Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân

Exon 15 được chúng tôi tối ưu điều kiện nhiệt độ gắn mồi sử dụng để nhân bản nằm trong dải nhiệt từ 52⁰C đến 54⁰C ở 3 điểm nhiệt gắn mồi là 52⁰C và 53⁰C và 53.5⁰C. Ở điểm nhiệt đầu tiên là 52⁰C, chúng tôi không thu được băng ADN nào. Còn ở điểm nhiệt thứ hai là 53⁰C, chúng tôi thu được 1 băng ADN với kích thước khoảng 235bp. Đây chính là kích thước đoạn gen mà chúng tôi cần nhân bản. Khi tăng thêm 0.5⁰C nữa, băng chính xuất hiện khá mờ so với điểm nhiệt 53⁰C. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn 53⁰C làm điểm nhiệt gắn mồi để nhân bản exon 15. Điều kiện thử nghiệm cũng như kết quả nhân bản exon 15 được thể hiện trong Hình 19.

Nhìn vào những hình ảnh minh họa nêu trên (từ Hình 11 đến Hình 19), chúng tôi có thể khẳng định sự thành công của kỹ thuật PCR sử dụng trong nhân bản các exon. Hơn nữa, chúng tôi cũng khẳng định nhiệt độ gắn mồi của các exon đã được tối ưu hóa (chi tiết xem trong Bảng 10). Bởi kết quả điện di cho thấy, trên bản gel chỉ xuất hiện một băng ADN duy nhất đúng kích thước tương ứng với mỗi exon và không có sản phẩm phụ. Hơn nữa, các băng ADN thu được có độ sáng cao, gọn, sắc nét. Mẫu đối chứng dương (kí hiệu là D trên bản gel – là sản phẩm nhân bản từ ADN của người được khẳng định không mắc ung thư đại trực tràng cũng như các bệnh ung thư khác có liên quan đến hệ tiêu hóa) cũng được chúng tôi nhân bản thành công với một băng duy nhất, đáp ứng tiêu chuẩn cần thiết của mẫu dùng làm đối chứng. Riêng đối chứng âm (kí hiệu là (-) trên bản gel – là sản phẩm PCR khuyết ADN) không được thể hiện sau điện di. Chứng tỏ, các mẫu không bị lẫn nhiễm với nhau trong quá trình thao tác và hóa chất cũng như dụng cụ sử dụng trong phản ứng PCR được đảm bảo chất lượng. Vì thế chúng tôi đã chọn những sản phẩm nhân bản thành công này làm nguyên liệu cho bước phân tích và phát hiện đột biến nhờ phương pháp SSCP.

Tên exon	Nhiệt độ gắn mồi (0C)	Tên exon	Nhiệt độ gắn mồi (0C)
2	51	12	56
3	57	13	54
6	53	14	52
7	56	15	53
8	55

Chúng tôi tiến hành sàng lọc đột biến trên 09 exon lựa chọn của gen MSH2 ở tất cả các mẫu nghiên cứu. Dựa trên kỹ thuật SSCP theo Orita và cộng sự (1989) [24], chúng tôi đã lựa chọn được nồng độ gel phân tích phù hợp với kích thước các phân đoạn gen quan tâm, tối ưu hóa được các điều kiện thí nghiệm và hoàn thiện được quy trình nhuộm bạc nhanh sản phẩm điện di để có kết quả tốt nhất (Mục 2.3.4). Ở các exon có mẫu nghi ngờ xảy ra đột biến, chúng tôi tiến hành điện di thêm một lần nữa để khẳng định chắc chắn những nhận định có được trước khi gửi mẫu đi giải trình tự. Kết quả phân tích đột biến 09 exon lựa chọn được thể hiện dưới đây.

Nhìn vào Hình 20 ta thấy, sản phẩm PCR các mẫu thuộc exon 2 đã được biến tính thành công. Sự thể hiện mô hình điện di của các băng ADN trong khu vực sợi đơn xuất hiện khá rõ với 3 băng tách biệt nhau. So sánh số lượng băng cũng như kích thước và khoảng cách giữa các băng với mẫu đối chứng chúng tôi thấy không có sự bất thường nào xảy ra. Điều đó chứng tỏ, không có đột biến nào xảy ra trên exon 2 ở 42 mẫu được phân tích.

Tuy nhiên trên exon 2 gen MSH2 cũng thuộc người Việt Nam, chúng tôi đã phát hiện một mô hình điện di sợi đơn sai khác trên mẫu 35 (Hình 21). Trong mô hình điện di thu nhận được từ các mẫu phân tích, ngoài 3 băng ADN sợi đơn giống mẫu đối chứng, ở mẫu 35 xuất hiện thêm 2 băng sợi đơn phía dưới một cách bất thường. Chúng tôi đã tiến hành gửi mẫu 35 giải trình tự sau khi nhận định mẫu 35 có thể mang những biến đổi về trình tự ADN.

Kết quả giải trình tự (Hình 22) và so sánh với trình tự tương ứng ở mẫu đối chứng cho thấy có một đột biến mất một nucleotide A tại vị trí 5193 trên intron cách exon 2 khoảng 15 nucleotide ngược dòng (tức là nằm trong vùng ranh giới exon 1 và exon 2). Sự thay đổi trong vùng ranh giới này có thể dẫn đến sự thay đổi ở vùng trước của phân tử mARN từ đó ảnh hưởng đến quá trình biến đổi sau phiên mã. Tuy nhiên, nhìn vào sắc đồ điện di giải trình tự của mẫu 35, đột biến mất nucleotide A xảy ra ở trình tự poly A được lặp lại 13 lần. Rất có thể đây là một dạng bất ổn vi vệ tinh đã được đề cập trong cơ sở phân tử của ung thư đại trực tràng.

Đây được xem là phát hiện khá thú vị và mang giá trị thiết thực trong chẩn đoán lâm sàng bệnh ung thư đại trực tràng nói riêng, HNPCC nói chung. Bởi vì, những đột biến này xảy ra ngay trong intron – vùng ranh giới giữa các exon, nơi mà chúng ta ít quan tâm hơn các vùng mã hóa khác trong toàn bộ cấu trúc hệ thống gen sửa chữa bắt cặp sai MMR.

Căn cứ vào Hình 23 ta thấy, ở các mẫu ADN phân tích trừ mẫu 14, mô hình điện di xuất hiện 3 băng sợi đơn. Trong đó, 2 băng phía trên nằm sát nhau và tách biệt với băng sợi đơn còn lại. Tuy nhiên, ở mẫu 14 chỉ xuất hiện 2 băng sợi đơn phía trên mà mất hoàn toàn băng sợi đơn phía dưới. Đối chiếu sự sai khác này với mẫu đối chứng, chúng tôi kết luận có thể mẫu 14 của exon 3 đã xảy ra đột biến nên mới có mô hình sợi đơn thể hiện bất thường như vậy. Hơn nữa, chúng tôi dự đoán, đây là đột biến xuất hiện trong quá trình phân chia tế bào sôma không phải đột biến dòng mầm. Bởi quan sát trên bản gel điện di, chúng tôi thấy một băng ADN sợi đơn khá mờ nhạt của mẫu bình thường. Có thể ADN tổng số của các tế bào bình thường lẫn trong mẫu 14 đã được tách chiết cùng với ADN tổng số của dòng tế bào đột biến.

Để biết chính xác vị trí xảy ra đột biến cũng như kiểu đột biến dẫn tới sự sai khác trong mô hình điện di mẫu 14, chúng tôi đã gửi mẫu đi đọc trình tự. Trước khi gửi mẫu, chúng tôi tiến hành tinh sạch và làm giàu nồng độ ADN mẫu nhờ kỹ thuật PCR.

Chúng tôi sử dụng phần mềm BioEdit để phân tích kết quả đọc trình tự thu được. Sau khi so sánh với trình tự chuẩn ban đầu khi tiến hành thiết kế mồi nhân bản exon 3, chúng tôi phát hiện một đột biến dạng thay thế nucleotide G bởi T ở trình tự CTGGCCAT trên mạch ngược (Hình 24). Vị trí này tương ứng với nucleotide 65-70 trên mạch xuôi exon 3 được biết của một bệnh nhân nam, 56 tuổi được chẩn đoán mắc ung thư đại tràng.

Đột biến được xác định nằm trong vùng mã hóa tại vị trí nucleotide thứ 596, tương ứng với codon 199 của gen MSH2 (c.199 G>T). Sự thay thế G bởi T khiến bộ ba mã sao GGC trong trình tự xảy ra đột biến bị biến thành GTC. Tương ứng với bộ ba mã hóa trên mARN từ CCG (mã hóa axit amin prolin) → CAG (mã hóa axit amin glutamin). Kết quả là, một axit amin trong chuỗi polypeptide do gen MSH2 tạo ra bị thay thế. Sự thay thế này có thể làm sản phẩm protein có chức năng bám ADN trong quá trình sửa lỗi (được mã hóa bởi các exon từ 1 đến 6) [38] có một axit amin bị thay đổi.

Trong mô hình điện di exon 6 (Hình 25), các băng ADN sợi đơn tách thành 3 băng với 2 băng phía trên nằm sát nhau và tách biệt hoàn toàn với băng sợi đơn phía dưới. Kết quả điện di cho thấy, không xảy ra sự sai khác nào trong mô hình sợi đơn ở 42 mẫu được phân tích so với mẫu đối chứng. Điều đó chứng tỏ, trên exon 6 không có đột biến nào xảy ra. Hơn nữa, chúng tôi cũng chưa có bất cứ thông tin nào về đột biến được phát hiện trên exon này.

Kết quả điện di exon 7 cho thấy, mô hình các băng sợi đơn của các mẫu phân tách thành 3 băng với 1 băng phía trên tách biệt với 2 băng phía dưới nằm sát nhau. Đối chiếu sự thể hiện các băng sợi đơn trong mô hình điện di của các mẫu với mẫu đối chứng, chúng tôi phát hiện một mô hình sai khác ở mẫu số 30 (Hình 26). Trong mô hình sợi đơn của mẫu này chỉ xuất hiện 2 băng sợi đơn phía trên mà mất hoàn toàn băng sợi đơn dưới cùng. Chúng tôi nghi ngờ đã có đột biến xảy ra trên exon 7 đối với mẫu 30.

Cũng như mẫu 14 trên exon 3, chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra lại kết quả, tinh sạch mẫu, làm giàu nồng độ ADN và gửi mẫu đi đọc trình tự. Tuy nhiên, chúng tôi chưa phát hiện chính xác vị trí xảy ra đột biến cũng như dạng đột biến dẫn tới mô hình điện di sai khác trên mẫu 30.



3.3.5. Kết quả phân tích đột biến exon 8

Mô hình điện di exon 8 (Hình 27) cho thấy, các băng ADN trong khu vực sợi đơn của các mẫu phân tách thành 3 băng nằm tách biệt nhau. Đối chiếu với mẫu đối chứng, chúng tôi không phát hiện bất thường nào trong mô hình sợi đơn của các mẫu phân tích. Chứng tỏ không có đột biến nào được phát hiện trên exon 8.

Tuy nhiên, trên exon 8 gen MSH2 cũng thuộc người Việt Nam, chúng tôi đã phát hiện 3 mô hình điện di sai khác. Cụ thể, trong khi mẫu đối chứng thể hiện 3 băng trong vùng sợi đơn, thì bệnh nhân số 31, 34 và 36 chỉ thể hiện 2 băng (Hình 28) ở các vị trí tương ứng. Hai trong số ba bệnh nhân có mô hình diện di sợi đơn bất thường trên được chẩn đoán mắc ung thư đại trực tràng từ khi còn khá trẻ (dưới 50 tuổi) là mẫu số 31 và 36. Chúng tôi đã gửi đi giải trình tự. Tuy nhiên, kết quả cho thấy không có sự khác biệt nào về trình tự ADN giữa người bình thường và người bị bệnh.

Kết quả điện di exon 12 (Hình 29) cho thấy, trong khu vực sợi đơn ở tất cả các mẫu (kể cả mẫu đối chứng) xuất hiện 2 băng sợi đơn. Trong đó băng phía dưới khá mờ và tách biệt hoàn toàn với băng phía trên đậm. Tiến hành đối chiếu và so sánh cấu hình di chuyển của các băng sợi đơn, chúng tôi không phát hiện sự bất thường nào. Chứng tỏ, không có đột biến nào xảy ra trên exon 12 ở 42 mẫu được phân tích.

Trong mô hình điện di exon 13 (Hình 30), chúng tôi thu được 3 băng ADN trong khu vực sợi đơn ở tất cả các mẫu. Trong đó, băng sợi đơn phía trên tách biệt hoàn toàn với 2 băng còn lại nằm sát nhau. Đối chiếu và so sánh mô hình di chuyển của các băng sợi đơn với mẫu đối chứng, chúng tôi kết luận trên các mẫu được phân tích không có đột biến nào được phát hiện.

Kết quả điện di exon 14 (Hình 31) cho thấy, trong vùng ADN sợi đơn của tất cả các mẫu (kể cả mẫu đối chứng) xuất hiện 2 băng nằm sát nhau. Đối chiếu sự thể hiện mô hình di chuyển này ở các mẫu với mẫu đối chứng, chúng tôi không phát hiện sự bất thường nào. Chứng tỏ, không có đột biến nào xảy ra trên exon 14.

Nhìn vào kết quả điện di exon 15 (Hình 32) chúng tôi phát hiện một mô hình sai khác trên mẫu số 4 so với mẫu đối chứng. Bởi vì, trong khi các mẫu phân tích thể hiện 2 băng trong khu vực sợi đơn thì mẫu số 4 chỉ xuất hiện một băng duy nhất ở vị trí tương ứng. Chúng tôi nghi ngờ mẫu số 4 có thể đã xảy ra đột biến nên mới có mô hình sợi đơn thể hiện bất thường như vậy. Đối chiếu lý lịch mẫu, mô hình sai khác này là của một bệnh nhân nữ, 51 tuổi được chẩn đoán mắc ung thư đại tràng.

Chúng tôi đã tiến hành điện di một lần nữa để có thêm cơ sở khẳng định nhận định đưa ra. Để biết chính xác mẫu có xảy ra đột biến hay không, vị trí đột biến ở đâu và đột biến thuộc dạng nào, chúng tôi gửi mẫu đi đọc trình tự trước khi tinh sạch mẫu và làm giàu nồng độ ADN nhờ kỹ thuật PCR. Sau khi phân tích và đối chiếu với mẫu đối chứng, chúng tôi chưa phát hiện chính xác vị trí xảy ra đột biến cũng như dạng đột biến dẫn tới mô hình điện di sai khác trên mẫu số 4 của exon này.

Tuy nhiên, trên exon 15 gen MSH2 cũng thuộc người Việt Nam, chúng tôi đã phát hiện một mô hình sai khác số lượng băng sợi đơn ở mẫu số 19 (Hình 33).

Kết quả giải trình tự mẫu số 19 phát hiện một đột biến dạng thay thế C>A ở codon 848 (c.848 C>A) (Hình 34). Đây là một đột biến đồng nghĩa. Bởi vì, việc thay thế nucleotide C bởi A không làm thay đổi axit amin trong chuỗi polypeptide do gen MSH2 tạo ra mà chỉ thay đổi bộ ba mã sao GCC → GCA tương ứng với bộ ba mã hóa CGG → CGU trên mARN. Hai bộ ba này cùng mã hóa axit amin arginin. Dựa trên cấu trúc protein của gen MSH2, sản phẩm protein của các exon 13, 14 và 15 tạo miền tương tác với dạng tương đồng MutL đóng một vai trò quan trọng - sửa chữa những lỗi sai hỏng trong tái bản ADN [21]. Vì là đột biến đồng nghĩa nên sản phẩm protein do exon 15 tạo ra không hề thay đổi. Chính vì thế chức năng miền tương tác với dạng tương đồng MutL không bị thay đổi.

Ngoài ra, theo những nghiên cứu trước đây, nhiều đột biến trong exon 15 gen MSH2 đã được phát hiện. Cụ thể, trong năm 2005, Mangold và cộng sự đã tìm thấy 3 đột biến vô nghĩa c.2536 C>T (p.Gln846X), c.2575 G>T (p.Glu859X), và c.2579 C>A (p.Ser860X) [18]. Trong năm 2009, Salehi phát hiện hai đột biến tại vị trí khung đọc 2556 và 2586 [28]. Những đột biến này nằm cách xa vị trí đột biến được tìm thấy trong bệnh nhân 62 tuổi của Việt Nam tương ứng khoảng 13 đến 43 nucleotide.

Từ những kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi đi tới một số kết luận sau:

1. 
   Đã nhân bản thành công 09 trong tổng số 16 exon gen MSH2 nhờ kỹ thuật PCR, bao gồm: thiết kế các cặp mồi đặc hiệu, tối ưu các thành phần phản ứng và nhiệt độ gắn mồi cho các exon 2, 3, 6, 7, 8, 12, 13, 14 và 15.
   
2. 
   Sử dụng kỹ thuật PCR-SSCP trong phân tích đột biến trên các exon lựa chọn, chúng tôi đã phát hiện được 8 mô hình điện di sai khác ở 8 bệnh nhân. Trong đó, 1 mô hình thuộc exon 2, 1 mô hình thuộc exon 3, 1 mô hình thuộc exon 7, 3 mô hình thuộc exon 8 và 2 mô hình thuộc exon 15.
   
3. 
   Giải trình ADN các exon gen MSH2 từ các mẫu có mô hình PCR-SSCP sai khác, chúng tôi phát hiện 3 đột biến bao gồm: một đột biến mất nucleotide A tại vị trí 5193 (vùng intron nằm trước exon 2 gen MSH2); một đột biến thay thế nucleotide tại vị trí codon 199 nucleotide G bị thay thế bởi T (c.199 G>T) ở exon 3 dẫn tới thay đổi axit amin prolin (CCG) thành axit amin glutamin (CAG) trong chuỗi polypeptide do gen MSH2 tạo ra và một đột biến thay thế C>A tại vị trí 77942 (tương ứng codon 848 trên exon 15) thuộc gen MSH2.
   

Trên cơ sở những kết quả trên, chúng tôi có một số kiến nghị sau:

1. 
   Tiếp tục phân tích di truyền trên các exon còn lại của gen MSH2 để có kết luận chung nhất về sự di truyền ung thư đại trực tràng do đột biến gen MSH2 gây ra.
   
2. 
   Mở rộng hướng nghiên cứu với các gen còn lại thuộc hệ thống MMR để có cơ sở dữ liệu chung nhất trong chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng.
   
3. 
   Áp dụng một vài phương pháp khác như HET và DGGE nhằm làm tăng hiệu quả phân tích tính di truyền và sàng lọc đột biến.
   

1. 
   Trịnh Đình Đạt (2009), Công nghệ sinh học, Tập 4, NXB Giáo Dục, Hà Nội.
   
2. 
   Võ Thị Thương Lan (2009), Giáo trình sinh học phân tử tế bào và ứng dụng, NXB Giáo dục.
   
3. 
   Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở Di truyền học Phân tử và Tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
   
4. 
   Đinh Đoàn Long, Nguyễn Thị Hồng Vân, “Cơ sở Di truyền học Ung thư” (Tài liệu đang in).
   
5. 
   Hoàng Thị Sèn (2005), Giáo trình giải phẫu người, Đại học Thái Nguyên.
   
6. 
   Lê Duy Thành (2006), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
   
7. 
   Đỗ Lê Thăng, Quyền Đình Thi, Nguyễn Mộng Hùng, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên, Nguyễn Chí Thành (2009), Công nghệ sinh học phân tử - Nguyên lý và ứng dụng của ADN tái tổ hợp – Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, NXB Khoa học và Kỹ thuật, (tr43).
   

8. 
   Aarnio M, Sankila R, Pukkala E, Salovaara R, Aaltonen L, de la Chapelle A, Peltomäki P, Mecklin J-P, Järvinen H (1999), “Cancer risk in mutation carriers of DNA mismatch repair genes”, Int J Cance, 81, pp. 214–218.
   
9. 
   Cecily PV, Elaine L, Wade SS (2008), “Confirmation of single exon deletions in MLH1 ADN MSH2 using quantitative PCR”, ARUP institute for clinical ADN Experimental pathology, Salt Lake City.
   
10. 
    Chapman Anthony Hugh & Jean François Adell (2004). Radiology and imaging of the colon. Springer. ISBN: 3540435972, 9783540435976.
    
11. 
    De la Chapelle A (2004), “Genetic Predisposition to Colorectal Cancer: Lynch Syndrome (HNPCC)”, Nature Publishing Group , Nat Rev Cancer, 4(10).
    
12. 
    Hendriks YM, de Jong AE, Morreau H, et al (2006), “Diagnostic approach ADN management of Lynch syndrome (hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma): a guide for clinicians”, CA Cancer J Clin,56(4), pp. 213-238.
    
13. 
    Huang J, Kuismanen SA, Liu T, et al (2001), “MSH6 and MSH3 are rarely involved in genetic predisposition to nonpolypotic colon cancer”, Cancer Res,61(4), pp. 1619-1623.
    
14. 
    Iaccarino I, Marra G, Palombo F, Jiricny J (1998), “hMSH2 and hMSH6 play distinct roles in mismatch binding ADN contribute differently to the ATPase activity of hMutSalpha”, EMBO J, 17(9), pp. 2677-2686.
    
15. 
    Jiricny J (2000), “Mediating mismatch repair”, Nat Genet, 24(1), pp. 6-8.
    
16. 
    Loukola A, Vilkki S, Singh J, Launonen V, Aaltonen LA (2000), “Germline ADN somatic mutation analysis of MLH3 in MSI-positive colorectal cancer”, Am J Pathol, 157(2), pp. 347-352.
    
17. 
    Lynch, H. T., Smyrk, T., Watson, P., Lanspa, S. J., Boman, B. M., Lynch, P. M., Lynch, J. F., Cavalieri (1991), “Hereditary colorectal cancer”. Semin. Oncol, 18: 337 – 366.
    
18. 
    Mangold E. et al. 2005. Spectrum and frequencies of mutations in MSH2 and MLH1 identified in 1,721 German families suspected of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Int. J. Cancer: 116, 692–702.
    
19. 
    Manuel Perucho, “Genetic and Epigenetic Modification of MLH1” (2000), American Journal of Pathology, 157:1052-1053.
    
20. 
    Minna Nyström-Lahti, Ramon Parsons, Pertti Sistonen, Lea Pylkkänen, Lauri A. Aaltonen, Fredrick S. Leach, Stanley R. Hamilton, Patrice Watson, Earlene Bronson, Ramon Fusaro, Jennifer Cavalieri, Jane Lynch, Stephen Lanspa, Tom Smyrk, Patrick Lynch, Thomas Drouhard, Kenneth W. Kinzler, Bert Vogelstein, Henry T. Lynch, Albert de la Chapelle, and Päivi Peltomäki (1994), “Mismatch Repair Genes on Chromosomes 2p and 3p Account for a Major Share of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Families Evaluable by Linkage”, Am J Hum Genet, 55(4): 659–665.
    
21. 
    Modrich P (2006), “Mechanisms in eukaryotic mismatch repair”, J Biol Chem, 281(41), 30305-30309.
    
22. 
    Myers RM, Maniatis T, Lerman LS. Detection and localization of single base changes by denaturing gradient gel electrophoresis. Methods Enzymol. 155: 501-527, 1987.
    
23. 
    Ohmiya N, Matsumoto S, Yamamoto H, Baranovskaya S, Malkhosyan SR, Perucho M (2001), “Germline ADN somatic mutations in hMSH6 ADN hMSH3 in gastrointestinal cancers of the microsatellite mutator phonotype” Gene, 272(1-2), pp. 301-313.
    
24. 
    Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T (1989), “Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single strand conformation polymorphism”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, pp. 2766-2770.
    
25. 
    Papp J, Kovacs ME, Olah E (2007), “Germline MLH1 ADN MSH2 mutational spectrum including frequent large genomic aberrations in Hungarian hereditary non-polyposis colorectal cancer families: implications for genetic testing”, World J Gastroenterol,13(19), pp. 2727-2732.
    
26. 
    Peltomäki P (2005), “Lynch syndrome genes”, Fam Cancer, 4(3), pp. 227-232.
    
27. 
    Peltomäki P, Vasen HF (1997), “Mutations predisposing to hereditary nonpolyposis colorectal cancer: database ADN results of a collaborative study”, The International Collaborative Group on Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer, Gastroenterology, 113(4), pp. 1146-1158.
    
28. 
    Salehi M, Amani S, Javan S, Emami M. H, Salamat M. R, and Noori Daloii M. R. 2009 Evaluation of MLH1 and MSH2 Gene Mutations in a Subset of Iranian Families with Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (HNPCC). Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran 20(1): 7-12.
    
29. 
    Screening for Lynch Syndrome by Microsatellite Instability Analysis and Immunohistochemistry – Jason D. Merker, MD, PhD,CAP Molecular Oncology Committee.
    
30. 
    Stewart B. W. and Kleihues P. (2003), “World Cancer Report”, IARC Press, Lyon.
    
31. 
    Vasen HF, Mecklin JP, Khan PM, Lynch HT (1991), “The International Collaborative Group on Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (ICG-HNPCC)”, Dis Colon Rectum, 34(5), pp. 424-425.
    
32. 
    Vasen HF, Watson P, Mecklin JP, Lynch HT (1999), “New clinical criteria for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC, Lynch syndrome) proposed by the International Collaborative group on HNPCC”, Gastroenterology, 116(6), pp. 1453-1456.
    
33. 
    Viswanadham Duppatla, Nimesh Joseph, Desirazu N. Rao (2006), Prokaryotic DNA Mismatch Repair, Elsevier Inc, Indian.
    
34. 
    Warthin, A.S (1925), “The further of study of a cancer family”, J. Cancer Res, 279 – 286.
    
35. 
    Watson P , Lynch HT, Shaw TG, et al. (1999), “Clinical impact of molecular genetic diagnosis, genetic counseling, and management of hereditary cancer. Part I: Studies of cancer in families”, Cancer, 86(11 Suppl), pp. 2449-2456.
    
36. 
    Yamashita, K., Dai, T., Dai, Y., Yamamoto, F., Perucho (2003), “Genetics supersedes epigenetics in colon cancer phenotype”, Cancer Cell, 4: 121-131.
    
37. 
    Zhang H, Zhang YZ, Zhang MZ, Sheng JQ, Fu L, Huang JS, Han M, Mu H, Li AQ, Wu ZT, Han Y, Li SR (2008), “Mismatch repair gene mutations in Chinese HNPCC patients”, Cytogenet Genome Res, 122, pp. 22-27.
    

38. 
    http://atlasgeneticsoncology.org
    
39. 
    http://biosiva.50webs.org
    
40. 
    http://ghr.nlm.nhi.gov/gene/MSH2
    
41. 
    http://openi.nlm.nhi.gov
    
42. 
    http://www.bookrags.com/research/heteroduplex-analysis-wog/
    
43. 
    http://www.genetests.org
    
44. 
    http://www.mayoclinic.com
    
45. 
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov