Tõ kÕt qu¶ ®Þnh typ huyÕt thanh trong b¶ng 7, x¸c ®Þnh ®îc 29 chñng E. coli d¬ng tÝnh víi bé kh¸ng huyÕt thanh chuÈn.
3.1.5. X¸c ®Þnh ®éc lùc cña tõng chñng E. coli ®· ph©n lËp
Chóng t«i tiÕn hµnh thö ®éc lùc cña 29 chñng nµy trªn chuét b¹ch 18 - 20 gam theo ph¬ng ph¸p sau: tiªm dÞch nu«i cÊy sèng (nu«i cÊy 370C/24 giê) cña tõng chñng theo hai ®êng lµ tiªm díi da vµ phóc xoang, theo dâi trong vßng 7 ngµy. KÕt qu¶ ®îc tr×nh bµy ë b¶ng 8.
Tiªu chuÈn ®¸nh gi¸ ®èi víi mét chñng E. coli cã ®éc lùc hay kh«ng cña chóng t«i ®a ra lµ: ph¶i cã kh¶ n¨ng g©y chÕt chuét tèi thiÓu lµ 1ml/con víi liÒu tiªm theo ®êng díi da, cßn tiªm theo ®êng tiªm phóc xoang th× tèi thiÓu lµ 0,2 ml/con. Dùa vµo tiªu chuÈn trªn chóng t«i lùa chän ra ®îc 13 chñng cã ®éc lùc trªn chuét ®ã lµ: E3, E7, E9, E12, E14, E15, E19, E20, E22, E24, E25, E27, E28.
B¶ng 8: KÕt qu¶ thö nghiÖm ®éc lùc cña tõng chñng ®· ph©n lËp trªn chuét
Chñng
|
Sè chuét chÕt/tiªm
|
Ghi chó
|
§êng tiªm díi da (ml)
|
§êng tiªm phóc xoang (ml)
|
LiÒu 0,2
|
LiÒu 0,4
|
LiÒu 0,6
|
LiÒu 1,0
|
LiÒu 0,025
|
LiÒu 0,05
|
LiÒu 0,1
|
LiÒu 0,2
|
E1
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
E2
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
E3
|
2/4
|
3/4
|
4/4
|
4/4
|
0/4
|
2/4
|
4/4
|
4/4
|
|
E4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
E5
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
E6
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
E7
|
1/4
|
3/4
|
4/4
|
4/4
|
0/4
|
1/4
|
3/4
|
4/4
|
|
E8
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
E9
|
1/4
|
3/4
|
4/4
|
4/4
|
0/4
|
1/4
|
3/4
|
4/4
|
*
|
E10
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
E11
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
E12
|
0/4
|
0/4
|
3/4
|
4/4
|
0/4
|
0/4
|
2/4
|
4/4
|
|
E13
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
E14
|
0/4
|
0/4
|
4/4
|
4/4
|
0/4
|
0/4
|
3/4
|
4/4
|
*
|
E15
|
0/4
|
0/4
|
2/4
|
3/4
|
0/4
|
1/4
|
3/4
|
4/4
|
|
E16
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
E17
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
E18
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
E19
|
1/4
|
2/4
|
4/4
|
4/4
|
0/4
|
0/4
|
1/4
|
3/4
|
*
|
E20
|
0/4
|
0/4
|
2/4
|
4/4
|
0/4
|
1/4
|
3/4
|
4/4
|
*
|
E21
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
E22
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
2/4
|
0/4
|
2/4
|
3/4
|
4/4
|
*
|
E23
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
E24
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
2/4
|
0/4
|
0/4
|
2/4
|
4/4
|
*
|
E25
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
3/4
|
*
|
E26
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
E27
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
2/4
|
0/4
|
0/4
|
3/4
|
4/4
|
*
|
E28
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
3/4
|
*
|
E29
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
0/4
|
|
* Chuét tiªm theo ®êng díi da ®Òu cßn sèng nhng bÞ loÐt da nÆng
Ngoµi ra, kÕt hîp víi Trung t©m ChÈn ®o¸n Thó y Trung ¬ng, sö dông kü thuËt PCR, chóng t«i cßn x¸c ®Þnh ®îc sù cã mÆt cña c¸c gen ®éc tè cña E. coli nh ®éc tè LT, ST (STa, STb) vµ VT (VT2e) trong c¸c chñng nµy.
KÕt qu¶ x¸c ®Þnh gen ®éc tè theo phiÕu xÐt nghiÖm (phô lôc 03)
Nh vËy, tõ 29 chñng ®· ph©n lËp ®îc, qua viÖc x¸c ®Þnh ®éc lùc cña tõng chñng. Chóng t«i ®· chän läc ra ®îc 13 chñng cã ®éc lùc, tiÕp theo chóng t«i ®i s©u vµo nghiªn cøu tÝnh kh¸ng nguyªn cña c¸c chñng nµy.
3.1.6. X¸c ®Þnh tÝnh kh¸ng nguyªn cña tõng chñng E. coli ®· ph©n lËp
Tríc tiªn, víi tõng chñng, chóng t«i chÕ t¹o kh¸ng nguyªn ®Ó tiªm miÔn dÞch cho chuét b¹ch víi liÒu 0,5ml/con theo ®êng tiªm díi da, mçi chñng 4 con. Sau 21 ngµy tiÕn hµnh lÊy m¸u c¸c chuét ®· tiªm vµ x¸c ®Þnh hiÖu gi¸ ngng kÕt cña huyÕt thanh b»ng ph¶n øng ngng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh víi kh¸ng nguyªn chÝnh nã. KÕt qu¶ cña ph¶n øng ®Þnh lîng huyÕt thanh ®îc thèng kª ë b¶ng 9.
B¶ng 9: KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tÝnh kh¸ng nguyªn cña c¸c chñng
HuyÕt thanh
|
HiÖu gi¸ ph¶n øng ngng kÕt
|
Tõng con
|
Trung b×nh
|
Chuét tiªm E3
|
1/128, 1/64, 1/64, 1/128
|
1/96
|
Chuét tiªm E7
|
1/128, 1/256, 1/512, 1/512
|
1/352
|
Chuét tiªm E9
|
1/32, 1/64, 1/64, 1/32
|
1/48
|
Chuét tiªm E12
|
1/128, 1/64, 1/64, 1/64
|
1/80
|
Chuét tiªm E14
|
1/128, 1/128, 1/64, 1/128
|
1/112
|
Chuét tiªm E15
|
1/4, 1/4, 1/8, 1/8
|
1/6
|
Chuét tiªm E19
|
1/512, 1/256, 1/512, 1/512
|
1/448
|
Chuét tiªm E20
|
1/4, 1/4, 1/2, 1/8
|
1/4,5
|
Chuét tiªm E22
|
1/128, 1/128, 1/64, 1/128
|
1/112
|
Chuét tiªm E24
|
1/4, 1/4, 1/2, 1/8
|
1/4,5
|
Chuét tiªm E25
|
1/256, 1/128, 1/64, 1/256
|
1/176
|
Chuét tiªm E27
|
1/32, 1/64, 1/64, 1/128
|
1/72
|
Chuét tiªm E28
|
1/128, 1/256, 1/256, 1/128
|
1/192
|
Chuét §C
|
1/2, 1/4, 1/2, ©m, N
|
1/1,8
|
* Chuét ®èi chøng tiªm m«i trêng nu«i cÊy vi khuÈn
Qua b¶ng sè liÖu trªn ta thÊy:
-
Cã 10 chñng/13 chñng g©y cho chuét cã hµm lîng kh¸ng thÓ kh¸ cao (hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ tõ 1/48 trë lªn), thÓ hiÖn tÝnh kh¸ng nguyªn tèt cña c¸c chñng E. coli nµy.
-
Trong sè 13 chñng nµy chØ cã 3 chñng cã tÝnh kh¸ng nguyªn rÊt yÕu, thÓ hiÖn qua hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh chuét kh«ng cao h¬n nhiÒu so víi huyÕt thanh cña chuét ®èi chøng, ®ã lµ c¸c chñng E15, E20, E24, do ®ã chóng t«i t¹m thêi lo¹i bá chñng nµy.
Qua viÖc x¸c ®Þnh tÝnh kh¸ng nguyªn cña tõng chñng E. coli ph©n lËp ®îc, chóng t«i ®· chän ®îc 10 chñng E. coli ®¶m b¶o ®îc c¸c ®Æc tÝnh sau: lµ E. coli g©y bÖnh cho lîn, cã ®éc tÝnh cao vµ cã tÝnh kh¸ng nguyªn tèt. §Ó tiÖn cho viÖc theo dâi, chóng t«i ®Æt tªn cho c¸c chñng lµ Hanco 1, Hanco 2, Hanco 3, Hanco 4, Hanco 5, Hanco 6, Hanco 7, Hanco 8, Hanco 9, Hanco 10. §Æc ®iÓm kh¸ng nguyªn vµ ®éc lùc cña 10 chñng ®îc tæng kÕt trong b¶ng 10.
B¶ng 10: §Æc ®iÓm kh¸ng nguyªn vµ ®éc lùc cña bé gièng E. coli ph©n lËp ®îc
STT
|
Tªn gièng
|
Kh¸ng nguyªn
|
§Æc ®iÓm
|
Ghi chó
|
MC
|
Dung huyÕt
|
§éc lùc
(liÒu giÕt chuét b¹ch)
|
1
|
Hanco 1
|
K98
|
§Æc trng
|
+
|
2,4.108CFU/dd (~0,2ml)
|
|
2
|
Hanco 2
|
987P
|
§Æc trng
|
+
|
1,2.108CFU/dd (~0,2ml)
|
|
3
|
Hanco 3
|
O141 K85ab
|
§Æc trng
|
+
|
1,8.108CFU/dd (~0,2ml)
|
|
4
|
Hanco 4
|
O149 K91
|
§Æc trng
|
+
|
5,9.108CFU/FX (~0,6ml)
|
|
5
|
Hanco 5
|
O8
K87
|
§Æc trng
|
++
|
2,8.108CFU/dd (~0,6ml)
|
|
6
|
Hanco 6
|
K99
|
§Æc trng
|
++
|
1,66.108CFU/dd (~0,2ml)
|
|
7
|
Hanco 7
|
K88
|
§Æc trng
|
+
|
7,9.108CFU/dd (~1ml)
3,16.108CFU/fx (~0,4ml)
|
|
8
|
Hanco 8
|
F4, Sta, Stb
|
§Æc trng
|
+++
|
3,4.108CFU/FX (~0,2ml)
|
|
9
|
Hanco 9
|
Vt2e, F18
|
§Æc trng
|
+++
|
1.109CFU/dd (~1ml)
1.108CFU/FX (~0,1ml)
|
|
10
|
Hanco 10
|
Vt2e, F18,LT
|
§Æc trng
|
+++
|
1.108CFU/FX (~0,2ml)
|
|
3.2. Nghiªn cøu kh¶ n¨ng s¶n sinh ®éc tè Cña c¸c chñng E. coli
Nh ë trªn ®· tr×nh bµy, ®éc tè cña E. coli còng lµ mét trong nh÷ng thµnh phÇn chÝnh g©y bÖnh tiªu ch¶y vµ sng phï ®Çu ë lîn. V× vËy, môc tiªu cña chóng t«i trong nghiªn cøu nµy ngoµi viÖc chÕ t¹o kh¸ng thÓ chèng l¹i c¸c kh¸ng nguyªn th©n cña vi khuÈn, cßn ph¶i chÕ t¹o ®îc c¸c kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu ®Ó trung hßa ®éc tè cña vi khuÈn. §Ó cã thÓ chÕ t¹o ®îc kh¸ng thÓ kh¸ng ®éc tè, bíc ®Çu tiªn lµ chÕ t¹o ®îc kh¸ng nguyªn ®éc tè an toµn ®Ó miÔn dÞch cho ®éng vËt thÝ nghiÖm.
3.2.1. Nghiªn cøu ®éng th¸i sinh trëng cña E. coli
Tõ bé gièng gåm 10 chñng E. coli ph©n lËp ®îc, chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu ®éng th¸i sinh trëng cña vi khuÈn trong ®iÒu kiÖn nu«i cÊy nh©n t¹o. Chóng t«i nu«i cÊy 10 chñng E. coli ë ®iÒu kiÖn 370C, sau ®ã theo dâi sù biÕn ®éng vÒ sè lîng vi khuÈn vµ pH sau 24, 48 vµ 72 giê nu«i cÊy. KÕt qu¶ ®îc tr×nh bµy ë b¶ng 11.
B¶ng 11: §éng th¸i sinh trëng cña c¸c chñng E. coli trong bé gièng ®· chän
Chñng E. coli
|
Thêi gian nu«i cÊy (®iÓm kh¶o s¸t)T
|
0h (1)
|
24h (2)
|
48h (3)
|
72h (4)
|
Hanco 1
|
CFU(107/ml)
|
0
|
142.0
|
85.5
|
52.25
|
pH
|
7.2
|
5.62
|
7.01
|
7.31
|
Hanco 2
|
CFU(107/ml)
|
0
|
115
|
83.5
|
52
|
pH
|
|
5.76
|
6.46
|
7.73
|
Hanco 3
|
CFU(107/ml)
|
0
|
129.5
|
75.5
|
22.6
|
pH
|
7.2
|
5.72
|
6.01
|
7.81
|
Hanco 4
|
CFU(107/ml)
|
0
|
103.5
|
73.9
|
32.5
|
pH
|
7,2
|
5.61
|
6.03
|
6.21
|
Hanco 5
|
CFU(107/ml)
|
0
|
107
|
74.9
|
40
|
pH
|
7,2
|
5.66
|
5.98
|
6.39
|
Hanco 6
|
CFU(107/ml)
|
0
|
108
|
74.6
|
39
|
pH
|
7,2
|
5.73
|
6.95
|
7.48
|
Hanco 7
|
CFU(107/ml)
|
0
|
26.5
|
18.7
|
16
|
pH
|
7,2
|
5.88
|
6.52
|
7.17
|
Hanco 8
|
CFU(107/ml)
|
0
|
141
|
98.5
|
64
|
pH
|
7,2
|
5.96
|
6.58
|
7.77
|
Hanco 9
|
CFU(107/ml)
|
0
|
129.5
|
62.1
|
35.7
|
pH
|
7,2
|
5.65
|
6.25
|
7.12
|
Hanco 10
|
CFU(107/ml)
|
0
|
132
|
68.5
|
24
|
pH
|
7,2
|
5.74
|
6.72
|
7.30
|
Chia sẻ với bạn bè của bạn: |