Mọi tài liệu ghi chép nếu không thể được kiểm tra lại thì cũng chỉ là những mảnh giấy vụn mà thôi

tải về 0.62 Mb.

trang	14/20
Chuyển đổi dữ liệu	30.08.2016
Kích	0.62 Mb.
	#29193

1 ... 10 11 12 13 14 15 16 17 ... 20

6.2MẪu vi sinh vẬt đã phân lẬp

Mẫu nấm hoặc vi khuẩn được lưu giữ với mục đích duy trì trạng thái sống của chúng mà không làm thay đổi đặc điểm hình thái, sinh lý cũng như di truyền trong một giai đoạn nhất định. Mẫu vi sinh vật hại được giữ ở trạng thái sống ít nhất là trong quá trình nghiên cứu hoặc có thể được giữ vô thời hạn, nhất là đối với các mẫu vi sinh vật chuẩn (ban đầu) hoặc các mẫu được đề cập đến trong các bài đã xuất bản. Nếu không có các mẫu vi sinh vật được giám định và lưu giữ, đặc biệt là vi khuẩn, thì không thể tiến hành so sánh, phân loại để định danh đơn vị phân loại mới.
Kể từ năm 1995, Công ước về Đa dạng sinh học được 180 nước trên Thế giới ký kết có hiệu lực đối với tất cả các mẫu vi sinh vật lưu giữ. Công ước này xác định chủ quyền của các nước có xuất xứ vi sinh vật, với mục đích bảo đảm sự công bằng và phân chia lợi nhuận bình đẳng đối với những nước muốn khai thác lợi ích kinh tế từ mẫu vi sinh vật đó. Việc trao đổi mẫu vi sinh vật giữa các trung tâm mẫu bệnh với nhau thường đòi hỏi phải có văn bản thỏa thuận chuyển giao mẫu - Material Transfer Agreement (MTA). Tuy nhiên, văn bản thỏa thuận chuyển giao mẫu giữa các trung tâm mẫu bệnh là không rõ ràng.Trên thực tế ở nhiều trung tâm lưu giữ mẫu, việc thực thi công tác này vẫn còn chưa tiến triển.
Không phải tất cả các phương pháp bảo quản mô tả sau đây đều phù hợp với các loài nấm và vi khuẩn phát triển trên môi trường nhân tạo. Đôi khi phải thử nghiệm và chấp nhận rủi ro để tìm ra phương pháp tốt nhất cho việc bảo quản mẫu vô thời hạn.

6.2.1Nuôi cấy trên môi trường agar

Mẫu vi sinh vật thường được giữ trong lọ McCartney 20 ml có cổ rộng để có thể dễ dàng cấy truyền khi cần. Nên sử dụng các môi trường nuôi cấy thích hợp, ví dụ như ½ PDA đối với nấm hoặc môi trường NA đối với vi khuẩn. Một số nấm và vi khuẩn đòi hỏi phải sử dụng các môi trường đặc biệt. Môi trường thường được đổ đến xấp xỉ ½ lọ trước khi tiệt trùng. Sau đó lọ được đặt nghiêng khi môi trường còn nóng để khi đông lại môi trường tạo thành mặt phẳng nghiêng.
Cấy nấm hoặc vi khuẩn vào mặt nghiêng của môi trường, sau khi vi sinh vật đã phát triển như mong muốn, bảo quản mẫu trong môi trường sạch, không bụi bặm ở 5 – 8^oC. Đối với một số nấm và vi khuẩn nhạy cảm với môi trường lạnh, nên bảo quản ở 15C. Mẫu vi sinh vật phải được theo dõi thường xuyên vì môi trường agar có thể bị khô rất nhanh trong điều kiện độ ẩm thấp. Khi bảo quản nấm phải rất cẩn thận để tránh nhện xâm nhập. Tất cả các lọ giữ mẫu phải được hàn kín miệng bằng màng nhựa hoặc nilon siêu mỏng trong suốt quá trình bảo quản mẫu. Mẫu vi sinh vật phải được cấy truyền sang môi trường mới 6 tháng 1 lần. Phải thật cẩn thận để không làm mất các mẫu vi sinh vật có giá trị mặc dù cấy truyền nhiều lần có thể dẫn đến những thay đổi về hình thái, mất khả năng ký sinh và giảm khả năng hình thành bào tử.

6.2.2Bảo quản bằng dầu khoáng

Phương pháp này đặc biệt có ích ở các vùng nhiệt đới vì nó có thể giữ cho mẫu vi sinh vật khỏi bị khô và tránh được sự xâm nhập của nhện. Cấy mẫu vi sinh vật như trên nhưng dùng lượng agar ít hơn. Muốn sử dụng phương pháp này, tiêu chuẩn quan trọng đối với mẫu vi sinh vật là phải phát triển khỏe mạnh, đối với nấm phải sản sinh rất nhiều bào tử. Đổ dầu khoáng lên trên mẫu vi sinh vật, ngập trên đỉnh mặt agar khoảng 1 cm. Tiệt trùng dầu khoáng trước khi sử dụng bằng cách hấp 2 lần ở 121C trong 15 phút.
Chia dầu khoáng thành nhiều lượng nhỏ để tránh lẫn tạp. Có thể dùng lọ McCartney có nắp nhựa, tuy nhiên chú ý để không làm đổ lọ vì dầu có thể chảy ra ngoài. Kỹ thuật này đơn giản, không đòi hỏi dụng cụ và hóa chất đắt tiền. Phương pháp này có thể bảo quản mẫu từ 2 - 40 năm, tuy nhiên lý tưởng nhất là nên cấy truyền sang lọ mới 5 năm 1 lần.

6.2.3Bảo quản trong nước vô trùng

Cắt các miếng agar tại đỉnh của các tản nấm phát triển sau 1 tuần nuôi cấy rồi đặt vào nước cất vô trùng trong lọ Wheaton 5 ml hoặc lọ McCartney 20 ml. Nắp được vặn chặt và hàn bằng nhựa hoặc bọc nilon siêu mỏng. Bảo quản lọ mẫu ở nhiệt độ phòng. Phương pháp này có thể bảo quản mẫu trong vài năm, đặc biệt phù hợp với bảo quản Pythium spp. và Phytophthora spp. Phương pháp này cũng có thể áp dụng đối với vi khuẩn. Dùng que cấy vi khuẩn vô trùng lấy các khuẩn lạc mọc sau 24-48 giờ đặt vào nước cất vô trùng.

6.2.4Bảo quản đông khô

Cơ chế của phương pháp này là loại bỏ hàm lượng nước trong mẫu vi sinh vật bằng cách giảm áp suất ở trạng thái đóng băng, quá trình này được gọi là thăng hoa. Thăng hoa xảy ra khi một dung dịch đóng băng chuyển hóa trực tiếp sang trạng thái khí, bỏ qua trạng thái lỏng.
Mẫu vi sinh vật sau khi đông khô được hàn lại và bảo quản trong các ống hoặc lọ thủy tinh nhỏ. Các nấm sản sinh nhiều bào tử là các nhóm phù hợp nhất với phương pháp bảo quản này. Phương pháp này cũng rất thích hợp với vi khuẩn. Mẫu vi sinh vật vẫn có thể sống sót sau 10 năm hoặc hơn. Tuy nhiên thiết bị làm đông khô khá đắt và việc duy trì bảo quản bằng phương pháp này cũng khá tốn kém. Đội ngũ cán bộ cũng yêu cầu phải có kinh nghiệm để chuẩn bị mẫu và vận hành hệ thống làm đông khô. Một trong những ưu điểm của phương pháp này là mẫu nấm được đông khô không cần bảo quản lạnh mà có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Sau khi làm đông khô, lấy một ống thủy tinh từ mỗi mẫu vi sinh vật mở ra và cấy truyền để kiểm tra khả năng sống sót và độ thuần vì không phải tất cả các loài đều sống sót qua quá trình này. Nhiều nấm bảo quản đông khô có thể được phục hồi bằng cách cấy một mẩu mẫu nấm khô lên một đĩa môi trường agar mới. Vi khuẩn và nấm men bảo quản đông khô cần phải có thời gian làm ẩm lại trong nước cất vô trùng (khoảng 30 phút) trước khi cấy lên môi trường agar.

6.2.5Bảo quản trong đất

Đất được rây mịn, đổ vào ½ các lọ McCartney 20 ml và sấy tiệt trùng bằng nhiệt (hoặc hấp 2 lần ở 121C trong 15 phút). Dung dịch bào tử được đổ vào đất vô trùng và giữ ở 20-25C trong khoảng 5-10 ngày. Sau đó giữ mẫu vi sinh vật trong tủ lạnh. Mẫu vi sinh vật có thể sống sót trong đất trong khoảng thời gian khá dài. Cấy lại vi sinh vật bằng cách dùng dao cấy vô trùng lấy một ít đất cấy lên môi trường thích hợp. Phương pháp này có thể sử dụng để bảo quản Fusarium spp., vì sau một thời gian trong môi trường agar Fusarium thường bị biến đổi.

6.2.6Bảo quản bằng silica gel

Tạo dung dịch bào tử nấm và tế bào vi khuẩn từ sữa không béo 5% (w/v) sau đó đổ dung dịch nấm hoặc vi khuẩn lên silica gel vô trùng đã để nguội. Dùng 6-22 lưới silica gel tinh lọc không chỉ thị đổ vào ½ lọ thủy tinh có nắp vặn và tiệt trùng trong tủ sấy. Làm khô silica gel ở nhiệt độ phòng cho đến khi các hạt tinh thể tách rời nhau sau 14 ngày. Vặn chặt nắp và giữ lọ trong tủ lạnh phía trên silica gel chỉ định với nhiệt độ khoảng 4- 6^oC. Khi cần cấy lại, đặt một vài tinh thể silica lên môi trường phù hợp. Phương pháp này có thể duy trì sự sống của vi sinh vật tới 11 năm tùy thuộc từng loài. Phương pháp này phù hợp cho các vi sinh vật sống sót trong môi trường bảo quản đông khô, bao gồm cả các dạng sợi nấm sản sinh ra thể hạch hoặc các hậu bào tử.

6.2.7Bảo quản trên giấy thấm

Đặt một miếng giấy thấm lên 1 đĩa Petri và thấm ướt miếng giấy bằng vài giọt nước cất đã tiệt trùng. Cắt các mẩu agar từ môi trường nấm thuần đặt lên trên miếng giấy, sau đó đặt đĩa Petri vào tủ định ôn ở 25C cho đến khi nấm phát triển bao phủ toàn bộ miếng giấy thấm. Khi miếng giấy thấm đã khô hoàn toàn (khoảng 2-4 tuần để trong tủ định ôn), dùng kéo vô trùng cắt miếng giấy thành từng mẩu rồi để vào các lọ đựng mẫu nhỏ, có nắp. Bảo quản mẫu trong tủ lạnh 4^oC. Khi muốn cấy lại mẫu, gắp 1-2 mẩu giấy lọc cấy lên môi trường PDA. Sau 2 – 4 ngày có thể nhìn thấy nấm phát triển. Phương pháp này thường áp dụng để bảo quản các loài Fusarium.

6.2.8Bảo quản lạnh sâu

Bảo quản vi sinh vật trong tủ lạnh sâu ở nhiệt độ thấp từ -20°C tới –85°C (bảo quản lạnh sâu) là phương pháp bảo quản ưu việt đối với hầu hết loài nấm, vi khuẩn và virus. Một trong các hệ thống bảo quản lạnh phổ biến nhất và đơn giản nhất đối với nấm và vi khuẩn là việc sử dụng các hạt gốm rỗ (cryobeads) đặt vào dung dịch chất lỏng bảo quản lạnh, như glycerol, trong các lọ nhựa nhỏ. Sau khi cấy lại, dùng pipet vô trùng hút bớt các dung dịch thừa rồi đặt lọ dựng mẫu vào tủ lạnh sâu. Khi muốn cấy lại vi sinh vật, chỉ cần lấy một trong các hạt gốm và cấy lên môi trường lỏng hoặc quệt lên bề mặt của môi trường rắn thích hợp.

6.2.9Bảo quản bằng nitơ lỏng

Bảo quản vi sinh vật ở nhiệt độ cực thấp từ –190°C đến -196°C trong hoặc trên nitơ lỏng (cũng là một dạng của bảo quản lạnh sâu) là phương pháp bảo quản tốt nhất đối với hầu hết các loài nấm và vi khuẩn. Xử lý mẫu vi sinh vật phân lập, dịch mô hoặc dịch bào tử vi sinh vật bằng chất bảo quản lạnh, ví dụ như glycerol 10% (trộn lẫn với dung dịch chất giàu dinh dưỡng nếu xử lý vi khuẩn), trước khi chuyển sang ống vô trùng và làm lạnh tới nhiệt độ cực thấp trong giai đoạn bay hơi nitơ lỏng. Tốc độ làm lạnh có ý nghĩa rất quan trọng trong toàn bộ quá trình, vi sinh vật đạt tỷ lệ sống sót cao nhất khi quá trình làm lạnh diễn ra chậm. Ở nhiệt độ cực thấp, quá trình trao đổi chất bị ức chế, nếu vi sinh vật sống sót sau bước làm lạnh đầu tiên thì mẫu có thể được lưu giữ vô thời hạn bằng cách này. Phương pháp này đòi hỏi phải có trang thiết bị đắt tiền và nguồn nitơ lỏng sẵn có. Đội ngũ cán bộ làm việc này cũng cần phải có kinh nghiệm để duy trì các điều kiện tối ưu cho công tác bảo quản mẫu vi sinh vật.

tải về 0.62 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:

1 ... 10 11 12 13 14 15 16 17 ... 20