2.2.2.4. X¸c ®Þnh ®éc lùc cña E. coli theo ph¬ng ph¸p cña Cater (1984) [64]
Mçi chñng vi khuÈn ®îc tiªm cho 2 chuét, liÒu 0,2 ml dÞch nu«i cÊy 24giê/370C vµo phóc xoang. Theo dâi sè chuét chÕt vµ thêi gian giÕt chÕt chuét cña vi khuÈn trong 7 ngµy. Chuét chÕt ®îc mæ kiÓm tra bÖnh tÝch vµ lÊy m¸u tim, phñ t¹ng nu«i cÊy ph©n lËp vi khuÈn.
2.2.2.5. X¸c ®Þnh kh¶ n¨ng dung huyÕt cña E. coli b»ng ph¶n øng g©y dung huyÕt trªn th¹ch m¸u bª 10%
Gièng E. coli thuÇn khiÕt ®îc ria cÊy trªn m«i trêng th¹ch m¸u bª 10%, båi dìng ë tñ Êm 370C trong 24 giê.
§¸nh gi¸ kÕt qu¶:
-
Dung huyÕt hoµn toµn (-haemolysin): xung quanh khuÈn l¹c cã vßng tan m¸u to, râ, cã thÓ nh×n qua ®îc m«i trêng.
-
Dung huyÕt kh«ng hoµn toµn (-haemolysin): xung quanh khuÈn l¹c cã vßng tan m¸u nhá, cã ¸nh xanh.
-
Kh«ng dung huyÕt (-haemolysin): xung quanh khuÈn l¹c kh«ng cã vßng tan m¸u.
2.2.2.6. X¸c ®Þnh c¸c gen ®éc tè (LT, STa, STb vµ VT2e) b»ng ph¬ng ph¸p PCR
HiÖn nay ngêi ta dïng ph¬ng ph¸p PCR ®Ó x¸c ®Þnh c¸c gen ®éc tè cña E. coli, ®©y lµ ph¬ng ph¸p u viÖt nhÊt vÒ ®é nh¹y vµ tÝnh chÝnh x¸c cña nã.
- C¸ch tiÕn hµnh:
-
ADN mÉu: khuÈn l¹c E. coli mäc trªn m«i trêng th¹ch m¸u ë 370C/24h.
-
Hçn hîp ph¶n øng PCR:
Primers: 1 l mçi lo¹i
Dung dÞch ®Öm (5 X): 5,0 l
Enzym (Taq polymerase): 0,5 l
Níc khö ion võa ®ñ ®Ó ®¹t ®îc thÓ tÝch cuèi cïng lµ 25l cho 1 ph¶n øng.
-
Chu tr×nh cña mét ph¶n øng PCR (Amplification): ph¶n øng PCR lµ mét chuçi gåm nhiÒu chu kú nèi tiÕp nhau. Mçi chu kú gåm 3 bíc vµ ®îc thùc hiÖn trong m¸y nh©n gen tù ®éng Perkin Elmer, theo b¶ng 1.
-
Ch¹y ®iÖn di: s¶n phÈm PCR thu ®îc sau chu tr×nh ph¶n øng ®îc nhuém víi chÊt nhuém nhá mÉu (loading dye), ®îc trén vµo mÉu theo tû lÖ 1: 5. Sau khi nhuém, s¶n phÈm PCR ®îc ch¹y ®iÖn di trªn th¹ch agarose 1%, trong dung dÞch ®Öm TAE (Tris - agartate - EDTA) víi hiÖu ®iÖn thÕ 100V trong vßng 40 phót.
-
Nhuém: gel th¹ch sau khi ch¹y ®iÖn di ®îc nhuém mµu b»ng chÊt nhuém mµu huúnh quang Ethidium bromide (1l/ml) trong vßng 15 phót ®äc kÕt qu¶.
B¶ng 1: Chu tr×nh cña ph¶n øng PCR
Thµnh phÇn
|
Chu tr×nh thø nhÊt
|
30 chu tr×nh tiÕp theo
|
Chu tr×nh cuèi
|
BiÕn tÝnh (0C/phót)
|
BiÕn tÝnh (0C/phót)
|
G¾n måi (0C/phót)
|
Tæng hîp (0C/phót)
|
Tæng hîp (0C/phót)
|
ADN khu«n, primer, Taq polymerase, dNTP
|
94/5
|
94/0,5
|
55/0,5
|
72/0,5
|
72/7
|
- §äc kÕt qu¶:
§äc kÕt qu¶ b»ng c¸ch quan s¸t díi ¸nh ®Ìn UV (300nm) vµ chôp ¶nh b»ng hÖ thèng Polaroid camera. Trªn ¶nh chôp nÒn ®en, c¸c ®o¹n axit nucleic hiÖn lªn ë d¹ng b¨ng mµu tr¾ng vµ cã thÓ chôp ¶nh ®îc vµ ghi nhËn l¹i. KÝch thíc c¸c b¨ng ADN ®îc so s¸nh víi ADN chuÈn (ADN marker).
2.2.3. Ph¬ng ph¸p chÕ t¹o kh¸ng nguyªn
Dïng c¸c chñng E. coli ®· lùa chän nu«i cÊy trªn c¸c m«i trêng dinh dìng riªng tõng chñng ë 37oC/24 giê, kiÓm tra ®Ëm ®é vi khuÈn, kiÓm tra thuÇn khiÕt, bÊt ho¹t b»ng nhiÖt ®é hoÆc hãa chÊt, kiÓm tra v« trïng, chia lä ®Ó sö dông.
2.2.4. Nghiªn cøu qui tr×nh miÔn dÞch ®Ó ®¹t hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh gµ cao nhÊt
Chóng t«i tiÕn hµnh thö nghiÖm tiªm miÔn dÞch cho 3 ®µn gµ thÝ nghiÖm, mçi ®µn theo mét qui tr×nh kh¸c nhau, sau ®ã ®Þnh kú hµng tuÇn kiÓm tra hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong m¸u gµ ®Ó t×m ra qui tr×nh hîp lý, cho hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong m¸u gµ cao nhÊt, æn ®Þnh nhÊt.
2.2.5. Ph¬ng ph¸p ®Þnh tÝnh hµm lîng kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm b»ng kh¶ n¨ng b¶o hé cña kh¸ng thÓ chèng l¹i E. coli trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm
Dïng chuét b¹ch thÓ träng mçi con 18 - 20g, khoÎ m¹nh. Chia lµm 2 nhãm:
-
Nhãm 1: Mçi con tiªm 0,4 ml kh¸ng thÓ vµo phóc xoang; sau 24 giê tiªm lÇn hai cïng liÒu.
-
Nhãm 2: Kh«ng tiªm, lµm ®èi chøng.
Sau 48 giê kÓ tõ khi tiªm kh¸ng thÓ lÇn hai, c«ng cêng ®éc cho c¶ hai nhãm chuét víi liÒu tiªm díi da mçi chuét 0,2 ml canh trïng 24 giê cña c¸c chñng E. coli. Theo dâi chuét trong 7 ngµy sau ®¸nh gi¸ kÕt qu¶.
TÝnh hiÖu sè cña sè lîng chuét sèng sãt cña nhãm 1 (nhãm ®îc tiªm miÔn dÞch b»ng kh¸ng thÓ) vµ sè lîng chuét sèng sãt cña nhãm 2 (nhãm ®èi chøng).
2.2.6. Ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng hµm lîng kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm b»ng ph¶n øng ngng kÕt gi÷a kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm víi kh¸ng nguyªn E. coli t¬ng øng
Cã thÓ thùc hiÖn ph¶n øng ngng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh hay ngng kÕt chËm trong èng nghiÖm theo thêng qui.
Pha lo·ng kh¸ng thÓ b»ng níc muèi sinh lý theo c¸c ®é pha lo·ng kh¸c nhau (theo cÊp sè 2).
LÊy mét lîng kh¸ng thÓ ®· pha ë mçi hiÖu gi¸ vµ mét lîng kh¸ng nguyªn E. coli b»ng nhau, trén ®Òu, ®Ó ë nhiÖt ®é kho¶ng 250C. NÕu lµ ngng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh th× ®äc kÕt qu¶ sau 3-5 phót, nÕu lµ ngng kÕt chËm trong èng nghiÖm th× ®äc kÕt qu¶ sau 6-12 giê b»ng m¾t thêng.
§èi chøng ©m lµm t¬ng tù bíc trªn nhng thay thÕ kh¸ng thÓ b»ng níc sinh lý. §èi chøng d¬ng lµm t¬ng tù bíc trªn nhng thay thÕ kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm b»ng kh¸ng thÓ E. coli ®· biÕt.
2.2.7. Ph¬ng ph¸p chÕ t¹o kh¸ng thÓ
Thu ho¹ch trøng, t¸ch lßng ®á, cho vµo lµm ®ång nhÊt b»ng m¸y, bæ sung dung m«i vµ chÊt b¶o qu¶n, ra chai, b¶o qu¶n.
Ch¬ng 3: KÕt qu¶ vµ bµn luËn
3.1. Ph©n lËp E. coli, chän E. coli cã ®éc lùc, cã tÝnh kh¸ng nguyªn
3.1.1. Thu thËp mÉu bÖnh phÈm lîn èm tiªu ch¶y vµ sng phï ®Çu
C¸c mÉu ®îc thu thËp ë 8 huyÖn cña 5 tØnh ®¹i diÖn cho 3 miÒn B¾c - Trung - Nam, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thu thËp ®îc tæng sè 340 mÉu bÖnh phÈm ë lîn èm cã triÖu chøng m¾c bÖnh sng phï ®Çu vµ tiªu ch¶y do E. coli g©y nªn. C¸c lo¹i mÉu bÖnh phÈm chóng t«i thu thËp lµ: ph©n, lîn nguyªn con, tim, gan, ruét vµ h¹ch ruét cña lîn bÖnh. KÕt qu¶ cô thÓ trong b¶ng 2.
B¶ng 2: KÕt qu¶ thu thËp mÉu bÖnh phÈm lîn èm tiªu ch¶y vµ sng phï ®Çu
§Þa ®iÓm
|
Sè c¬ së lÊy mÉu
|
Lîn nguyªn con
|
Ph©n
|
Tim
|
Gan
|
Ruét, h¹ch ruét
|
Tæng sè mÉu
|
MiÒn Nam
|
40
|
5
|
15
|
20
|
18
|
22
|
80
|
MiÒn Trung
|
40
|
14
|
20
|
21
|
22
|
23
|
100
|
MiÒn B¾c
|
80
|
30
|
35
|
37
|
30
|
28
|
160
|
Tæng céng
|
160
|
49
|
70
|
78
|
70
|
73
|
340
|
3.1.2. Nu«i cÊy ®Æc hiÖu cho E. coli, sµng läc vi khuÈn t¹p
Tõ 340 mÉu bÖnh phÈm thu thËp ®îc ë c¸c vïng, miÒn trªn c¶ níc, bíc ®Çu chän läc E. coli, chóng t«i dïng m«i trêng ®Æc hiÖu cho E. coli lµ m«i trêng Mac Conkey. KÕt hîp víi c¸c m«i trêng kh¸c nh lµ m«i trêng th¹ch m¸u, m«i trêng níc thÞt, m«i trêng th¹ch thêng, m«i trêng yÕm khÝ ®Ó chän ra nh÷ng chñng cã ®Æc ®iÓm gièng víi E. coli, lo¹i ®îc nh÷ng vi khuÈn t¹p (kh«ng ph¶i lµ E. coli). KÕt qu¶ cô thÓ ®îc thèng kª ë b¶ng 3.
Qua b¶ng 3 thÊy r»ng: tõ 340 mÉu bÖnh phÈm ë lîn cã dÊu hiÖu m¾c bÖnh sng phï ®Çu vµ Øa ch¶y do E. coli g©y nªn, trªn m«i trêng Mac Conkey ph©n lËp ®îc 266 mÉu vi khuÈn cã ®Æc ®iÓm h×nh th¸i khuÈn l¹c gièng víi h×nh th¸i khuÈn l¹c E. coli (mµu hång c¸nh sen), chiÕm tíi 78,24%. Trong ®ã cao nhÊt lµ ë §ång Nai cã tû lÖ 85% vµ thÊp nhÊt lµ NghÖ An cã tû lÖ 68,0% mÉu vi khuÈn cã ®Æc ®iÓm h×nh th¸i khuÈn l¹c gièng víi E. coli.
B¶ng 3: KÕt qu¶ ph©n lËp E. coli tõ c¸c mÉu bÖnh phÈm
STT
|
§Þa ®iÓm lÊy mÉu
|
Sè lîng mÉu
|
Sè lîng mÉu cã E. coli
|
Tû lÖ %
|
1
|
§ång Nai
|
80
|
68
|
85,0
|
2
|
B×nh §Þnh
|
50
|
37
|
74,0
|
3
|
NghÖ An
|
50
|
34
|
68,0
|
4
|
Hng Yªn
|
80
|
65
|
81,25
|
5
|
Hµ T©y
|
80
|
62
|
77,5
|
Tæng
|
340
|
266
|
78,24
|
KiÓm tra h×nh th¸i vi khuÈn trªn tiªu b¶n khi nhuém Gram: vi khuÈn cã d¹ng trùc khuÈn, hai ®Çu trßn, b¾t mµu Gram ©m, ®øng riªng rÏ. Tõ 266 mÉu vi khuÈn thu ®îc ë trªn, chóng t«i chän ra ®îc 135 mÉu vi khuÈn ®Ó lµm c¸c c«ng viÖc tiÕp theo trong qu¸ tr×nh chän läc gièng E. coli.
Do tÝnh chÊt rÊt hay thay ®æi cña E. coli, chóng t«i tiÕn hµnh ®«ng kh« ngay c¸c chñng ®· ph©n lËp ®îc ®Ó ®¶m b¶o tÝnh nguyªn vÑn cña vi khuÈn, tr¸nh nh÷ng biÕn ®æi trong qu¸ tr×nh cÊy chuyÓn g©y nªn.
3.1.3. TiÕn hµnh c¸c ph¶n øng sinh vËt hãa häc cña c¸c chñng vi khuÈn ph©n lËp ®îc
3.1.3.1. KÕt qu¶ kiÓm tra ®Æc tÝnh lªn men c¸c lo¹i ®êng vµ kh¶ n¨ng sinh h¬i
Sau khi s¬ bé ph©n lËp ®îc 135 chñng vi khuÈn tõ c¸c mÉu bÖnh phÈm. Chóng t«i x¸c ®Þnh ®Æc tÝnh lªn men c¸c lo¹i ®êng: sorbitol, arabinose, galactose, maltose, salicin, lactose, mannit, glucose, fructose, raffinose, saccharose, mannose. §ång thêi còng x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng sinh h¬i cña 135 chñng vi khuÈn ph©n lËp ®îc. KÕt qu¶ cô thÓ nh sau:
B¶ng 4: Kh¶ n¨ng lªn men c¸c lo¹i ®êng cña 135 chñng vi khuÈn ph©n lËp ®îc
Sè mÉu
N=135
|
Sor
|
Ara
|
Gal
|
Mal
|
Sal
|
Lac
|
Mat
|
Glu
|
Fru
|
Raf
|
Sac
|
Man
|
Gas
|
KÕt qu¶
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
+
|
+
|
Sè mÉu
|
101
|
135
|
135
|
135
|
135
|
135
|
135
|
135
|
135
|
120
|
135
|
135
|
135
|
*Sor: Sorbitol Ara: Arabinose Gal: Galactose Mal: Maltose
Sal: Salicin Lac: Lactose Mat: Mannit Glu: Glucose
Fru: Fructose Raf: Raffinose Sac: Saccharose Man: Mannose
Gas: Ph¶n øng sinh h¬i
(+): Ph¶n øng d¬ng tÝnh (-): Ph¶n øng ©m tÝnh
§Æc ®iÓm sinh ho¸ cña E. coli lµ cã kh¶ n¨ng lªn men c¸c lo¹i ®êng glucose, ®êng lactose vµ mét sè ®êng kh¸c, nhng kh«ng cã kh¶ n¨ng lªn men ®êng saccharose còng nh ®êng salicin. Qua b¶ng 4, ta thÊy tÊt c¶ c¸c chñng ph©n lËp ®îc ®Òu cã ®Çy ®ñ c¸c tÝnh chÊt sinh ho¸ ®Æc trng cña E. coli, do ®ã c¸c chñng nµy tiÕp tôc ®îc x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng dung huyÕt trªn m«i trêng th¹ch m¸u.
3.1.3.2. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh ®Æc tÝnh dung huyÕt cña c¸c chñng
Chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng dung huyÕt cña c¸c chñng theo ph¬ng ph¸p sau: c¸c chñng E. coli ®îc ria cÊy trªn m«i trêng Blood Agar Base cã bæ sung 10% m¸u bª, nu«i cÊy ë ®iÒu kiÖn 37oC/18 - 24giê, ®äc kÕt qu¶. Kh¶ n¨ng g©y dung huyÕt ®îc ®¸nh gi¸ theo 3 kiÓu lµ -haemolysin (ký hiÖu: ) ; -haemolysin (ký hiÖu: ) vµ ©m tÝnh (ký hiÖu: -). KÕt qu¶ cô thÓ ®îc tr×nh bµy ë b¶ng 5.
B¶ng 5 cho thÊy, trong 135 chñng E. coli ®· ®îc chän läc ë trªn chØ cã 50 chñng cã kh¶ n¨ng dung huyÕt chiÕm 37%, cßn l¹i 85 chñng kh«ng cã kh¶ n¨ng dung huyÕt (chiÕm 63%). Theo c¸c tµi liÖu nghiªn cøu tríc ®©y, c¸c chñng cã kh¶ n¨ng dung huyÕt lµ c¸c chñng cã ®éc tÝnh, cã kh¶ n¨ng g©y bÖnh trªn lîn cao h¬n so víi c¸c chñng kh«ng dung huyÕt (theo tµi liÖu nghiªn cøu cña: Cï H÷u Phó, NguyÔn Ngäc Nhiªn, Vò B×nh Minh vµ §ç Ngäc Thuý vÒ kÕt qu¶ ph©n lËp E. coli vµ Salmonella ë lîn m¾c bÖnh tiªu ch¶y, x¸c ®Þnh mét sè ®Æc tÝnh sinh vËt ho¸ häc cña c¸c chñng vi khuÈn ph©n lËp ®îc vµ biÖn ph¸p phßng trÞ). V× vËy chóng t«i ®· chän 50 chñng dung huyÕt trªn ®Ó thùc hiÖn c¸c bíc tiÕp theo trong qu¸ tr×nh chän läc E. coli
B¶ng 5: §Æc tÝnh dung huyÕt cña c¸c chñng E. coli ph©n lËp ®îc
STT
|
§Þa ph¬ng lÊy mÉu
|
Sè mÉu kiÓm tra
|
Sè mÉu dung huyÕt
|
Tæng sè mÉu dung huyÕt
|
Tû lÖ dung huyÕt (%)
|
D¹ng
|
D¹ng
|
1
|
§ång Nai
|
30
|
6
|
8
|
14
|
47
|
2
|
B×nh §Þnh
|
25
|
4
|
5
|
9
|
36
|
3
|
NghÖ An
|
28
|
5
|
4
|
9
|
32
|
4
|
Hng Yªn
|
27
|
4
|
6
|
10
|
37
|
5
|
Hµ T©y
|
25
|
3
|
5
|
8
|
32
|
Tæng
|
135
|
22
|
28
|
50
|
37
|
|
H×nh 1: H×nh ¶nh dung huyÕt cña E. coli
|
3.1.3.3. KiÓm tra ®Æc tÝnh di ®éng
Sau khi x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng dung huyÕt cña c¸c chñng, chóng t«i cÊy 50 chñng nµy vµo m«i trêng th¹ch b¸n láng trong èng nghiÖm ch÷ U (cÊy ë mét ®Çu èng nghiÖm) nu«i ë ®iÒu kiÖn 37oC, cø sau 6 tiÕng ®äc kÕt qu¶ 1 lÇn. KÕt qu¶ ®îc ®¸nh gi¸ dùa vµo kh¶ n¨ng ph¸t triÓn cña vi khuÈn trong m«i trêng (cã thÓ thÊy râ b»ng m¾t thêng). MÉu d¬ng tÝnh lµ mÉu mµ vi khuÈn cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn ra m«i trêng xung quanh vµ ph¸t triÓn sang nh¸nh bªn cña èng nghiÖm ch÷ U. Cßn mÉu ©m tÝnh lµ mÉu mµ vi khuÈn kh«ng cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn ra m«i trêng xung quanh, chóng chØ cã thÓ ph¸t triÓn t¹i vÞ trÝ cÊy gièng, sau ®©y lµ kÕt qu¶ cô thÓ.
B¶ng 6: Kh¶ n¨ng di ®éng cña c¸c chñng E. coli ph©n lËp ®îc
STT
|
§Þa ®iÓm lÊy mÉu
|
Sè mÉu
kiÓm tra
|
Sè mÉu
di ®éng
|
Sè mÉu kh«ng di ®éng
|
1
|
§ång Nai
|
14
|
9
|
5
|
2
|
B×nh §Þnh
|
9
|
5
|
4
|
3
|
NghÖ An
|
9
|
6
|
3
|
4
|
Hng Yªn
|
10
|
7
|
3
|
5
|
Hµ T©y
|
8
|
5
|
3
|
Tæng
|
50
|
32
|
18
|
|
H×nh 2: TÝnh di ®éng cña E. coli
|
Sau khi tiÕn hµnh x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng di ®éng cña c¸c chñng E. coli ph©n lËp ®îc, bé su tËp E. coli ph©n lËp ®îc ®îc chia thµnh 2 nhãm:
+ Nhãm cã kh¶ n¨ng di ®éng cã 32 chñng.
+ Nhãm kh«ng cã kh¶ n¨ng di ®éng cã 18 chñng.
3.1.4. §Þnh typ huyÕt thanh cña c¸c chñng vi khuÈn ph©n lËp ®îc
C¸c chñng E. coli ®îc gi÷ b»ng ®«ng kh«, chóng ®îc hoµn nguyªn vµ nu«i cÊy trªn m«i trêng th¹ch m¸u, sau ®ã dïng kh¸ng huyÕt thanh chuÈn ®Ó x¸c ®Þnh b»ng ph¶n øng ngng kÕt huyÕt thanh häc ®Ó x¸c ®Þnh c¸c chñng cã mang kh¸ng nguyªn quan träng lµ c¸c kh¸ng nguyªn pili nh K88, K99, K987p,.... KÕt qu¶ chi tiÕt ®îc thèng kª ë b¶ng 7.
B¶ng 7: KÕt qu¶ ®Þnh typ huyÕt thanh cña c¸c chñng vi khuÈn ph©n lËp
§Þa ®iÓm
|
Sè lîng
|
K99 (F5)
|
K88 (F4)
|
987P (F6)
|
K30
|
K98
|
O141 K85ab
|
O149 K91
|
O8 K87
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
§ång Nai
|
14
|
1
|
1
|
|
1
|
2
|
1
|
1
|
|
B×nh §Þnh
|
9
|
|
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
|
NghÖ An
|
9
|
|
1
|
1
|
|
1
|
|
|
1
|
Hng Yªn
|
10
|
1
|
|
1
|
1
|
|
3
|
|
1
|
Hµ T©y
|
8
|
1
|
|
1
|
|
|
2
|
|
1
|
Tæng
|
50
|
3
|
2
|
5
|
3
|
4
|
7
|
2
|
3
|
Chia sẻ với bạn bè của bạn: |