Nghiên cứu xác định Ciprofloxacin (cip) trong một số dược phẩm bằng phương pháp điện hóa

DPP = differential pulse polarography: kĩ thuật xung vi phân

AdSV = adsorptive stripping voltammetry: phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ

1.3.2 Phương pháp trắc quang

Các quinolones xác định bằng phương pháp trắc quang cho khoảng tuyến tính tuân theo định luật Lambert – Beer từ 3-10 ppm, nhiều phổ màu của nhóm quinolones được xác định dựa vào phản ứng tạo phức với sắt (III)

Ciprofloxacin và Norfloxacin khi xác định đồng thời cho độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 545 nm khi tạo phức với Palladium (II), eosin khi có mặt metyl xenlulo – đóng vai trò như một chất hoạt động bề mặt [11].

Dưới đây là bảng tóm tắt kết quả xác định một số quinolones bằng phương pháp trắc quang:

Theo [29] HPLC có ưu điểm rõ rệt là xác định được nồng độ chất ở nồng độ rất nhỏ đối với họ quinolones, phương pháp triết pha rắn cho khả năng xác định đến nồng độ cỡ 100pg/ml còn phương pháp HPLC xác định được đến nồng độ 2ng/ml. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong nhiều công nghệ xác định CIP ở các đối tượng khác nhau như các dung dịch lỏng trong cơ thể, huyết thanh, các mô động vật, thậm chí cả ở huyết tương. Phương pháp này còn phát triển xác định được các fluoroquinolones trong các vật liệu sinh học bao gồm. Tài liệu [32] xác định đồng thời ba chất ofloxacin, norfloxacin và ciprofloxacin trong tóc người bằng phương pháp HPLC sử dụng cột pha đảo C₁₈ và detector nhạy fluorescence kết hợp với kĩ thuật triết pha rắn các loại thuốc từ dung dịch hòa tan tóc trong NaOH1M. Phương pháp này xác định được hàm lượng các loại thuốc trong khoảng từ 0,3-100ng/ml. Nghiên cứu tóc của 6 sinh viên sử dụng đồng thời một, hai hay cả 3 loại fluoroquinolones này dựa vào trung bình mỗi tháng chiều dài tóc tăng 1cm, các tác giả xác định được hàm lượng các thuốc trong đoạn tóc mọc ở giai đoạn sử dụng thuốc này, giới hạn phát hiện tương ứng của ba loại thuốc là 0.2 ng/ml cho ofloxacin và norfloxacin, với sai số tương đối lần lượt cho từng loại là 10.0% và 9.9%, và 0.3 ng/ml cho ciprofloxacin, với sai số tương đối là 9.4%.

Các tác giả [35] sử dụng phương pháp sắc kí (HPLC) để xác định hàm lượng của ofloxacin trong mẫu huyết thanh, sử dụng các chất hấp phụ khác nhau như: ODS, C₈, C₁, CN, phenyl and tert.-butyl và mẫu huyết thanh sau khi đã được lọc bằng màng Molcut II để loại bỏ protein, phần nước lọc được làm giàu trên cột với pha tĩnh phenyl sau đó được dẫn đến cột phân tích với pha tĩnh là ODS. Ofloxacin và enoxacin được xác định bằng detector UV ở bước sóng  = 300 nm. Phương pháp cho phép xác định nồng độ của ofloxacin trong khoảng từ 50 – 2000 ng/ml, giới hạn phát hiện là 20 ng/ml. Hiệu suất thu hồi lượng ofloxacin đã thêm vào mẫu huyết thanh là 88 – 101,7% và hệ số phương sai nhỏ hơn 5,2%.

1.4 Ứng dụng của phương pháp điện hóa trong định lượng dược phẩm[8, 27].

Ứng dụng phương pháp điện hóa vào phân tích dược phẩm là một đề tài không còn mới mẻ trên thế giới, đã có rất nhiều công trình, đề tài nghiên cứu về vấn đề này với đối tượng là nhiều loại mẫu sinh học không chỉ là các mẫu thuốc, tài liệu [27] đã tóm tắt rất chi tiết các bước trong quá trình phân tích dược phẩm: cách phá mẫu, bảo quản dung dịch mẫu, các loại điện cực, các phương pháp phân tích… Tác giả tổng kết lại cách xác định 19 nhóm dược phẩm chính trong [27] từ các công trình đã được công bố từ năm 1998 đến năm 2002.

Trong các phương pháp điện hóa, phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ đực ứng dụng nhiều hiện nay vào phân tích môi trường, phân tích lâm sàng, phân tích thực phẩm. Đặc biệt trong phân tích dược phẩm, thuốc sinh học do khả năng hấp phụ của các chất dược học trên điện cực. Đây là điều kiện thuận lợi để hấp phụ làm giàu chúng lên bề mặt các điện cực. Giới hạn phát hiện rất thấp từ 10^-6 đến 10^-10 M. Hơn nữa, nhiều ion kim loại được khử trên điện cực Hg mà không tạo hỗn hống với Hg cũng được xác định bằng phương pháp này. Trước khi phân tích cho chúng tạo phức với một số phối tử hữu cơ có hoạt tính bề mặt để tập trung chất lên bề mặt cực, sau đó khử lớp chất hấp phụ đó (giai đoạn hòa tan) đồng thời ghi tín hiệu đường von – ampe.

Ưu điểm của phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ có thể phân tích được rất nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau. Hơn 200 hợp chất hữu cơ bao gồm một lượng lớn các chất sinh học, dược phẩm và một số ion có khả năng tạo phức với các phối tử hữu cơ đã được xác định bằng phương pháp này. Trong mỗi trường hợp phân tích cụ thể lại có các thông số làm việc, điều kiện làm việc, môi trường, pH, dung dịch nền, các phối tử khác nhau. Do đó cần phải tối ưu hóa các điều kiện xác định để thu được tín hiệu cao nhất. Đặc biệt là trong dung dịch phân tích phức tạp chứa nhiều loại chất khác nhau. Người ta đã chứng minh rằng bước làm giàu các chất phân tích hữu cơ, vô cơ sử dụng các điện cực biến tính có ứng dụng quan trọng trong phương pháp AdSV. Các chất phân tích được làm giàu bằng các nhóm chức gắn liền với bề mặt cực gồm có sự trao đổi ion, sự tạo phức hay liên kết cộng hóa trị. Phổ biến nhất là sử dụng chất trao đổi ion: poly(4-vinyl piridine) có khả năng hút các anion. Ví dụ: đimetylglyoxime được trộn vào điện cực than cácbon để xác định niken trong các môi trường phức tạp. Các loại phối tử khác nhau được sử dụng như đithizone, alkyl mercaptans, trocyl phosphine oxit hay 2,9-đimetyl-1,10-phenanthroline.

Trong số các loại dược phẩm một số lớp hợp chất đã được nghiên cứu rộng rãi. Đa số các benzođiazepine được nghiên cứu phân tích do nhóm này có những tính chất hấp phụ và liên kết benzođiazepine azomethine dễ bị khử. Một vài hợp chất đã được phân tích trong mẫu sinh học: Flunitrazepam được hấp phụ một điện cực biến tính bentonite từ các loại mẫu huyết thanh đã được pha loãng và nước tiểu người. Có thể xác định lượng tối thiểu 1,5 g/ml trong mẫu. Camazepan và bromazepan cũng được phân tích trong huyết thanh người bằng cách sử dụng điện cực HMDE. Với điều kiện triết dung dịch trước, giới hạn phát hiện tương ứng của camazepan và bromzepan là 20 và 200 mg/ml trong mẫu huyết thanh.

Một số các dẫn xuất phenothiazine, promethazine, diethazine, trifluorerazine và fluphenazine được cô đọng lại qua quá trình chiết hấp phụ lên điện cực graphite. Sự xác định các loại hợp chất này trong mẫu nước tiểu và huyết tương không cần xử lý sơ bộ, nhưng với điện cực được mạ lớp màng Spectrapor để trách được sai số do điện cực vì khả năng hấp phụ các protein. Nhờ đó mà nâng cao được độ nhạy từ 10^-5 đến 5.10^-8 M trong khoảng thời gian làm giàu 15 phút.

Sự oxi hóa các loại thuốc chống suy nhược cơ thể vòng càng, imipramine, desipramine và trimipramine làm giàu từ các loại mẫu nước tiểu ở bề mặt điện cực cacbon thủy tinh và điện cực than nhão thì sự chuyển động điện cực là cần thiết để loại bỏ ảnh hưởng của một số chất điện hoạt. Điện cực than nhão cacbon cũng được dùng làm giàu các loại hợp chất này qua quá trình chiết, hấp phụ.

Một hướng quan tâm lớn là xác định các loại thuốc chống ung thư. Ađriamycin được hấp phụ lên điện cực cacbon một cách đơn giản bằng cách ngâm điện cực trong mẫu, rửa và đặt nó trong dung dịch nền có pH = 4,5 rồi quét thế. Phương pháp phân tích nhanh (khoảng 10ph) cho phép xác định hàm lượng thuốc trong mẫu nước tiểu từ bệnh nhân bị ung thư.

Daunorubicin có thể được đo bằng cách khử hay oxi hóa dùng điện cực HMDE hay điện cực cacbon. Trong trường hợp này nếu phân tích mẫu nước tiểu đã được pha loãng không qua xử lí sơ bộ có thể dùng điện cực thủy ngân. Trong khi đó nếu sử dụng điện cực cacbon cần phải thay đổi môi trường và có độ nhạy thấp hơn.

Người ta chứng tỏ được rằng methotrexate có thể được xác định trực tiếp trong nước tiểu sau khi pha loãng mẫu với tỉ lệ 1:4 cùng với chất điện phân nền. Trường hợp này sử dụng điện cực HMDE nhưng trước khi xác định mẫu huyết thanh cần phải chiết trước, 5-fluorouracil có thể xác định được mà không bị ảnh hưởng bởi axit ascorbic (vitamin C) và axit uric thường xuyên có mặt trong mẫu sinh học.

Tóm lại phương pháp AdSV là một phương pháp rất có hiệu quả trong việc phân tích lượng vết các hợp chất vô cơ, hữu cơ, các loại thuốc trong phân tích dược phẩm. Đây là một phương pháp có độ nhạy rất cao, giới hạn phát hiện rất thấp, nhanh và đơn giản, kịp thời phát hiện ra những mầm mống gây bệnh để có biện pháp điều trị bệnh nhân có hiệu quả. Đặc biệt là trong việc nghiên cứu thử nghiệm tìm ra những loại thuốc mới điều trị được nhiều căn bệnh hiểm nghèo.

1.5 Xác định CIP bằng phương pháp điện hóa

1.5.1 Xác định ciprofloxacin bằng điện cực rắn

Tài liệu [30] xác định CIP cùng 5-aminosalixylic axit và azithromycin trong dung dịch rắn dạng vi tinh thể, dùng phương pháp von-ampe xác định vi tinh thể tĩnh là phương pháp dùng chủ yếu trong định lượng quặng, hợp kim và các chất tan hữu cơ đơn giản. 5-Aminosalixylic axit là hoạt chất dùng trong điều trị chứng viêm ruột, đại tràng, nó bị oxi hóa thành dạng quinone-imine trên điện cực cacbon, phản ứng này chính là cơ sở để xác định hợp chất trên trong thuốc và các mẫu sinh lý. CIP và azithromycin bị khử ở thế -1,4 V trên điện cực giọt thủy ngân và bị oxi hóa ở 0,95V trên điện cực cacbon dạng bột nhão và cả hai hợp chất này đều bị oxi hóa ỏ 0,75V trên điện cực cacbon. Các vi hạt rắn của ba loại chất trên là quá trình động học tĩnh trên điện cực cacbon đã được thấm parafin, khi nghiên cứu quá trình này bằng kĩ thuật quét sóng vuông và kĩ thuật von-ampe vòng để xác định hàm lượng của chúng, các tác giả đã xác định được 5-aminosalixylic axit bị oxi hóa ở 0,54V với phản ứng là thuận nghịch trên điện cực, trong khi CIP và azithromycin bị oxi hóa ở 1,2V và 0,94V, hai quá trình này đều bất thuận nghịch.

Tương tự theo các tác giả [29] chế tạo một điện cực cực nhạy bằng cách phủ lớp

vàng lên bề mặt phim phát điện làm bằng poly(pyrrole-NHS) người ta xác định được lượng vết CIP với nồng độ thấp tới 10pg/ml. Phương pháp điện hóa còn ứng dụng trong việc xác định độ hấp thụ của thuốc đối với quá trình trao đổi chất trong cơ thể. Tài liệu [20] dựa trên việc nghiên cứu phản ứng của CIP với DNA thông qua độ nhạy điện hóa của DNA, các tác giả xác định được hàm lượng của CIP trong khoảng nồng độ từ 40 – 80 M bằng phương pháp xung vi phân trong nền đệm axetat 0,2M pH = 5 trên điện cực glassy cacbon nhận dạng DNA, phương pháp cho peak oxi hóa ở vị trí +0,9V, giới hạn phát hiện đạt 24M.

Các chất ofloxacin, norfloxacin và ciprofloxacin với sự hỗ trợ của chemometric còn xác định được đồng thời trong cùng hỗn hợp bằng phương pháp von-ampe hấp thụ kĩ thuật xung vi phân trong nền đệm vạn năng (đệm Britton–Robinson) ở pH = 3,78 trên điện cực giọt thủy ngân treo. Theo [36] từ những năm 90 kĩ thuật cực phổ xung vi phân đã cho phép xác định CIP trong nền đệm vạn năng ở pH = 8,5, phương pháp cho hai peak ở thế -1,44 và -1,64V, xác định CIP ở nồng độ 6.10^-7 đến 3.10^-5M trong các mẫu thuốc với độ lệch chuẩn nhỏ hơn 0,4%.

Theo [21] dựa trên việc chế tạo điện cực chọn lọc ion đối với CIP: phủ một lớp bạc kim loại lên bản phim làm bằng chất dẻo PVC các tác giả đã xác định được hàm lượng CIP rất thành công trong các mẫu dược phẩm và dung dịch chuẩn của nó nhờ phương pháp thêm chuẩn. Cách làm này còn tỏ ra tương đối hiệu quả với một số các quinolones khác như 4-quinolone, ciprofloxacin (CF), pefloxacin (PF), norfloxacin (NF).

Phương pháp trắc quang xác định CIP đã được nghiên cứu rất nhiều trong các tài liệu, theo [33] CIP được xác định thông qua phản ứng tạo phức trao đổi điện tích với nhiều hợp chất như tetrachlorobenzoquinone, p-benzoquinone, p-nitrophenol, 2,3-dichloro-5,6-dicyano-p-benzoquinone, p-chloranil, tetracyanoquinodimethane và phản ứng tạo phức qua cặp ion với các chất bromocrezol hồng và bromophenol xanh, metyl da cam, bromothylmol xanh.

Nghiên cứu xác định dung dịch cân bằng giữa ion sắt (III) và CIP trong môi trường ion NO₃^- và môi trường mixen. Theo tài liệu [29] nghiên cứu dung dịch cân bằng của ion sắt (III) với CIP trong môi trường ion NO₃^- nồng độ 0,1 và 0,5M với sự có mặt của ion chất hoạt động bề mặt sodium dodecyl sulfate (SDS) hoặc cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), tiến hành đo bằng phổ UV-VIS với nồng độ SDS là 10mM hoặc nồng độ CTAB là 8mM, dung dịch sắt (III) được nghiên cứu trong khoảng nồng độ từ 1-5mM ở pH = 1,6 – 3,0. Nghiên cứu cho thấy sản phẩm chính tạo thành trong dung dịch là Fe(OH)₂⁺ và Fe₂(OH)₂⁴⁺ , nồng độ ion NO₃^- ảnh hưởng đến hằng số bền của các phức lớn hơn nồng độ của các chất SDS và CTAB. Sự tạo phức giữa ion sắt (III) và ciprofloxacin được nghiên cứu trong khoảng nồng độ của sắt là 0,15 – 0,58 mM với tỉ lệ 3:1 hoặc 10:1 trong khoảng pH=2-6. Công thức phức một điện tích dương của CIP xác định được bằng thực nghiệm là Fe(cipx)₂⁺, Fe(cipx)²⁺ and Fe(OH)cipx.

Tài liệu [19] xác định một số quinolones thông qua phản ứng tạo phức với ion sắt (III) trong môi trường axit sunfuric. Dựa trên phản ứng tạo phức của CIP và norfloxacin với sắt (III) trong môi trường axit sunfuric, các tác giả đo được độ hấp thụ quang cực đại của hai phức này lần lượt ở các bước sóng là 447 và 430nm, tỉ lệ giữa ion sắt (III) và CIP là 1:2 trong phức tạo thành với nồng độ H₂SO₄ là 5.10^-3M, phương pháp nghiên cứu được cho phép xác định hàm lượng các chất trên trong khoảng nồng độ tương ứng là 50 – 500 ppm và 50 – 400 ppm đối với CIP và norfloxacin.

Xác định CIP bằng phổ VIS thông qua phản ứng tạo phức với sắt (III) nitrat. Theo tài liệu [25] xác định CIP trong thuốc dạng viên nén và thuốc lỏng thông qua phản ứng tạo phức giữa CIP với thuốc thử Fe(NO₃)₃ 1% trong HNO₃ 1%, phức thu được có màu vàng da cam được xác định bằng phổ VIS ở bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại là 435nm và bền trong 60s. Khoảng nồng độ tuân theo định luật Lambert – Beer là 20 – 100 ppm, phương pháp xác định được chính xác hàm lượng CIP trong các vật liệu thô và các loại thuốc thương mại cả dạng viên nén và dạng dung dịch lỏng.


THỰC NGHIỆM

HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, THIẾT BỊ.

• 
  Thiết bị:
  

+ Điện cực làm việc: điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE)

+ Điện cực so sánh: điện cực Ag/AgCl

+ Điện cực phụ trợ: điện cực glassycacbon.

- Máy quang phổ UV VISABLE spectrophotometer 1061 PC và 1650 PC.

- Máy đo PH Hana.

- Các thiết bị khác : cân phân tích, máy khuấy.

• 
  Dụng cụ :
  

- Bình định mức : 25ml (20 chiếc), 50 ml, 100ml, 250ml, 500ml

- Cốc thủy tinh : 100ml và 250ml

- Pipét: 0,5ml; 0,2 ml ; 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml, 25ml.

- Buret 50ml.

- Các dụng cụ khác: phễu, đũa thủy tinh, cốc cân, giấy lọc, bếp điện…

• 
  Pha đệm vạn năng (Đệm Britton-Robinson) – hỗn hợp 3 axit CH₃COOH, H₃BO₃, H₃PO₄ (mỗi loại axit nồng độ 0,04M) và dung dịch NaOH 0,2M trộn với nhau theo các tỉ lệ để được các dung dịch đệm có các giá trị pH khác nhau.
  

• 
  Lấy 30 ml dung dịch CH₃COOH đặc định mức 250ml, sau đó chuẩn lại bằng dung dịch NaOH 0,1M ta được dung dịch CH₃COOH 2M. Pha loãng bằng nước để được các dung dịch loãng hơn.
  
• 
  Lấy 7,8ml dung dịch H₃PO₄ đặc định mức thành 250ml, sau đó chuẩn độ lại ta được dung dịch H₃PO₄ 0,5M. Pha loãng bằng nước để được các dung dịch có nồng độ loãng hơn.
  
• 
  Cân 6,484 g H₃BO₃ định mức thành 250ml ta được dung dịch H₃BO₃ 0,4M. Pha loãng bằng nước để được các dung dịch loãng hơn.
  

• 
  Pha đệm axetat pH = 3,8: Trộn các dung dịch CH₃COOH 2M và NaOH 0,2M theo một tỉ lệ nhất định, sau đó định mức thành 100ml để được dung dịch đệm axetat có pH = 3,8 và trộn ở cùng tỉ lệ này các nồng độ khác nhau của hai dung dịch trên để được các dung dịch đệm pH = 3,8 ở các nồng độ khác nhau.
  
• 
  Pha đệm photphat pH = 4,2: Trộn 0,4ml dung dịch Na₂HPO₄ 0,067M với 99,6ml dung dịch KH₂PO₄ 0,067M thêm nước thành 100ml ta được dung dịch đệm photphat pH = 4,2.
  
• 
  Pha đệm Citrat – HCl pH = 3,8: Trộn 26ml dung dịch muối natri citrat 0,1M với 24ml dung dịch HCl 1M ta được 50 ml dung dịch đệm citrat – HCl pH = 3,8.
  
• 
  Pha thuốc thử Fe(NO₃)₃ trong HNO₃1%:
  

• 
  Pha dung dịch HNO₃1%: lấy 4ml axit HNO₃ đặc định mức bằng nước cất thành 250ml được dung dịch HNO₃ 1%.
  
• 
  Cân chính xác 1,6694 g Fe(NO₃)₃ hòa tan trong axit HNO₃ 1% thành 100ml, thuốc thử vừa pha bảo quản trong lọ tối màu.
  

• 
  Pha các dung dịch ion chuẩn nồng độ 1000 ppm để khảo sát ảnh hưởng: Pb²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺.
  

• 
  Pha mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn CIP 500ppm (dung dịch S1) được chuẩn bị bằng cách cân chính xác 0,0516g Ciprofloxacin.HCl (nguồn gốc: trung tâm dược phẩm trung ương Huế) pha trong nước cất 2 lần định mức thành 100ml ta được dung dịch CIP 500ppm. Dung dịch CIP 500ppm bảo quản trong lọ tối màu để trong tủ lạnh dùng trong khoảng từ 3 – 4 tuần.
  
• 
  Pha loãng các dung dịch CIP nồng độ loãng hơn: Mỗi lần dùng chuẩn bị dung dịch CIP5ppm bằng cách hút 0,5ml dung dịch S1 định mức vào bình 50ml ta được dung dịch loãng hơn nồng độ 5ppm. Dung dịch 5ppm dùng cho phần điện hóa, còn dung dịch chuẩn dùng cho phần đo quang là dung dịch S1 không cần pha loãng nữa.
  

Khảo sát sự xuất hiện peak của CIP, chúng tôi tiến hành đo với:

• 
  Thông số máy:
  

• 
  Thành phần nền: Đệm axetat pH = 3,8 (0,075M).
  
• 
  Đo với 50ml dung dịch CIP ở hai nồng độ 0,05ppm và 0,2 ppm ta thu được:
  

Nền axetat, pH = 3,8 [CIP] = 0,05 ppm [CIP] = 0,2 ppm

Kết quả khảo sát CIP ở hai nồng độ trên điện cực giọt thủy ngân trên cho thấy peak của CIP xuất hiện trong khoảng -1,4 đến -1,5V, nồng độ càng cao peak càng chuyển dịch về phía âm hơn. Theo một số tài liệu tham khảo [36] người ta chưa xác định chính xác được peak này do nguyên tử nitơ nào bị khử những đã kiểm nghiệm rõ ràng được rằng sự xuất hiện peak này chắc chắn là do sự khử của một trong 3 nguyên tử N có trong CIP. Song với vị trí peak trong khoảng -1,4 đến -1,5V gần với sóng khử của hiđro thì peak xuất hiện phần nhiều là sóng xúc tác hiđro do cặp e tự do trên một nitơ trong môi trường axit pH < 4 đã nhận H⁺ sau đó chính proton này bị khử trên điện cực. CIP có 3 nitơ theo lí giải trên thì sẽ xuất hiện ba peak nhưng có lẽ do hiệu ứng liên hợp e vào vòng (nitơ số 1) và sự án ngữ không gian (cả nitơ số 1 và 2) làm cho cặp e tự do của các nitơ này khó hút H⁺ do đó sự nhận proton của nitơ số 3 là hợp lí và dễ dàng hơn cả, peak khảo sát được có thể là do sự khử H⁺ của nitơ số 3.

CIP + H⁺  (CIP)H⁺

(CIP)H⁺ + e  CIP + ½ H₂

Peak của CIP thu được trong môi trường axit dạng chân lệch, nghiêng về thế âm dần khi tăng nồng độ, peak nhọn đều trong nền đệm axetat và tù trong nền đệm vạn năng, các khảo sát cho thấy hoàn toàn phù hợp với kết quả đã công bố [36].