X¸c ®Þnh ®éc lùc cña E. coli theo ph­¬ng ph¸p cña Cater (1984) [64]

2.2.2.6. X¸c ®Þnh c¸c gen ®éc tè (LT, STa, STb vµ VT2e) b»ng ph­¬ng ph¸p PCR

• 
  ADN mÉu: khuÈn l¹c E. coli mäc trªn m«i tr­êng th¹ch m¸u ë 37⁰C/24h.
  
• 
  Hçn hîp ph¶n øng PCR:
  

Dung dÞch ®Öm (5 X): 5,0 l

Enzym (Taq polymerase): 0,5 l

N­íc khö ion võa ®ñ ®Ó ®¹t ®­îc thÓ tÝch cuèi cïng lµ 25l cho 1 ph¶n øng.

• 
  Chu tr×nh cña mét ph¶n øng PCR (Amplification): ph¶n øng PCR lµ mét chuçi gåm nhiÒu chu kú nèi tiÕp nhau. Mçi chu kú gåm 3 b­íc vµ ®­îc thùc hiÖn trong m¸y nh©n gen tù ®éng Perkin Elmer, theo b¶ng 1.
  
• 
  Ch¹y ®iÖn di: s¶n phÈm PCR thu ®­îc sau chu tr×nh ph¶n øng ®­îc nhuém víi chÊt nhuém nhá mÉu (loading dye), ®­îc trén vµo mÉu theo tû lÖ 1: 5. Sau khi nhuém, s¶n phÈm PCR ®­îc ch¹y ®iÖn di trªn th¹ch agarose 1%, trong dung dÞch ®Öm TAE (Tris - agartate - EDTA) víi hiÖu ®iÖn thÕ 100V trong vßng 40 phót.
  
• 
  Nhuém: gel th¹ch sau khi ch¹y ®iÖn di ®­îc nhuém mµu b»ng chÊt nhuém mµu huúnh quang Ethidium bromide (1l/ml) trong vßng 15 phót ®äc kÕt qu¶.
  

§äc kÕt qu¶ b»ng c¸ch quan s¸t d­íi ¸nh ®Ìn UV (300nm) vµ chôp ¶nh b»ng hÖ thèng Polaroid camera. Trªn ¶nh chôp nÒn ®en, c¸c ®o¹n axit nucleic hiÖn lªn ë d¹ng b¨ng mµu tr¾ng vµ cã thÓ chôp ¶nh ®­îc vµ ghi nhËn l¹i. KÝch th­íc c¸c b¨ng ADN ®­îc so s¸nh víi ADN chuÈn (ADN marker).

Dïng c¸c chñng E. coli ®· lùa chän nu«i cÊy trªn c¸c m«i tr­êng dinh d­ìng riªng tõng chñng ë 37^oC/24 giê, kiÓm tra ®Ëm ®é vi khuÈn, kiÓm tra thuÇn khiÕt, bÊt ho¹t b»ng nhiÖt ®é hoÆc hãa chÊt, kiÓm tra v« trïng, chia lä ®Ó sö dông.

Chóng t«i tiÕn hµnh thö nghiÖm tiªm miÔn dÞch cho 3 ®µn gµ thÝ nghiÖm, mçi ®µn theo mét qui tr×nh kh¸c nhau, sau ®ã ®Þnh kú hµng tuÇn kiÓm tra hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong m¸u gµ ®Ó t×m ra qui tr×nh hîp lý, cho hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong m¸u gµ cao nhÊt, æn ®Þnh nhÊt.

Dïng chuét b¹ch thÓ träng mçi con 18 - 20g, khoÎ m¹nh. Chia lµm 2 nhãm:

• 
  Nhãm 1: Mçi con tiªm 0,4 ml kh¸ng thÓ vµo phóc xoang; sau 24 giê tiªm lÇn hai cïng liÒu.
  
• 
  Nhãm 2: Kh«ng tiªm, lµm ®èi chøng.
  

TÝnh hiÖu sè cña sè l­îng chuét sèng sãt cña nhãm 1 (nhãm ®­îc tiªm miÔn dÞch b»ng kh¸ng thÓ) vµ sè l­îng chuét sèng sãt cña nhãm 2 (nhãm ®èi chøng).

Cã thÓ thùc hiÖn ph¶n øng ng­ng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh hay ng­ng kÕt chËm trong èng nghiÖm theo th­êng qui.

Pha lo·ng kh¸ng thÓ b»ng n­íc muèi sinh lý theo c¸c ®é pha lo·ng kh¸c nhau (theo cÊp sè 2).

LÊy mét l­îng kh¸ng thÓ ®· pha ë mçi hiÖu gi¸ vµ mét l­îng kh¸ng nguyªn E. coli b»ng nhau, trén ®Òu, ®Ó ë nhiÖt ®é kho¶ng 25⁰C. NÕu lµ ng­ng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh th× ®äc kÕt qu¶ sau 3-5 phót, nÕu lµ ng­ng kÕt chËm trong èng nghiÖm th× ®äc kÕt qu¶ sau 6-12 giê b»ng m¾t th­êng.

§èi chøng ©m lµm t­¬ng tù b­íc trªn nh­ng thay thÕ kh¸ng thÓ b»ng n­íc sinh lý. §èi chøng d­¬ng lµm t­¬ng tù b­íc trªn nh­ng thay thÕ kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm b»ng kh¸ng thÓ E. coli ®· biÕt.

2.2.7. Ph­¬ng ph¸p chÕ t¹o kh¸ng thÓ

Thu ho¹ch trøng, t¸ch lßng ®á, cho vµo lµm ®ång nhÊt b»ng m¸y, bæ sung dung m«i vµ chÊt b¶o qu¶n, ra chai, b¶o qu¶n.

C¸c mÉu ®­îc thu thËp ë 8 huyÖn cña 5 tØnh ®¹i diÖn cho 3 miÒn B¾c - Trung - Nam, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thu thËp ®­îc tæng sè 340 mÉu bÖnh phÈm ë lîn èm cã triÖu chøng m¾c bÖnh s­ng phï ®Çu vµ tiªu ch¶y do E. coli g©y nªn. C¸c lo¹i mÉu bÖnh phÈm chóng t«i thu thËp lµ: ph©n, lîn nguyªn con, tim, gan, ruét vµ h¹ch ruét cña lîn bÖnh. KÕt qu¶ cô thÓ trong b¶ng 2.

Tõ 340 mÉu bÖnh phÈm thu thËp ®­îc ë c¸c vïng, miÒn trªn c¶ n­íc, b­íc ®Çu chän läc E. coli, chóng t«i dïng m«i tr­êng ®Æc hiÖu cho E. coli lµ m«i tr­êng Mac Conkey. KÕt hîp víi c¸c m«i tr­êng kh¸c nh­ lµ m«i tr­êng th¹ch m¸u, m«i tr­êng n­íc thÞt, m«i tr­êng th¹ch th­êng, m«i tr­êng yÕm khÝ ®Ó chän ra nh÷ng chñng cã ®Æc ®iÓm gièng víi E. coli, lo¹i ®­îc nh÷ng vi khuÈn t¹p (kh«ng ph¶i lµ E. coli). KÕt qu¶ cô thÓ ®­îc thèng kª ë b¶ng 3.

Qua b¶ng 3 thÊy r»ng: tõ 340 mÉu bÖnh phÈm ë lîn cã dÊu hiÖu m¾c bÖnh s­ng phï ®Çu vµ Øa ch¶y do E. coli g©y nªn, trªn m«i tr­êng Mac Conkey ph©n lËp ®­îc 266 mÉu vi khuÈn cã ®Æc ®iÓm h×nh th¸i khuÈn l¹c gièng víi h×nh th¸i khuÈn l¹c E. coli (mµu hång c¸nh sen), chiÕm tíi 78,24%. Trong ®ã cao nhÊt lµ ë §ång Nai cã tû lÖ 85% vµ thÊp nhÊt lµ NghÖ An cã tû lÖ 68,0% mÉu vi khuÈn cã ®Æc ®iÓm h×nh th¸i khuÈn l¹c gièng víi E. coli.

B¶ng 3: KÕt qu¶ ph©n lËp E. coli tõ c¸c mÉu bÖnh phÈm

Do tÝnh chÊt rÊt hay thay ®æi cña E. coli, chóng t«i tiÕn hµnh ®«ng kh« ngay c¸c chñng ®· ph©n lËp ®­îc ®Ó ®¶m b¶o tÝnh nguyªn vÑn cña vi khuÈn, tr¸nh nh÷ng biÕn ®æi trong qu¸ tr×nh cÊy chuyÓn g©y nªn.

Sau khi s¬ bé ph©n lËp ®­îc 135 chñng vi khuÈn tõ c¸c mÉu bÖnh phÈm. Chóng t«i x¸c ®Þnh ®Æc tÝnh lªn men c¸c lo¹i ®­êng: sorbitol, arabinose, galactose, maltose, salicin, lactose, mannit, glucose, fructose, raffinose, saccharose, mannose. §ång thêi còng x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng sinh h¬i cña 135 chñng vi khuÈn ph©n lËp ®­îc. KÕt qu¶ cô thÓ nh­ sau:

§Æc ®iÓm sinh ho¸ cña E. coli lµ cã kh¶ n¨ng lªn men c¸c lo¹i ®­êng glucose, ®­êng lactose vµ mét sè ®­êng kh¸c, nh­ng kh«ng cã kh¶ n¨ng lªn men ®­êng saccharose còng nh­ ®­êng salicin. Qua b¶ng 4, ta thÊy tÊt c¶ c¸c chñng ph©n lËp ®­îc ®Òu cã ®Çy ®ñ c¸c tÝnh chÊt sinh ho¸ ®Æc tr­ng cña E. coli, do ®ã c¸c chñng nµy tiÕp tôc ®­îc x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng dung huyÕt trªn m«i tr­êng th¹ch m¸u.

Chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng dung huyÕt cña c¸c chñng theo ph­¬ng ph¸p sau: c¸c chñng E. coli ®­îc ria cÊy trªn m«i tr­êng Blood Agar Base cã bæ sung 10% m¸u bª, nu«i cÊy ë ®iÒu kiÖn 37­­^oC/18 - 24giê, ®äc kÕt qu¶. Kh¶ n¨ng g©y dung huyÕt ®­îc ®¸nh gi¸ theo 3 kiÓu lµ -haemolysin (ký hiÖu: ) ; -haemolysin (ký hiÖu: ) vµ ©m tÝnh (ký hiÖu: ­-). KÕt qu¶ cô thÓ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 5.

H×nh 1: H×nh ¶nh dung huyÕt cña E. coli

Sau khi x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng dung huyÕt cña c¸c chñng, chóng t«i cÊy 50 chñng nµy vµo m«i tr­êng th¹ch b¸n láng trong èng nghiÖm ch÷ U (cÊy ë mét ®Çu èng nghiÖm) nu«i ë ®iÒu kiÖn 37­­^oC, cø sau 6 tiÕng ®äc kÕt qu¶ 1 lÇn. KÕt qu¶ ®­îc ®¸nh gi¸ dùa vµo kh¶ n¨ng ph¸t triÓn cña vi khuÈn trong m«i tr­êng (cã thÓ thÊy râ b»ng m¾t th­êng). MÉu d­¬ng tÝnh lµ mÉu mµ vi khuÈn cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn ra m«i tr­êng xung quanh vµ ph¸t triÓn sang nh¸nh bªn cña èng nghiÖm ch÷ U. Cßn mÉu ©m tÝnh lµ mÉu mµ vi khuÈn kh«ng cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn ra m«i tr­êng xung quanh, chóng chØ cã thÓ ph¸t triÓn t¹i vÞ trÝ cÊy gièng, sau ®©y lµ kÕt qu¶ cô thÓ.

H×nh 2: TÝnh di ®éng cña E. coli

+ Nhãm cã kh¶ n¨ng di ®éng cã 32 chñng.

+ Nhãm kh«ng cã kh¶ n¨ng di ®éng cã 18 chñng.

3.1.4. §Þnh typ huyÕt thanh cña c¸c chñng vi khuÈn ph©n lËp ®­îc

C¸c chñng E. coli ®­îc gi÷ b»ng ®«ng kh«, chóng ®­îc hoµn nguyªn vµ nu«i cÊy trªn m«i tr­êng th¹ch m¸u, sau ®ã dïng kh¸ng huyÕt thanh chuÈn ®Ó x¸c ®Þnh b»ng ph¶n øng ng­ng kÕt huyÕt thanh häc ®Ó x¸c ®Þnh c¸c chñng cã mang kh¸ng nguyªn quan träng lµ c¸c kh¸ng nguyªn pili nh­ K88, K99, K987p,.... KÕt qu¶ chi tiÕt ®­îc thèng kª ë b¶ng 7.