LỜi cảM Ơn trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến ts. Nguyễn Văn Rực
Tình hình nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh ở Việt Nam
tải về 306.73 Kb.
|
- Điều hướng trang này:
- CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân
- Phương pháp nghiên cứu.
- Xử lý số liệu
Tình hình nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh ở Việt NamNăm 2002 Nguyễn Văn Rực và cs sử dụng phương pháp nhuộm băng G đã phân tích NST ở 30 cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh, kết quả đã phát hiện 8 trường hợp mang NST chuyển đoạn cân bằng [4]. Trịnh Văn Bảo và cs (2002) phân tích NST và lập karyotype của 195 cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật. Kết quả các tác giả đã phát hiện 4 trường hợp mang NST chuyển đoạn hòa hợp tâm bao gồm 1 người vợ mang chuyển đoạn giữa NTS số 13 (thuộc nhóm D) với NST số 13 (thuộc nhóm D), karyotype là 45,XX, t(13q;13q); 2 trường hợp người chồng cũng mang NST chuyển đoạn giữa NST số 13 (thuộc nhóm D) với NST số 13 (thuộc nhóm D), karyotype là 45, XY, t(13q;13q); 1 trường hợp người chồng mang NST chuyển đoạn giữa NST số 13 (thuộc nhóm D) với NST số 21 (thuộc nhóm G), karyotype là 45, XY, t(13q;21q) [1]. Nguyễn Văn Rực (2004) khi phân tích NST và lập karyotype ở 100 cặp vợ chồng có con mắc hội chứng Down đã phát hiện 1 cặp vợ chồng, trong đó người vợ có karyotype bình thường (46, XX); người chồng mang NST chuyển đoạn hòa hợp tâm giữa NTS 21 (thuộc nhóm G) với NST 21 (thuộc nhóm G), karyotype là 45, XY, t(21q;21q). Tác giả cũng cho biết nguy cơ của cặp vợ chồng này là 100% sinh con Down [5]. Nguyễn Nam Thắng và cs (2004) đã báo cáo về tình hình sảy thai, thai chết lưu ở một số xã của tỉnh Thái Bình và đặc điểm NST của một số cặp vợ chồng sảy thai, thai chết lưu. Khi phân tích NST bằng kỹ thuật nhuộm băng G cho 34 người vợ và 33 người chồng có tiền sử bị sảy thai. Trong số đó đã phát hiện có 3 người mang NST chuyển đoạn hòa hợp tâm dạng cân bằng (2 nữ, 1 nam), 64 trường hợp còn lại có karyotype bình thường [12]. Phan Thị Hoan (2005) khi phân tích karyotype của 2 cặp vợ chồng sinh 2 con mắc hội chứng Down. Kết quả: 1 cặp vợ chồng có karyotype bình thường người chồng là 46, XY, người vợ là 46, XX; 1 cặp vợ chồng sinh con Down do chuyển đoạn hòa hợp tâm giữa NST số 13 với NST số 21 thì người vợ mang NST chuyển đoạn có karyotype là 45, XX, t(13q;21q), người chồng có karyotype bình thường 46, XY [2]. Nguyễn Văn Rực và cs (2006) phân tích NST ở 69 cặp vợ chồng (138 trường hợp) sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. Kết quả thu được có 7 trường hợp bị rối loạn NST cân bằng chiếm 5,07% bao gồm 3 nữ và 4 nam. Trong đó có 6 trường hợp là rối loạn về cấu trúc (3 chuyển đoạn tương hỗ và 3 chuyển đoạn hòa hợp tâm), 1 trường hợp mang rối loạn về số lượng NST [6]. Cũng trong năm 2006 Nguyễn Văn Rực đã báo cáo nguy cơ bất thường về sinh sản ở một số cặp vợ chồng mang NST chuyển đoạn cân bằng. Trong số 9 cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh đã được phát hiện là mang NST chuyển đoạn cân bằng. Trong đó có 4 trường hợp gặp ở người vợ và 5 trường hợp gặp ở người chồng. Trong 9 trường hợp mang NST chuyển đoạn này có 8 trường hợp là kiểu chuyển đoạn hòa hợp tâm và 1 trường hợp là kiểu chuyển đoạn tương hỗ [7]. Nguyễn Văn Rực (2008) phân tích NST ở 157 cặp vợ chồng sinh con Down đã phát hiện 3 cặp vợ chồng (chiếm tỷ lệ 1,9%) có karyotype bất thường mang NST chuyển đoạn hòa hợp tâm. Một cặp mang NST chuyển đoạn hòa hợp tâm giữa NST số 14 với NST số 21, ở 2 cặp (người chồng hoặc người vợ) mang NST chuyển đoạn hòa hợp tâm giữa NST số 21 với NST số 21 [9]. CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Từ tháng 10 năm 2009 đến tháng 10 năm 2011, tổng số 350 cặp vợ chồng (700 trường hợp) có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh từ các bệnh viện Phụ sản Trung Ương, bệnh viện Phụ sản Hà Nội, Khoa sản bệnh viện Bạch Mai…. đã gửi đến bộ môn Y sinh học – Di truyền , trường Đại học Y Hà Nội yêu cầu xét nghiệm NST
Những cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp ít nhất từ hai lần trở lên hoặc sảy thai và sinh con bị dị tật bẩm sinh.
Những cặp vợ chồng có tiền sử mắc các bệnh mãn tính (viêm gan siêu vi trùng, bệnh đái đường…) hoặc có tiếp xúc với các loại hóa chất độc, thuốc bảo vệ thực vật, nghiện rượu hoặc thuốc lá… hoặc những cặp vợ chồng đang mang thai nhưng bị tai nạn lao động hoặc giao thông v v.…
Những cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh đã được thăm khám lâm sàng, khai thác về tiền sử gia đình, tiền sử bản thân bao gồm: tuổi, nghề nghiệp, các bệnh mãn tính (bệnh đái tháo đường, các bệnh về tuyến giáp…), các bệnh nhiễm trùng (viêm gan siêu vi trùng, các bệnh phụ khoa…), có tiếp xúc với các hóa chất độc, thuốc bảo vệ thực vật, có nghiện rượu, thuốc lá… và tiền sử về sản khoa….
Lấy 2ml máu tĩnh mạch cho vào ống li tâm đã được tráng bằng heparin đậy nút cao su kín và vô trùng. Các bước nuôi cấy phải được thực hiện trong buồng cấy tế bào trong điều kiện vô trùng. Dùng ống hút nhỏ giọt pipet Pasteur cho từ 6 – 8 giọt máu toàn phần vào túyp nuôi cấy có chứa 6ml môi trường nuôi cấy F10 hoặc F12, 2ml huyết thanh bê và 0,1ml PHA ( phytohemagglutinin). Đậy nắp rồi để túyp nuôi cấy trong tủ ấm 37oC thời gian 72 giờ. Đến giờ thứ 70 bổ sung vào túyp nuôi cấy 1ml dung dịch Colcemid với nồng độ 1µg/1ml để tích lũy nhiều cụm kỳ giữa và thu hoạch tế bào ở giờ thứ 72.
- Túyp nuôi cấy được li tâm với tốc độ 800 – 1000 vòng/1 phút thời gian 10 phút. - Loại bỏ dịch phía trên giữ lại phần cặn lắng chứa các tế bào, 30ml dung dịch nhược trương KCl 0,075 M cho vào túyp nuôi cấy và để trong tủ ấm 37oC thời gian khoảng 45 phút để phá vỡ màng tế bào. - Li tâm, loại bỏ phần dịch phía trên, giữ lại phần cặn chứa nhân tế bào và các cụm NST ở kỳ giữa. - Làm sạch mẫu vật bằng cách trộn với dung dịch Carnoy (3 methanol : 1 acid acetic ) rồi li tâm loại bỏ dịch nổi ở phía trên (3 lần). - Lần cuối cùng khi mẫu vật đã sạch, sau khi li tâm loại bỏ dịch ở phía trên, dùng ống hút nhỏ giọt pipet Pasteur hút lấy phần cặn chứa nhân tế bào và các cụm kỳ giữa và dàn tế bào đều lên lam kính sạch đã được để lạnh. - Để tiêu bản khô tự nhiên rồi tiến hành nhuộm tiêu bản.
- Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm băng G theo phương pháp của Seabright. M (1971). Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất: Dụng cụ: 5 cốc thủy tinh loại 100ml để đựng hóa chất và thuốc nhuộm, 2 cốc mỏ thủy tinh loại 500ml đựng nước rửa tiêu bản. Hóa chất: NaCl 0,15N, Trypsin 1: 250 (Difco) KH2PO4, Na2HPO42H2O, Giemsa. Cách pha hóa chất: Dung dịch Trypsin mẹ 5% Dung dịch Trypsin sử dụng: 1 ml dung dịch Trypsin mẹ 49 ml dung dịch NaCl 0,15N Dung dịch đệm photphat KH2PO4 : 3,56g/1 lít Na2HPO42H2O: 7,22g/1 lít H2O Dung dịch Giemsa 4%: 2 ml dung dịch Giemsa mẹ 48 ml dung dịch đệm photphat pH 6,8 Các bước tiến hành được thực hiện trong điều kiện ở nhiệt độ phòng thí nghiệm: Nhúng tiêu bản vào cốc đựng dung dịch NaCl 0,15N thời gian khoảng 25 – 30 giây. Sau đó tiêu bản được cho vào một cốc khác đựng dung dịch Trypsin 0,1% (Difco 1: 250). Rửa tiêu bản lặp lại 2 lần trong một cốc đựng dung dịch NaCl 0,15N. Tiêu bản được nhuộm bằng thuốc nhuộm Giemsa 4% pH = 7, thời gian 10 phút. Tất cả các tiêu bản sau khi nhuộm xong được rửa trong 2 cốc đựng nước máy hoặc dưới vời nước máy chảy nhẹ. Kiểm tra độ phân vùng dưới kính hiển vi, rồi sau đó để tiêu bản khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Phân tích NST được thực hiện dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Mỗi cặp vợ chồng được phân tích NST: - Với tiêu bản nhuộm băng G, chúng tôi phân tích 20 cụm kỳ giữa bao gồm: đếm số lượng NST, phát hiện những bất thường cấu trúc của NST. Trường hợp thể khảm có thể phân tích 100 cụm kỳ giữa. - Tiêu chuẩn đánh giá: quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại x1000, tìm các cụm NST của tế bào đang phân chia ở kỳ giữa. Sau đó chọn các cụm có các NST trải đều trên một diện tích và tạo thành một đám tròn tương đối đều đặn, các NST không chồng chất lên nhau có thể phân biệt được từng chiếc và đếm chính xác số lượng NST của từng cụm. Cũng trong các cụm đó, quan sát kỹ từng chiếc NST, phát hiện những bất thường về cấu trúc. Lập karyotype: Mỗi bệnh nhân được chọn 3 cụm kỳ giữa và lập karyotype trên phần mềm của vi tính theo tiêu chuẩn ISCN – 2005 (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature) . Tổng hợp các số liệu đã quan sát rồi kết luận về số lượng và cấu trúc của bộ NST.
Hình 4. Kính hiển vi 
Hình 5. Hệ thống phân tích NST tự động
Các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh được thăm khám và xét nghiệm NST, lập karyorype. Các số liệu được mã hóa nhập vào máy vi tính, xử lý và kiểm tra độ chính xác bằng các phương pháp thống kê Y học. Số liệu được xử lý và phân tích bằng chương trình Microsoft Excel 2007. Các ứng dụng: - Các hàm tính toán: SUM, AVERAGE, STDEV, MIN, MAX…. - Vẽ đồ thị và biểu đồ. Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 306.73 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|
