thể 2.2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%
- Cân 0.8g agarose, đong 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) cho vào bình tam giác. - Đun trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất. - Để nguội đến khoảng 50 - 600C, thêm 5l ethidium bromide (10 mg/ml) và lắc đều. - Chuẩn bị khay và lược. Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khí. Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông. - Rút lược, đặt gel vào bể điện di. Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel khoảng 2mm. - Tra sản phẩm PCR đã được trộn với Xylen cyanol vào giếng. tỷ lệ 5l Xylen cyanol /15l mẫu. Thời gian và điện thế sử dụng để điện di dài hay ngắn phụ thuộc vào kích thước của cặp mồi SSR cần kiểm tra. Các mẫu chạy với ladder 25 bp. - Soi gel trên máy soi cực tím.
- Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nước cất, sau đó lau lại 3 lần bằng ethanol 95%, để khô sau mỗi lần lau. - Lau tấm kính dài với giấy lụa tẩm Rain-X . Để 5 phút cho khô dung dịch. Chú ý. Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính ngắn. - Lau tấm kính ngắn với dung dịch dính (Binding solution) được tạo thành bằng cách thêm 2l Bind Silane vào 1ml chứa 95% ethanol và 5% glacial acetic acid. - Để cho tấm kính khô, lau tiếp bằng ethanol 95% 1 lần. - Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm.
Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380g; bisacrylamide 20g pha trong 1 lít nước) - Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2g Urea: 6ml TBE 10X: 6,75ml acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1) vào 1 cốc đong 100ml. Thêm 300l 10% APS (ammonium persulfate) và 60l TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều. - Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí. - Cài lược vào giữa hai tấm kính (răng lược hướng ra phía ngoài). Dùng kẹp cố định lược. - Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ.
- Tháo lược và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính. - Lắp ráp bộ điện di. Cho 1 lít đệm TBE 1X vào buồng đệm trên và dưới. - Dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trên của khuôn gel. - Chạy tiền điện di (prerun) với cường độ dòng điện là 50 - 60A, công suất 92 - 100W. - Biến tính các sản phẩm PCR ở 950C trong 5 phút, rồi ngay lập tức đặt vào trong đá và phủ đá lên trên ít nhất 5 phút. Sản phẩm PCR lúc này đã được trộn với 4l Sequencing Stop solution (10mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol; 0,05% xylene cyanol). - Tra vào mỗi giếng 5l sản phẩm PCR đã được làm biến tính, các mẫu chạy với ladder 1kb. Thời gian tra mẫu không kéo dài quá dài để gel không bị nguội đi nhiều. - Tiến hành điện di với công suất 60W và ở 500C, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thước từng mồi sử dụng.
+ Chuẩn bị các dung dịch - Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100ml glacial acetic acid và 900ml nước cất. - Dung dịch nhuộm (Staining solution) được tạo thành bằng cách hòa tan 1g bạc nitrat (AgNO3) vào 1 lít nước cất, sau đó bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37%. - Dung dịch hiện (Developing solution): Hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1 lít nước cất và làm lạnh ở -200C. Chú ý. (Trước khi sử dụng thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37% và 200l natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O). + Tiến hành nhuộm Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành các bước sau: - Cố định gel: Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hướng lên trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng và để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch. Chú ý. Giữ lại dung dịch này để dùng cho bước sau. - Rửa gel bằng nước cất 2 lần mỗi lần 5 phút. Cho gel vào dung dịch nhuộm, lắc nhẹ trong 30 phút. Thêm formaldehyd và sodium thiolsufat vào dung dịch hiện. Lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa lại bằng nước cất trong 5 - 10 giây. - Đưa gel vào dung dịch hiện và lắc nhẹ đến khi các băng xuất hiện. Cho gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng ở trên trong 3 - 6 phút. Rửa lại gel bằng nước cất. Để gel khô tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả.
2.2.5.1. Phân tích số liệu kiểu hìnhSố liệu đánh giá các tính trạng hình thái nông học được phân tích, xử lý trên phần mềm Excel. 2.2.5.2. Phân tích số liệu kiểu genHệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền theo công thức của Nei (1972)[54]: I = Trong đó: I: Hệ số tương đồng di truyền, D: Khoảng cách di truyền, q12: Số các alen đồng nhất ở cả 2 mẫu, Q1 và Q2: Tổng số các alen của giống 1 và 2. - Đa dạng di truyền alen của các chỉ thị SSR được đánh giá thông qua hệ số PIC [25] và được tính theo phương trình:
Trong đó: Pij : là tần số xuất hiện của alen thứ j tương ứng với mồi i. Giá trị PIC càng lớn tức là mức độ đa hình của locus do mồi i khuếch đại càng lớn, tức là càng nhiều alen được sinh ra. Sự có mặt hay vắng mặt của các alen của từng chỉ thị SSR được ghi nhận cho tất cả các giống lúa nghiên cứu, trong đó 0 là không có băng ADN và 1 là có băng ADN ở cùng một vị trí alen. Số liệu được nhập vào Excel và xử lý bằng chương trình NTSYS-pc v. 2.1 [60] để xây dựng ma trận tương đồng di truyền. Tiếp theo, sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu được xây dựng bằng phương pháp phân nhóm UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages). Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá thực trạng và ĐỀ xuất giải pháP tải về 1.28 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
và D = - ln (I)