Nội dung 3: Phân lập và xác định vi khuẩn gây bệnh trong mẫu sữa bò bị viêm vú và thử kháng sinh đồ

Nội dung được thực hiện nhằm xác định những vi khuẩn hiện diện trong sữa của bò bị viêm vú. Sau đó, mức độ mẫn cảm hay đề kháng của các vi khuẩn này đối với một số kháng sinh được xác định nhằm đưa ra hướng điều trị thích hợp.

Mẫu sữa được chọn lấy trực tiếp từ những thùy vú bò bị viêm vú lâm sàng hay viêm vú tiềm ẩn đã được xác định bằng phương pháp thử CMT. Vệ sinh và sát trùng bầu vú bằng cồn 70^o, vắt bỏ vài tia sữa đầu trước khi lấy mẫu sữa (khoảng 10 ml) cho vào ống nghiệm vô trùng. Sau đó đậy kỹ, đánh số ký hiệu rồi cho vào bình đá bảo quản ở nhiệt độ khoảng 4^oC và chuyển đến Bệnh xá Thú y trường Đại học Nông Lâm tiến hành xét nghiệm ngay trong ngày.

Nhóm coliforms (Klebsiella pneumoniae, Citrobacter diversus, Enterobacter aerogenes và E. coli).

50µl sữa của mỗi mẫu sữa được cấy trên thạch MC và ủ ở 37^oC/ 24 giờ. Sau đó, từ mỗi dạng khuẩn lạc mọc trên đĩa chọn 3 khuẩn lạc điển hình để xác định giống và loài. Việc xác định giống và loài theo sơ đồ (xem phụ lục 3, trang 143)

Staphylococcus spp. và Streptococcus spp.

50µl sữa của mỗi mẫu sữa được cấy trên thạch máu cừu 5% (BA) và ủ ở 37^oC/ 24 giờ. Từ mỗi đĩa, chọn 3 khuẩn lạc nghi ngờ với đặc điểm: khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa hay vàng, kích thước từ 2 – 3 mm để tiếp tục kiểm tra và định danh theo sơ đồ (xem phụ lục 3 trang 144, 145)

50µl sữa của mỗi mẫu sữa được cấy trên thạch máu cừu 5% (BA) và ủ ở 37^oC/ 24 giờ. Từ mỗi đĩa, chọn 3 khuẩn lạc nghi ngờ là P. aeruginosa với đặc điểm: trên BA có khuẩn lạc lớn, dẹp, rìa nhăn, nhầy, dung huyết b; trên MC khuẩn lạc lớn rìa nhăn màu nâu xám. Gram –, hình trực, oxidase +, có thể phát triển ở 42^oC, sinh sắc tố mạnh trên NA (nutrient agar), glucose (+) và lactose (-).

Các gốc vi khuẩn phân lập được từ mẫu sữa viêm được xác định khả năng đề kháng với các kháng sinh thông dụng trên thị trường theo phương pháp Kirby Bauer.

Vi khuẩn được làm hoạt hóa sang môi trường thạch ống nghiêng NA, ủ 37^oC/24h (riêng Streptococcus thì hoạt hóa bằng thạch ống nghiêng BA). Lấy sinh khối vi khuẩn cho vào 9 ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, lắc đều và điều chỉnh để có độ đục tương đương với độ đục Mc Farland 0,5. Sau đó, lấy tăm bông vô trùng thấm huyễn dịch vi khuẩn trải đều lên bề mặt đĩa thạch Mueller-Hinton (MH) hoặc thạch máu (đối với Streptococcus). Đặt đĩa giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt đĩa thạch đã được trải trùng, mỗi đĩa thạch có thể đặt tối đa 7 đĩa giấy tẩm kháng sinh. Khoảng cách từ mép đĩa đến đĩa giấy tẩm kháng sinh tối thiểu là 10 mm, và khoảng cách giữa 2 đĩa giấy tẩm kháng sinh tối thiểu là 20 mm. Ủ 37^oC/18 - 24 giờ. Kết quả được đọc bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn rồi so với bảng đường kính vòng vô khuẩn chuẩn để xác định tính mẫn cảm hay đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh tương ứng (xem phụ lục 4, trang 146 - 149).

Các đĩa kháng sinh sử dụng gồm: ampicillin, amoxicillin, cephalexin, penicillin, gentamicin, kanamycin, neomycin, streptomycin, norfloxacin, spiramycin, ciprofloxacin, ofloxacin, erythromycin, doxycycline, tetracycline, Bactrim (trimethoprime + sulfamethoxazole), colistin, tobramycin do công ty Nam Khoa cung cấp.

Mục tiêu: Khảo sát này nhằm biết được khi bò bị viêm vú tiềm ẩn sẽ ảnh hưởng như thế nào đến chất lượng sữa. Đây là những chỉ tiêu có liên quan đến tiêu chuẩn thu mua của nhà máy sữa.

Mẫu sữa phân tích: Lấy các mẫu sữa ở các mức độ CMT: -, +, + + và + + +.

2.4.4.1 Phương pháp phân tích chỉ tiêu chất béo, protein, lactose, tổng vật chất khô

Thành phần hóa học của sữa như: chất béo, protein, lactose, tổng vật chất khô được phân tích bằng máy phân tích nhanh MilkoScan FT 120. Đây là thiết bị chuyên dùng để phân tích sữa với thời gian phân tích là 30 giây. Máy được cung cấp bởi hãng Foss Electric của Mỹ.

Máy MilkoScan FT 120 được sử dụng kèm với máy vi tính. Hoạt động của máy được điều khiển bằng phần mềm vi tính, cho kết quả phân tích hiển thị ra màn hình dưới dạng cột.

Nguyên tắc hoạt động máy MilkoScan FT 120

Máy MilkoScan FT 120 phân tích thành phần hóa học của mẫu sữa dựa vào dụng cụ đo giao thoa phổ hồng ngoại FTIR (Fourier Transform Infrared Spectrocopy). FTIR quét trên một dãy phổ hồng ngoại đầy đủ cho những chất hóa học cần phân tích. Thu thập tất cả dữ liệu từ dãy quang phổ này cùng phân tích một lúc bằng bộ phận hồng ngoại (IR analysis). Sự phân tích này dựa trên sự so sánh dãy phổ hồng ngoại thu được với dãy phổ hồng ngoại chuẩn mà người sử dụng đã định sẵn. Trình tự phân tích như sau:

Nguồn tia laser phát ra kích hoạt nguồn hồng ngoại phát ra tia hồng ngoại. Tia hồng ngoại này đi qua bộ phận tách tia (beam splitter) tạo thành hai tia sáng đi tới hai gương phẳng. Tới gương, hai tia sáng sẽ phản xạ lại và đi tới cốc chứa mẫu. Hai tia sáng được mẫu sữa hấp thu và phát thành hai luồng sáng đặc trưng cho mẫu, hai luồng sáng này sẽ giao thoa với nhau tạo thành phổ giao thoa hồng ngoại. Phổ được ghi bằng dụng cụ đo giao thoa (enterferometer). Nhờ nguyên lý toán học Fourier (thực hiện được 10 phép tính/1giây), phổ giao thoa được chuyển thành 1 dãy phổ đầy đủ đặc trưng cho mẫu cần phân tích dưới dạng hình sin có tần số và biên độ xác định. Dãy phổ này sẽ được so sánh với dãy phổ chuẩn tại bộ phận phân tích hồng ngoại (IR analysis) mà người sử dụng đã hiệu chỉnh sẵn. Từ kết quả này sẽ đưa ra kết quả thành phần hóa học của mẫu sữa cần phân tích.

2.4.4.2 Đo pH sữa

Dùng pH kế cầm tay (Pocket pH Meter)

Đếm tổng số vi sinh hiếu khí trong sữa nhằm đánh giá chất lượng sữa bò bị viêm vú tiềm ẩn so với sữa bình thường và đánh giá hiệu quả điều trị về mặt vi sinh.

Cách thực hiện: Các mẫu sữa được pha loãng thập phân với nước muối NaCl 0,9%. Chọn ba nồng độ thích hợp, mỗi nồng độ cho vào 2 đĩa petri vô trùng (1 ml/ đĩa). Sau đó, cho 18-20 ml môi trường NA (Nutrient Agar) đã được làm nguội 40^oC – 45^oC vào mỗi đĩa, lắc đều, và để yên 10 - 15 phút cho thạch NA trong đĩa đông lại. Sau khi ủ (37^oC/ 24 giờ), đếm số khuẩn lạc trên các đĩa. Chọn những đĩa có từ 30 đến 300 khuẩn lạc để tính kết quả [5].

Tổng số vi khuẩn hiếu khí của mỗi nồng độ được xác định bằng công thức.

A₁= M × V × H

A₁: Tổng số vi khuẩn hiếu khí của nồng độ 1 được chọn

M: số khuẩn lạc trung bình của 2 đĩa

V: lượng sữa dùng pha loãng (ml)

H: hệ số pha loãng

Tương tự cho A_{2, …}

Tổng số vi khuẩn hiếu khí của mẫu (N) được xác định bằng công thức

N= (A₁ + A₂ + A₃)/ 3

Qua kết quả khảo sát tỉ lệ viêm vú tiềm ẩn và tìm hiểu những nguyên nhân có liên quan. Dựa vào điều kiện thực tế, chúng tôi áp dụng một số biện pháp vệ sinh thú y để phòng viêm vú tiềm ẩn trên đàn bò thí nghiệm.

Mục tiêu nội dung này nhằm đánh giá xem việc áp dụng qui trình vệ sinh thú y có hiệu quả ở mức độ nào trong phòng bệnh viêm vú cho đàn bò sữa, để từ đó có cơ sở thực tiễn khuyến cáo người chăn nuôi áp dụng.

Thí nghiệm được thực hiện tại xí nghiệp bò sữa An Phước (Long Thành – Đồng Nai) và một số hộ chăn nuôi bò sữa gia đình ở Tp. Hồ Chí Minh.

Lô đối chứng: 175 bò lai HF đang khai thác sữa được áp dụng các biện pháp vệ sinh chăm sóc và khai thác sữa theo qui trình của cơ sở chăn nuôi.

Lô thí nghiệm: 157 bò lai HF đang khai thác sữa. Ngoài qui trình kỹ thuật của cơ sở, chúng tôi áp dụng thêm một số biện pháp vệ sinh thú y mà cơ sở chăn nuôi không có áp dụng như đã trình bày ở bảng 2.2.

Cả 2 lô được thử CMT vào đầu thí nghiệm và lập lại hàng tháng trong 3 tháng để đánh giá tỉ lệ viêm vú tiềm ẩn của 2 lô đối chứng và thí nghiệm.

6. 
   Nội dung 6: Thử nghiệm điều trị viêm vú bò sữa và khảo sát sự tồn dư kháng sinh trong sữa khi đang điều trị
   

Mục tiêu: Tìm ra phương pháp điều trị có hiệu quả cao để giúp người chăn nuôi và cán bộ thú y ứng dụng điều trị viêm vú cho bò.

Biện pháp thực hiện: Dựa vào kết quả phân lập vi khuẩn và thử kháng sinh đồ cũng như các chế phẩm thuốc thú y có trên thị trường dùng điều trị viêm vú, chúng tôi chọn và áp dụng các cách điều trị như sau:

1. 
   Cách điều trị viêm vú lâm sàng
   

Để điều trị viêm vú lâm sàng, chúng tôi sử dụng các chế phẩm và đường cấp thuốc theo các phương thức trình bày ở bảng 2.3. Việc chọn chế phẩm điều trị được thực hiện một cách ngẫu nhiên trong điều kiện thực tế cho phép, không có bố trí thí nghiệm.

2. 
   Cách điều trị viêm vú tiềm ẩn
   

3. 
   Đánh giá kết quả điều trị
   

• 
  Viêm vú lâm sàng
  

• 
  Viêm vú tiềm ẩn
  

Tỉ lệ điều trị khỏi (%) = Số thùy vú khỏi / số thùy vú điều trị × 100

Nhằm đánh giá kết quả điều trị khỏi bệnh viêm vú tiềm ẩn về mặt vi sinh do vi khuẩn S. aureus gây ra, mẫu sữa được lấy và đếm tổng số vi khuẩn S. aureus trước khi dùng kháng sinh điều trị và sau khi kết thúc liệu trình điều trị.

Các mẫu sữa được pha loãng thập phân với nước muối NaCl 0,9% và 0,1 ml của mỗi độ pha loãng được cho vào và được dàn đều trên các đĩa thạch BP (Baird Parker). Sau 24 giờ nuôi cấy (37^oC), xác định số lượng (và đánh dấu) khuẩn lạc có hình dáng đặc trưng (tròn, đen bóng, lồi, ướt, có đường kính 2 – 3 mm, có vòng halo đục xung quanh) và khuẩn lạc có hình dáng không đặc trưng (không có vòng halo sáng xung quanh), sau đó thử phản ứng coagulase trên những đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250 [5]. Công thức tính:

X = (a+b) × (1/v) × h

X: số lượng vi khuẩn trong 1ml sữa

a, b: tỷ lệ khuẩn lạc điển hình và không điển hình đã xác định dương tính bằng phản ứng coagulase

v: lượng sữa cấy (ml)

h: hệ số pha loãng

2.4.6.2 Xác định tồn dư kháng sinh trong sữa khi đang điều trị viêm vú

Mục đích: Nhằm đánh giá sự tồn dư kháng sinh trong sữa ở những thùy vú không điều trị khi áp dụng phương pháp điều trị viêm vú bằng đường cấp kháng sinh cục bộ trực tiếp vào thùy vú viêm. Để từ đó có cơ sở khuyến cáo nhà chăn nuôi khai thác và sử dụng sữa hợp lý.

Cách thực hiện: Chọn những bò có 1 – 2 thùy vú viêm tiềm ẩn đã được xác định qua phản ứng CMT, điều trị bằng cách bơm trực tiếp chế phẩm kháng sinh dạng kem vào thùy vú viêm. Sau khi bơm kháng sinh lần thứ 2 khoảng 6 giờ, lấy mẫu sữa (200 ml) ở mỗi thùy vú có điều trị và thùy vú không điều trị (sau khi vệ sinh sát trùng và vắt bỏ những tia sữa đầu) cho vào lọ đựng mẫu sạch vô trùng, bảo quản trong bình đá ở nhiệt độ khoảng 4^oC và đưa ngay đến phòng thí nghiệm kiểm tra tồn dư kháng sinh.

Phương pháp kiểm tra: Dùng phương pháp vi sinh vật để định tính và phương pháp sắc ký lỏng cao áp để định lượng.

• 
  Phương pháp vi sinh vật để xác định các nhóm kháng sinh tồn dư
  

Bảng 2.5 Khảo sát tồn dư kháng sinh bằng phương pháp vi sinh vật

• 
  Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC – High Pressure Liquid Chromatography) để định lượng kháng sinh tồn dư
  

Bảng 2.6 Khảo sát tồn dư kháng sinh bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp

1. 
   TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI BÒ SỮA Ở CÁC HỘ DÂN
   

• 
  Giống bò
  

• 
  Phương thức chăn nuôi
  

• 
  Chuồng trại
  

• 
  Thức ăn
  

• 
  Nguồn nước
  

• 
  Vệ sinh chăm sóc và phòng bệnh
  

Định kỳ 2 lần trong năm đàn bò được tiêm phòng 2 loại vaccin phòng bệnh lở mồm long móng và tụ huyết trùng do cán bộ thú y địa phương thực hiện. Việc phòng bệnh ký sinh trùng chưa được người chăn nuôi quan tâm.

• 
  Phương thức khai thác và vắt sữa
  

Các dụng cụ vắt sữa, lọc sữa, thùng chứa sữa đều được vệ sinh sau mỗi buổi vắt sữa với xà phòng, nước giếng rồi đem phơi nắng. Có một số hộ dùng nước nóng vệ sinh bình chứa sữa. Những hộ sử dụng máy vắt thì vệ sinh máy sau mỗi buổi vắt.

Đối với việc vệ sinh khi vắt sữa, phần lớn các hộ thực hiện rất đơn giản bằng cách rửa bầu vú bằng nước giếng, sau đó dùng khăn lau cho khô. Có hộ sử dụng khăn sạch riêng cho từng con, nhưng phần lớn dùng một khăn cho cả đàn. Còn đối với người vắt sữa thuê có khi sử dụng một khăn cho nhiều hộ, do đó rất dễ làm bệnh viêm vú lây lan. Người vắt sữa chỉ rửa tay bằng nước giếng trước khi vắt sữa, không rửa với xà phòng hay dung dịch thuốc sát trùng. Không có hộ nào sát trùng vú bò trước khi vắt sữa và chưa đến 5% số hộ sử dụng thuốc sát trùng nhúng núm vú sau khi vắt.

Việc kiểm tra bầu vú và sữa trước khi vắt sữa cũng chưa được người chăn nuôi hay người vắt sữa thuê quan tâm đúng mức. Thường họ vắt bỏ những tia sữa đầu xuống nền chuồng, không có dụng cụ riêng hứng kiểm tra những tia sữa đầu, ngay cả khi bò bị viêm vú lâm sàng cũng không có dụng cụ chứa sữa riêng mà vắt bỏ xuống nền chuồng rồi dội nước, do đó rất dễ làm bệnh viêm vú lây lan trong đàn.

2. 
   KẾT QUẢ KHẢO SÁT VIÊM VÚ
   
   1. 
      Viêm vú tiềm ẩn
      
      1. 
         Tỉ lệ bò và thùy vú bị viêm tiềm ẩn