Giới thiệu chung về chất dẻo sinh học và PHAs

Chất dẻo là các hợp chất cao phân tử, còn được gọi là nhựa hoặc polyme. Chúng có khả năng bị biến dạng khi chịu tác dụng của nhiệt độ, áp suất và vẫn giữ được sự biến dạng đó khi thôi tác dụng. Chất dẻo sinh học (bioplastic) là một nguồn vật liệu polyme mới đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Không chỉ được tổng hợp từ thực vật và các loài ngũ cốc quen thuộc trong đời sống hàng ngày như ngô, lúa mì, củ cải, khoai tây, dầu đậu nành,…chất dẻo sinh học còn có nguồn gốc từ các loài VSV, trong đó có tảo lam Spirulina (Arthrospira). Chất dẻo sinh học có thời gian phân hủy khá nhanh trong môi trường. Nếu như chất dẻo truyền thống như polyetilen (PE) phải mất gần bốn thế kỷ mới hoàn toàn bị thoái hóa thì việc trộn lẫn PE với chất dẻo sinh học, thời gian thoái hóa rút ngắn chỉ còn 4 đến 5 năm trong điều kiện môi trường bình thường, thậm chí chỉ còn 20 ngày nếu trộn lẫn với phân hữu cơ compost và ủ trong điều kiện nhiệt độ khoảng 50 - 60⁰C với sự có mặt các vi khuẩn ưa nhiệt [71].

Chất dẻo sinh học có đặc tính của hợp chất polyme giống như chất dẻo thông thường như: có trọng lượng phân tử lớn, có tính chịu nhiệt và đàn hồi cao. Tuy nhiên, chất dẻo sinh học có những ưu điểm hơn hẳn so với chất dẻo thông thường như: khả năng tái sử dụng cao, có thể thay thế các nguồn nhiên liệu truyền thống là dầu mỏ và lợi thế quan trọng nhất là không gây ô nhiễm môi trường do có nguồn gốc chủ yếu từ thực vật, các loại VSV và thời gian phân hủy tương đối ngắn. Chính vì những ưu điểm nổi trội này mà chất dẻo sinh học được coi là giải pháp tiết kiệm năng lượng trong quá trình sản xuất, làm giảm sự lệ thuộc vào dầu mỏ - một loại tài nguyên quý báu đang có nguy cơ cạn kiệt và có thể mở ra một kỷ nguyên công nghiệp mới [49].

Quá trình tổng hợp chất dẻo sinh học có thể chia thành 3 loại dựa vào nguồn nguyên liệu tổng hợp ban đầu:

+/ Dựa vào hợp chất polyme tự nhiên;

+/ Dựa vào quá trình lên men của thực vật;

+/ Tổng hợp trực tiếp từ VSV.

Chất dẻo sinh học bao gồm nhiều loại như: PLA (polylactic acid), PHAs (Poly-3-hydroxylalkanoates), aliphactic polyeste, polysaccarit, cellulose acetate, polyamide đang được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sản xuất công nghiệp [52].

Hiện nay trên thế giới có khoảng 60% bioplastic đang được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp dệt và công nghệ đóng gói. Năm 2002, bioplastic đã được các tập đoàn công nghiệp và điện tử lớn như Toyota, Fujitsu của Nhật Bản ứng dụng để chế tạo một số bộ phận thiết bị sử dụng cho ngành điện tử và công nghệ thông tin. Năm 2007, PLA cũng đã được sản xuất tại Hàn Quốc với công suất 5000 tấn/năm [85]. Các nghiên cứu về bioplastic ngày càng thu hút nhiều nhà khoa học trên thế giới. Năm 2009, các nhà khoa học tại Bắc Ai-Len đã nghiên cứu sử dụng thành công kỹ thuật mới để sản xuất chất dẻo sinh học từ cây chuối [84]. Năm 2010, các nhà khoa học thuộc Trung tâm Nghiên cứu Almaden của tập đoàn IBM ở Nam California (Mỹ) đã nghiên cứu thành công phương pháp sản xuất chất dẻo sinh học từ thực vật thân thiện với môi trường [78].

1.5.2 Giới thiệu về PHAs

1.5.2.1 Đặc điểm về cấu trúc

PHAs là một trong các loại chất dẻo sinh học, có bản chất là polyeste của hydroxyalkanoates. Lần đầu tiên PHAs được tìm thấy ở một loài vi khuẩn có tên là Bacillus megaterium năm 1926 [46]. Nhiều năm sau, PHAs bắt đầu được phát hiện trong cơ thể của nhiều loài VSV khác [40, 67, 27, 68]. PHAs được tổng hợp và giữ trong tế bào chất ở dạng không hòa tan, được coi là một dạng năng lượng dự trữ của tế bào [63]. Chúng có thể bị phân hủy nhờ quá trình trao đổi và xúc tác của enzym nội bào thành cacbon và giải phóng năng lượng, hỗ trợ dinh dưỡng cho tế bào. Trong tế bào, PHAs thường được giữ dưới dạng các hạt riêng biệt (granules), kích thước và số lượng của các hạt biến đổi tùy thuộc vào các loài VSV. Riêng trong một tế bào ở loài Alcaligenes eutrophus có khoảng 8-13 hạt với đường kính hạt tương ứng khoảng 0,2 – 0,5 µm quan sát được dưới kính hiển vi điện tử [29]. PHAs gồm hơn 150 monome, chiều dài mạch từ 3 – 14 nguyên tử cacbon với trọng lượng phân tử khoảng 50.000 – 1000.000 daltons [41].

Cấu trúc của PHAs được minh họa trên hình 3.



Hình 3. Cấu trúc của PHAs

[Nguồn: Ngô Thị Hoài Thu, 2006]

PHAs được chia thành hai nhóm tùy thuộc vào số nguyên tử cacbon trong phân tử:

+/ PHAs mạch ngắn: bao gồm 3 – 5 nguyên tử cacbon;

+/ PHAs mạch dài: bao gồm 6 – 14 nguyên tử cacbon.

PHAs có đặc tính của các polyme chịu nhiệt như trọng lượng phân tử lớn, độ đàn hồi cao, nhiệt độ nóng chảy từ 50 – 180⁰C [33]. Dựa vào số lượng nguyên tử cacbon trong phân tử, PHAs có thể chia thành nhiều loại như: poly (3-hydroxylbutyrate) (PHB), poly (3-hydroxyvalerate) (PHV) và poly (3-hydroxylbutyrate-co-3-3-hydroxyvalerate) (PH-PV). Tính chất vật lý _{của một vài dạng PHA và polypropylen được chỉ ra trên bảng 2.}

Cơ chế tổng hợp PHA gồm hai giai đoạn:

+/ Giai đoạn đầu là quá trình đồng hóa hoặc dị hóa nguồn cacbon như đường, axit béo. Tùy thuộc vào nguồn cacbon, sẽ có các enzym chuyển hóa tương ứng (3-hydroxyacyl-ACP-CoA transferase).

+/ Giai đoạn hai là quá trình trùng hợp các phân tử nhỏ (monomer) thành các phân tử lớn (polymer) nhờ xúc tác của enzym chìa khóa PHA synthase.

Quá trình tổng hợp PHA được chia thành bốn con đường khác nhau đặc trưng bởi nguồn cacbon được sử dụng. Tất cả bốn con đường trên đều có mặt enzym PHA synthase (pha C) – enzym chìa khóa cho quá trình sinh tổng hợp PHA. Cấu trúc của gen mã hóa cho PHA synthase của 40 chủng vi khuẩn Gram dương, Gram âm và cả ở tảo lam đều đã được xác định như ở Rhodobacter eutropha, Azotobacter caviae, Rhodobacter sphaeroides… PHA synthase của vi khuẩn lam thuộc tuýp III, bao gồm 2 tiểu phân nhỏ: tiểu phần C (ký hiệu pha C) và tiểu phần E (ký hiệu pha E). Trình tự và cấu trúc protein của 2 gen pha E và pha C đã được xác định ở một số loài như Chromatium vinosum, Thiocystis violaca và Synechococystics [36, 64]. Đến nay, rất nhiều công trình nghiên cứu về khả năng tổng hợp PHA của các chủng vi khuẩn như Bacillus spp., Alcaligenes spp., Pseudomonas spp., Aeromonas hydrophila, Rhodopseudomonas palustris, Escherichia coli, Burkholderia sacchari, Halomonas boliviensis, Halococcus saccharolyticus… đều đã được công bố trên thế giới [45, 50, 59, 69].

1.5.2.3 Ứng dụng của PHAs trong đời sống

Trong 2 – 3 thập kỷ qua, số lượng và chủng loại PHAs được sử dụng trong đời sống ngày càng được mở rộng. Cho đến nay, chỉ riêng tại châu Âu lượng PHAs tiêu thụ đã đạt khoảng 50.000 tấn/năm [33]. Trong nhóm PHA thì poly (3-hydroxybulyrate) (PHB) lẫn các copolyme của chúng như poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) có tầm quan trọng lớn và được tổng hợp nhiều nhất. P (HB-HV) đã được sử dụng làm film, các chai nhựa và có thể dùng làm nguyên liệu sản xuất giấy [48]. Ngoài ra, với khả năng tự phân hủy, P (HB-HV) cũng được sử dụng trong y học [44, 41, 70]. Sự phân hủy của PHB đã được phát hiện thấy trong các tế bào máu của người, vì vậy có thể sử dụng PHB trong các mô của động vật có vú mà không lo ngại đến khả năng bị ngộ độc. PHB và một số PHA khác thích hợp cho sử dụng làm bao bì và vật liệu tráng nhưng cũng dùng cho các mặt hàng vệ sinh như tã giấy hoặc băng vệ sinh [52].

Từ những năm 1980, hai loại PHAs là 3-hydroxybutyrate và 3-hydroxyvalerianacid đã được một công ty hóa chất lớn của Anh sản xuất trên thị trường với sản phẩm tên gọi là "Biopol". Sản phẩm này sau đó được phân phối từ công ty Monsanto và Metabolix tại Mỹ và tiếp tục được phát triển rộng rãi trên thế giới. Hiện nay, các tập đoàn công nghiệp sản xuất PHAs lớn trên thế giới gồm có: công ty Metabolix (Mỹ), công ty Biocycle (Brazil), công ty vật liệu sinh học Tianan thuộc tập đoàn Ningbo (Trung Quốc) [75] và thị trường châu Âu là nơi tiêu thụ chính. Cho đến nay, việc tìm kiếm các nguồn nguyên liệu tự nhiên có khả năng tổng hợp PHA đang ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên toàn thế giới. Theo nhiều nghiên cứu, hàm lượng PHA thu được trong quá trình sinh tổng hợp từ VSV có thể lên tới 80% so với trọng lượng khô của tế bào [31, 63]. Trong tế bào chất của một số loài thực vật bậc cao và tảo lam, enzym β-ketothiolase tham gia vào quá trình tổng hợp và tích lũy PHAs đã được phát hiện. Ở một số thực vật bậc cao và tảo lam, hàm lượng PHA được tích lũy có thể đạt 14% so với trọng lượng của tế bào nhờ áp dụng kĩ thuật chuyển gen vào thực vật. Ở điều kiện bình thường, hàm lượng PHA ở tảo lam chỉ đạt có 5% [58, 44, 64]. Chính vì vậy, nếu tận dụng các kĩ thuật hiện đại của công nghệ sinh học nhằm nâng cao hiệu suất tổng hợp PHAs từ các nguyên liệu tự nhiên không những mang lại hiệu quả kinh tế cao mà còn có ý nghĩa lớn trong bảo vệ môi trường.

Các môi trường nuôi cấy VSV như sau:

- Môi trường MPA (để xác định số lượng vi khuẩn dị dưỡng hiếu khí tổng số):

Nước thịt:	100 ml (hoặc cao thịt 3 g)
Pepton:	10 g
Thạch:	20 g
Nước:	1 lít

Tinh bột:	50 g
Pepton:	5 g
MgSO4.7H2O:	3 g
KH2PO4:	3 g
K2HPO4:	3 g
Cao nấm men:	1 g
Thạch:	20 g
Nước:	1 lít

Tinh bột:	20 g
K2HPO4:	0,5 g
MgSO4.7H2O:	0,5 g
NaCl:	0,5 g
KNO3:	1 g
FeSO4­:	0,01 g (Vết)
Thạch:	20 g
Nước:	1 lít

- Môi trường Czapecdox tinh bột (để xác định số lượng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột):

Tinh bột:	30 g
NaNO3:	3 g
MgSO4	0,5 g
KH2PO4:	1 g
KCl:	0,5 g
FeSO4­:	0,01 g (Vết)
Thạch:	20 g
Nước:	1 lít

Pepton:	4 g/l
Glucoza:	10 g/l
MgSO4:	1 g/l
Na2SO4:	7,5 g/l
NaCl:	1 g/l
MgCl2:	0,5 g/l
Thạch:	12 g/l
Fe2(SO4)3.6H2O hoặc (NH4)2SO4:	0,05 g/l

• 
  _{Thành phần môi trường SOT dùng để giữ giống tảo lam Spirulina platensis CNTĐB được chỉ ra trong bảng 3.}
  

H3BO3 :	2,86 g
MnSO4.7H2O:	2,5 g
ZnSO4.7H2O:	0,222 g
CuSO4.5H2O:	0,079 g
Na2MoO4.2H2O:	0,021 g

Cách pha môi trường SOT: Cân các hoá chất của dung dịch A và B định mức đến 1 lít tương ứng. Khử trùng dung dịch A và B ở điều kiện 121⁰C trong 15 phút. Sau đó phối trộn 1 thể tích dung dịch A với 1 thể tích dung dịch B với nhau.

- Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: Các thiết bị đã được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm: kính hiển vi quang học Olympus CH 02 (Nhật Bản), cân kỹ thuật Precisa XB 1200C, cân phân tích Precisa XT 220A, máy đo mật độ quang học UV-1601 Shimazu (Nhật Bản), tủ sấy Cornthem (New Zealand), máy lắc IKA KS 260 basic (Đức), máy ly tâm Sorvall ^(R) (Đức), box cấy vô trùng Lamin Air, Holten loại HH48-OSI (Đức), máy ảnh kĩ thuật số Canon IXY Digital 70 (Nhật Bản), máy phân tích sắc ký khí với đầu dò JGC-20K (Nhật Bản)_, đèn ống UV loại MEDICOM, BLF-12, 220V, 50 Hz, 30 Wat của Hungari sử dụng với bước sóng 254nm và các dụng cụ thuỷ tinh gồm các bình tam giác, pipet, ống nghiệm, đĩa petri (đường kính 10 cm).

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xác định số lượng các nhóm VSV trong nước thải và trong bùn hoạt tính

2.2.1.1 Phương pháp xác định vi sinh vật hiếu khí phân giải tinh bột tổng số

Chuẩn bị các môi trường nuôi cấy VSV, sau đó môi trường được đun tới khi tan hết tinh bột và thạch. Tiếp theo, môi trường được chuyển vào các bình tam giác, được khử trùng ở điều kiện 0,8 atm ở 121⁰C trong 30 phút. Sau khi khử trùng, để thạch nguội đến khoảng 50⁰C, tiến hành đổ ra đĩa petri. Lượng thạch đổ vào mỗi đĩa khoảng 15 – 20 ml, sau đó sấy khô mặt thạch trong tủ sấy trong 30 phút.

Lấy 1 ml mẫu nước thải sản xuất bún cho vào ống nghiệm đựng 9 ml nước cất vô trùng, được nồng độ pha loãng 10^-1. Tiến hành lắc đều ống nghiệm, sau đó lấy 1 ml dung dịch có nồng độ pha loãng 10^-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng, được nồng độ pha loãng 10^-2. Cứ tiếp tục như vậy tiến hành pha loãng đến độ pha loãng cần thiết. Sau đó, dùng pipet man lấy 50µl dung dịch mẫu nước thải đã pha loãng ở nồng độ cần thiết nhỏ vào chính giữa đĩa thạch đã chuẩn bị như đã nêu ở trên. Sau đó, các đĩa thạch được đậy lại và bao gói kín bằng giấy, đặt trong tủ ấm ở 28 - 30⁰C. Sau 2 – 5 ngày lấy đĩa ra quan sát và đếm số lượng khuẩn lạc đã mọc.

Công thức tính số lượng VSV (CFU/ml dung dịch) như sau:

A: Số khuẩn lạc mọc trên mặt thạch;

10ⁿ: Nghịch đảo nồng độ pha loãng;

X: Số lượng VSV (CFU/ml dung dịch);

CFU: là đơn vị hình thành khuẩn lạc.

2.2.1.2 Phương pháp xác định vi sinh vật kỵ khí phân giải tinh bột tổng số

- Xác định số lượng VSV kỵ khí theo phương pháp MPN (The Most Probable Number Method). Phương pháp MPN còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng VSV theo số lượng VSV có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm. Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp. Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của VSV cần kiểm định trong từng ống nghiệm, ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady (bảng 4) suy ra mật độ VSV được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu.

- Pha loãng mẫu nước thải: Dùng nước muối sinh lý (0,85% NaCl) để pha loãng. Cách pha loãng như sau: Lấy 0,5 ml mẫu nước thải và bổ sung thêm 4,5 ml nước muối sinh lý trên sẽ được dung dịch nước thải có nồng độ pha loãng 10^-1. Sau đó lại lấy 0,5 ml dung dịch này bổ sung thêm 4,5 ml nước muối sinh lý, khi đó được dung dịch nước thải có nồng độ 10^-2. Cứ tiếp tục như vậy, thu được nước thải với nồng độ pha loãng từ 10^-3 đến 10^-9.

- Cách cấy mẫu: Hút 1 ml dung dịch nước thải được pha loãng ở các nồng độ 10^-1 đến 10^-9, bổ sung vào môi trường thạch đã được đổ đầy ống nghiệm. Chú ý tránh tạo bọt khí, ống nghiệm được đậy chặt bằng nút cao su và dùng băng dính bọc ngoài nút. Sau đó, các ống nghiệm được để ở tủ ấm 37⁰C trong khoảng từ 7 – 10 ngày. Sau 3 ngày nuôi, có thể lấy mẫu ra quan sát khả năng mọc của các VSV kỵ khí. Khi đó vi khuẩn yếm khí mọc thành các khuẩn lạc nhỏ, màu trắng nằm rải rác trong thạch, ngoài ra, có khả năng một số mẫu có mặt các vi khuẩn sinh metan làm cho thạch bị nứt, đứt đoạn nhiều nơi. Tra bảng 4 để xác định số lượng VSV kỵ khí.