Hình 1.1. Các dạng kỳ hình phổ biến của tinh trùng trâu (Swamp buffalo) (Koonjaenak và cs., 2007b)

Tỷ lệ tinh trùng sống là chỉ tiêu quan trọng trong đánh giá chất lượng tinh dịch vì nó liên quan khá chặt chẽ với khả năng sinh sản của gia súc (Mahmoud và cs., 2013). Dựa vào đặc tính của màng tế bào toàn khi toàn vẹn sẽ không bắt màu thuốc nhuộm, khi màng bị tổn thương, hư hỏng, thuốc nhuộm sẽ khuếch tán thụ động bên trong tế bào do sự rối loạn tính thẩm thấu của màng. Do vậy, để xác định tỷ lệ tinh trùng sống và chết, người ta sử dụng các loại thuốc nhuộm như aniline-eosin, eosin-nigrosin hoặc eosin-fast green, sau đó sử dụng kính hiển vi để đếm và tính toán (Campbell và cs, 1956; Agnieszka và cs., 2012).

Nordin và cs. (1990) cho biết, trâu đầm lầy ở Malaysia có tỷ lệ tinh trùng sống ở các độ tuổi từ 29 đến 32 tháng tuổi, 33 đến 41 tháng tuổi, 42 đến 53 tháng tuổi, 54 đến 65 tháng tuổi và trên 65 tháng tuổi lần lượt là 64,2%, 67,2%, 66,9%, 65,5% và 69,9%.

Ở Ai Cập, tỷ lệ tinh trùng sống trong tinh dịch của trâu đạt 70,9% và dao động từ 69,0% đến 73,3%. Sau khi đông lạnh, tỷ lệ tinh trùng sống còn 61,76% và dao động từ 58,73% đến 65,67%. Mối tương quan giữa tỷ lệ tinh trùng sống và tỷ lệ thụ thai trong TTNT là khá chặt chẽ (r=0,65) (Mahmoud và cs., 2013).

Theo Capitan và cs. (1990), tỷ lệ tinh trùng sống ở trâu Murrah đạt 77,77%, khi sử dụng PGF₂α tỷ lệ tinh trùng sống tăng lên 92,98%. Một báo cáo khác của Tomar và cs. (1966) cho biết, trâu Murrah có tỷ lệ tinh trùng sống ở mùa hạ đạt 85,4%, mùa thu đạt 85%, mùa đông đạt 82,4% và mùa xuân đạt 67,2%.

1.3. MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN MỘT SỐ CHỈ TIÊU SỐ LƯỢNG VÀ CHẤT LƯỢNG TINH DỊCH TRÂU

Các chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh dịch gia súc nói chung và trâu nói riêng có mối tương quan với nhau và chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như giống, cá thể, lứa tuổi, mùa vụ, thức ăn, quản lý khai thác tinh (Nazir, 1988; McCool và Entwistle, 1989; Suryaprakasam và cs., 1993; Javed và cs., 2000, Shukla và Misra, 2005; Koonjaenak và cs., 2007a; Elrabie và cs., 2008; Al-Sahaf và Ibrahim, 2012; Da Luz và cs., 2013; Dahiya và Singh, 2013).

1.3.1. Giống và cá thể

Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả đã chứng minh rằng, các giống trâu khác nhau có các đặc điểm chất lượng tinh dịch khác nhau. Nghiên cứu so sánh trâu địa phương, trâu Murrah và trâu Surti ở Sri Lanka, Rajamahendran và Manickavadivale (1981) thấy rằng, lượng xuất tinh và nồng độ tinh trùng đạt cao nhất ở trâu Murrah. Trâu địa phương có lượng xuất tinh và tỷ lệ tinh trùng kỳ hình lớn hơn trâu Surti nhưng có nồng độ tinh trùng nhỏ hơn.

Lượng xuất tinh trung bình của trâu đầm lầy trưởng thành đạt 3,7 ml (Nordin và cs., 1990), trâu Murrah đạt từ 2,58ml (Bhakat và cs., 2011), trâu Nili-Ravi đạt tới 4,96ml (Javed và cs., 2000), còn trâu Jafarabadi có lượng xuất tinh lên tới 5,09 ml (Shelke và Dhami, 2001). Rehman và cs. (2012) cho biết, trâu Kundi có pH tinh dịch đạt 5,81 và dao động từ 5,15 đến 6,53 thấp hơn nhiều so với trâu đầm lầy và các giống trâu sông khác như Murrah, Nili-Ravi, Surti .., pH dao động từ 6,26 đến 7,5 (Terezinha và cs., 1991; Younis, 1996; Vale, 1994a; Javed và cs., 2000; Mandal và cs., 2000; Sajjad và cs., 2007; Koonjaenak và cs., 2007a; Khawaskar và cs., 2012). Trâu đầm lầy trưởng thành có tỷ lệ tinh trùng sống 69,9% (Nordin và cs., 1990), còn trâu Murrah tỷ lệ tinh trùng sống ở trâu Murra đạt 77,77% (Capitan và cs., 1990) và trâu Surti có tỷ lệ tinh trùng sống lên tới 85,87% (Khawaskar và cs., 2012).

Nhiều nghiên cứu cũng cho biết, giữa các cá thể trâu có sự khác biệt về một số chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh dịch (Mohan và Sahni, 1990; Galli và cs., 1993; Kumar và cs., 1993a). McCool và Entwistle (1989) thấy có sự khác biệt giữa các cá thể trâu đầm lầy về chu vi dịch hoàn, tuổi dậy thì, thành thục tính dục từ đó ảnh hưởng tới số lượng, chất lượng tinh. Các nghiên cứu trên trâu Murrah và trâu Surti cũng có kết quả tương tự. Giữa các cá thể trâu Surti có sự khác nhau về lượng xuất tinh, nồng độ tinh trùng và tỷ lệ tinh trùng sống (Khawaskar và cs., 2012). Mahmoud và cs. (2013) cho biết, các cá thể trâu Murrah khác nhau đáng kể về lượng xuất tinh và nồng độ tinh trùng (P <0,05).

Quá trình sinh tinh ở trâu đực bắt đầu khá sớm, từ 6 tháng tuổi đã có thể quan sát thấy sự phát triển của các tế bào sertoli trong ống sinh tinh, đến 12 tháng tuổi xuất hiện các các tế bào sertoli hoàn chỉnh, từ 15 tháng tuổi trở đi bắt đầu có tế bào tinh trùng trong ống sinh tinh, đến 29 tháng tuổi trâu có tinh trùng hoàn chỉnh, nhưng đến 32 tháng tuổi các ống sinh tinh mới phát triển hoàn thiện (Nordin và cs., 1985; Ahmad và cs., 2010).

Champawat và cs. (1999) thấy rằng trâu Surti có tuổi dậy thì ở 16-18 tháng tuổi và có thể thành thục tính dục vào 24 tháng tuổi. Nhưng ở trâu đầm lầy, tuổi dậy thì đạt được 24 tháng tuổi và thành thục tính dục ở giai đoạn từ 30 đến 33 tháng tuổi (McCool và  Entwistle, 1989).

Tác giả Jainudeen và cs. (1982) cho biết, lượng xuất tinh tăng theo tuổi ở trâu đầm lầy. Nordin và cs. (1990), Koonjaenak và cs. (2007a) và Nasir và cs. (2012) thấy rằng, hoạt lực tinh trùng của trâu đầm lầy có sự khác nhau giữa các độ tuổi. Theo Koonjaenak và cs. (2007b), tuổi ảnh hưởng đến dạng tinh trùng kỳ hình có giọt bào tương ở trâu đầm lầy. Còn ở trâu sông, Javed và cs. (2000) quan sát thấy có sự khác biệt đáng kể lượng xuất tinh giữa các trâu có độ tuổi khác nhau. Những trâu già kém hơn trâu trẻ ở chỉ tiêu hoạt lực tinh trùng (Younis, 1996) và nồng độ tinh trùng (Javed và cs., 2000).

Trâu Murrah có mối tương quan mạnh mẽ giữa tuổi tác, chu vi dịch hoàn và khối lượng cơ thể (Suryaprakasam và cs., 1993; Sajjad và cs., 2007; Nair và cs., 2012; Da Luz và cs., 2013). Chu vi dịch hoàn tăng nhanh từ 3,5 đến 4,5 năm tuổi và sau đó tăng trưởng chậm lại, lượng xuất tinh và nồng độ tinh trùng tăng tuyến tính đến 6 năm tuổi và sau đó có xu hướng giảm đi (Suryaprakasam và cs., 1993). Mức độ testosterone huyết thanh của trâu có mối tương quan thuận (r = 0,414, p < 0,05) với chu vi dịch hoàn và lượng xuất tinh (r = 0,348) (Sajjad và cs., 2007). Đây là lý do ham muốn tình dục của con đực trưởng thành cao hơn so với con đực già hay trẻ (Younis và cs., 2003). Điều này phù hợp với công bố của nhiều tác giả đã khẳng định rằng tinh dịch trâu Murrah có chất lượng tốt nhất trong giai đoạn từ 3 đến 5 năm tuổi (Chinnaiya và Ganguli, 1990; Kumar và cs., 1993a; Singh và cs., 2004).

1.3.3. Mùa vụ

Yếu tố mùa vụ ảnh hưởng trực tiếp tới gia súc thông qua nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa … ở cả khí hậu trong và ngoài chuồng nuôi và ảnh hưởng gián tiếp bởi stress nhiệt cao trong mùa hạ. Đặc biệt, do có da màu đen, lông thưa nên cơ thể trâu hấp thụ một lượng lớn bức xạ nhiệt của mặt trời và đồng thời trâu có khả năng đổ mồ hôi kém hơn các gia súc khác do vậy chúng cần bóng râm, nước hoặc bùn để làm mát cơ thể (Nowak, 1999).

Stress nhiệt trong mùa hạ có ảnh hưởng đa chiều tới khả năng sinh sản của trâu đực. Nó ức chế hoạt động tiết hormone sinh sản GnRH, FSH và LH bằng cách tăng nồng độ corticosteroid trong huyết tương (Clarke và Tilbrook, 1992). Trong mùa hạ, nồng độ thyroxin tiết giảm dẫn đến giảm lượng thức ăn ăn vào của động vật, giảm sự trao đổi chất (Madan, 1985) và từ đó làm giảm quá trình sinh tinh (Zafar và cs., 1988). Do con gia súc bị stress nhiệt nên có thể kiệt sức và giảm hưng phấn sinh dục, giảm khả năng khải thác tinh (Mandal và cs., 2000).

Vale (1997) cho rằng thời gian chiếu sáng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng khả năng sinh sản và hoạt động tình dục của trâu đực. Ở các khu vực ôn đới, tinh dịch gia súc có chất lượng tốt ở mùa đông và mùa xuân (Mohan và Sahni, 1990; Galli và cs., 1993). Ở vùng nhiệt đới như Brazil, từ tháng Giêng đến tháng Sáu, trâu có số lượng, chất lượng tinh tốt nhất (Vale, 1994b). Mandal và cs. (2000) cho biết, hoạt lực tinh trùng trâu trong mùa xuân và mùa mưa là tốt hơn trong mùa hạ nóng ẩm.

Al-Sahaf và Ibrahim (2012) cho biết, hoạt động sinh sản của trâu và số lượng, chất lượng tinh dịch tăng lên trong những tháng có nhiệt độ vừa và thấp, giảm trong những tháng có nhiệt độ cao. Sự gia tăng của nhiệt độ môi trường xung quanh trong những tháng nóng dẫn đến xáo trộn trong hoạt động sinh sản của trâu. Đặc tính sinh sản theo mùa trâu phụ thuộc vào hàm lượng melatonin bài tiết từ tuyến tùng trong đêm và phản ứng của các tín hiệu nội tiết theo ban ngày và ban đêm trong môi trường (Zicarelli và cs., 1997; Di Palo và cs.,1997).

Koonjaenak và cs. (2007b) cho biết, mùa vụ trong năm ảnh hưởng đến dạng tinh trùng kỳ hình đầu quả lê. Còn các chỉ tiêu lượng xuất tinh, hoạt lực tinh trùng, nồng độ tinh trùng không bị ảnh hưởng bởi yếu tố mùa vụ Koonjaenak và cs. (2007a).

Thức ăn có vai trò đặc biệt quan trọng trong sinh trưởng phát triển và sinh sản của gia súc. Đây là một trong những yếu tố quyết định đến số lượng, chất lượng tinh dịch của con đực (Chinnaiya và Ganguli, 1990; Dahiya và Singh, 2003; Dahiya và cs., 2006). Thiếu hụt dinh dưỡng là những nguyên nhân phổ biến nhất của việc suy giảm khả năng sinh sản gia súc như dậy thì muộn, giảm và mất tính hưng phấn sinh dục, giảm chất lượng tinh dịch (Pant, 2002).

Việc cho trâu ăn khẩu phần thích hợp từ trước tuổi dậy thì là yếu tố quan trọng cho sự phát triển khả năng sinh sản của trâu (Dahiya và Singh, 2013). Tuy nhiên, nếu khẩu phần thức ăn làm tăng lượng mỡ tích lũy và gây tích tụ mỡ ở dịch hoàn sẽ làm mất cân bằng trao đổi nhiệt và làm giảm hoạt lực tinh trùng, tăng tỷ lệ tinh trùng kỳ hình ở trâu đực (Vale, 1994a và 1997). Có thể sử dụng các tiêu chuẩn ăn của Kearl (1982), của Mandal và cs. (2003) và tiêu chuẩn gần đây nhất của Paul và Lal (2010) dựa trên tiêu chuẩn của NRC dùng để tính toán khẩu phần thức ăn hợp lý nhất cho trâu.

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc thiếu hụt dinh dưỡng vitamin, khoáng chất đa lượng và vi lượng đã làm giảm chất lượng tinh dịch. Vitamin A và E có liên quan trực tiếp đến chất lượng của tinh dịch trong tất cả các loài vật nuôi. Thiếu hụt selen làm tăng kỳ hình đuôi tinh trùng. Chế độ ăn uống bổ sung với vitamin E hoặc selen đã cải thiện tinh dịch đặc điểm hình thái và acrosom (Gokcen và cs., 1990), tiêm vitamin A, D và E định kỳ sẽ cải thiện chất lượng tinh dịch (Singh và cs., 2001). Hàm lượng kẽm có liên quan đến quá trình trao đổi chất của tinh trùng và từ đó ảnh hưởng tới hoạt lực tinh trùng (Ahmed và El-Tohamy, 1997). Các axit amin cũng có tác dụng cải thiện chất lượng tinh dịch, việc bổ sung lysine và methionine vào thức ăn cho trâu giúp tăng số lượng, chất lượng tinh dịch và chất lượng tinh đông lạnh (Singh và cs., 2000a). Kết quả nghiên cứu bổ sung thức ăn cho trâu đực trẻ từ 15 tháng tuổi cho thấy, trâu đực sử dụng thức ăn có khô dầu hạt bông có thời gian khai thác tinh sớm nhất và nồng độ tinh trùng đạt cao nhất. Việc bổ sung thức ăn khác nhau cho trâu đực trẻ đã ảnh hưởng đồng thời ảnh hưởng đến chất lượng tinh do tác động tới nồng độ testosteron trong máu (Dahiya và Singh, 2013). Ngoài ra, việc giảm thức ăn xơ thô, bổ sung các chất chống oxy hóa (kẽm, selen, vitamin E) trong mùa hạ cũng có tác dụng cải thiện sức khỏe và khả năng sinh sản của gia súc (Dahiya và Singh, 2013).

Các yếu tố quản lý, chăm sóc, khai thác và sản xuất tinh đông lạnh cũng ảnh hưởng tới chất lượng tinh trâu (Chinnaiya và Ganguli, 1990; Dahiya và Singh, 2013). Bổ sung protein vào thức ăn và thường xuyên cho trâu vận động giúp tăng chất lượng tinh trùng (Prajapati và cs., 1998). Việc phun nước làm mát cho trâu trong những tháng mùa hạ nóng làm giữ ổn định chất lượng tinh dịch trong năm (Jainudeen và cs., 1982; Singh và cs., 2001). Kỹ thuật kích thích hưng phấn nhảy giá khai thác tinh ở trâu đực làm tăng nồng độ tinh trùng (Jainudeen và cs., 1982). Nền khu vực khai thác tinh được trải đệm cao su sẽ có ảnh hưởng tốt hơn tới khả năng xuất tinh của gia súc so với nền đất sét và nền bê tông (Elrabie và cs., 2008). Koonjaenak và cs. (2007b) thấy rằng, ảnh hưởng của tần suất khai thác tinh ảnh hưởng đến các dạng kỳ hình kích thước đầu tinh trùng, kỳ hình đuôi có mảng bám và đuôi cong. Anilkumar và cs. (2011) cho biết, số lần khai thác tinh ảnh hưởng đến hoạt lực tinh trùng trâu.

Ngoài ra, việc tiêm phòng bệnh truyền nhiễm, một mặt giúp gia súc tránh được bệnh dịch nhưng mặt khác cũng làm ảnh hưởng đến số lượng, chất lượng tinh dịch vì tiêm phòng vắc xin gây phản ứng sốt sau tiêm chủng. Tiêm phòng vắc xin lở mồm long móng tác động xấu đến chất lượng tinh dịch của cả trâu và bò, làm giảm khối lượng và nồng độ tinh trùng, hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống (Bhakat và cs., 2010). Những phản ứng miễn dịch trong cơ thể sau khi tiêm vắc xin dẫn đến tăng số lượng tinh trùng đã chết (Mann và Mann, 1981).

Khai thác tinh một lần trong một tuần là hợp lý nhất cho gia súc có độ tuổi từ 2 đến 3 năm. Việc thực hiện tốt kỹ năng kích thích hưng phấn nhảy giá và kỹ thuật lấy tinh bằng âm đạo giả của người khai thác tinh gia súc sẽ giúp thu được số lượng tinh dịch nhiều hơn (Almquist, 1973). Yates và cs. (2003) cho biết, khai thác tinh gia súc vào ban đêm cho kết quả tốt hơn ban ngày do ban ngày có nhiều yếu tố xã hội tác động làm giảm sự tập trung trong công việc.

1.4. ĐÔNG LẠNH TINH TRÙNG TRÂU

Việc đông lạnh tinh trùng dựa vào đặc tính thích ứng của các tế bào sinh học với quá trình sốc nhiệt và áp suất thẩm thấm xảy ra trong quá trình pha loãng tinh dịch, làm mát, đông lạnh và giải đông tinh trùng (Watson và cs., 1992; Holt, 2000a, b). Ở mỗi công đoạn của quá trình đông lạnh (khai thác tinh dịch, pha loãng tinh dịch, cân bằng và đông lạnh tinh trùng) tinh trùng đều có thể bị mất khả năng thụ tinh (Watson, 1995). Do đó, quá trình đông lạnh phải được tối ưu hóa nhằm đảm bảo tốt nhất chất lượng tinh trùng (Sundararaman và Edwin, 2008).

Ban đầu, tinh dịch gia súc được pha loãng với môi trường thích hợp và bảo quản lạnh ở nhiệt độ từ 0⁰C đến 4⁰C, có thể sử dụng trong vòng 72 giờ (tinh lỏng). Sau đó, người ta đã nghiên cứu thành công việc đông lạnh tinh gia súc nói chung và tinh trâu nói riêng bằng môi trường pha loãng và phương pháp đông lạnh phù hợp (tinh viên, tinh cọng rạ …) và có thể bảo quản lạnh tinh trùng trong nitơ lỏng -196⁰C với thời gian dài mà vẫn đảm bảo các điều kiện đậu thai.

Đối với trâu, việc đông lạnh tinh trùng gặp nhiều khó khăn hơn do tế bào tinh trùng trâu có lớp màng mỏng, nồng độ các phospholipid thấp và tinh dịch có đặc điểm sinh hóa không thuận lợi cho việc bảo tồn đông lạnh (Banerjee và cs., 1973; Jain và Anand, 1976). Tuy nhiên, những nghiên cứu đông lạnh tinh trâu đã đạt được nhiều kết quả đáng khích lệ, Bhattacharya và Srivastava (1955) lần đầu tiên công bố kết quả đông lạnh tinh trùng trâu ở Ấn Độ, sau đó có nhiều tác giả nghiên cứu tiếp theo đã chứng minh rằng, nếu sử dụng các hóa chất môi trường pha loãng tinh dịch và phương pháp đông lạnh phù hợp, tinh trùng trâu có thể bảo quản lạnh với chất lượng tốt và có tỷ lệ thụ thai cao khi phối giống TTNT cho đàn trâu cái (Singh và cs., 1995; Siddique và cs., 2006; Shukla và Misra, 2007; El-Sheshtawy và cs., 2008, Andrabi, 2009; Akhter và cs., 2011; Beheshti và cs., 2011; El-Kon, 2011; Sadeg và cs., 2011; Ansari và cs., 2011).

Môi trường pha loãng tinh dịch là yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến sự tồn tại của tinh trùng trong quá trình đông lạnh (Rasul và cs., 2000). Đã có nhiều công trình nghiên cứu về các môi trường pha loãng tinh dịch trâu với thành phần gồm nhiều chất khác nhau.

Tris (hydroxymethyl -amino-methane) là một hóa chất quan trọng trong quá trình đông lạnh tinh dịch gia súc (Rasul và cs., 2001, Barbas và Mascarenhas, 2009). Các tác giả Ahmad và cs. (1986), Dhami và cs. (1994) thấy rằng tris giúp hoạt lực sau giải đông của tinh trùng trâu đạt kết quả tốt hơn so với citrate và axit citric. Một nghiên cứu của tác giả Singh và cs. (2000b) cũng cho biết, tris giúp hoạt lực tinh trùng trâu sau giải đông tốt hơn so với 2 môi trường của hãng IMV (Pháp) là Laiciphos và Biociphos. Rasul và cs. (2000) thử nghiệm 4 môi trường Tris-natri citrat, Tris- axit citric, Tris-Tes hoặc Tris-Hepes đông lạnh tinh trùng trâu, kết quả cho thấy môi trường Tris-natri citrat giúp cho hoạt lực tinh trùng sau giải đông tốt hơn nhưng tính toàn vẹn của màng tế bào và mức độ tổn thương acrosom là không có sự khác nhau giữa các môi trường. Theo Andrabi (2009), Tris-citric axit có thể cung cấp các hệ thống đệm tốt nhất để cải thiện chất lượng tinh trùng sau giải đông và do đó cũng có thể cải thiện khả năng sinh sản của tinh trùng trâu. Tris-citric và Tris-citrate làm tăng hoạt lực và khả năng sống của tinh trùng sau giải đông (Ahmad và cs., 1986; Dhami và cs., 1994). Nguyên nhân do Tris góp phần phát sinh dehydrogenase lactic và sorbitol dehydrogenase, cung cấp sự bảo vệ acrosome cho tinh trùng (Singh và cs., 1990 và 1991).

Glycerol là chất bảo vệ lạnh được sử dụng nhiều nhất trong các môi trường pha loãng tinh dịch. Glycerol có khả năng tạo liên kết hydrô với nước và thấm qua màng tế bào, không độc hại trong quá trình tiếp xúc với các tế bào trong nồng độ giữa khoảng 1 mol/lít đến 5 mol/lít, tùy thuộc vào loại tế bào và điều kiện tiếp xúc (Fuller và Paynter, 2004). Tác dụng bảo vệ tinh trùng trong quá trình đông lạnh của glycerol do nó tăng áp suất thẩm thấu của dịch ngoại bào để kéo nước trong tế bào ra ngoài, qua đó làm giảm nguy cơ hình thành tinh thể băng trong tế bào, hạ thấp điểm đóng băng của nước trong tế bào (Holt, 2000b; Medeiros và cs., 2002; Lemma, 2011). Các nhóm tác giả Ramakrishnan và Ariff (1994) và Nastri và cs. (1994) nghiên cứu thấy rằng khi giảm nồng độ glycerol trong môi trường pha loãng tinh dịch xuống dưới 5% sẽ làm giảm hoạt lực sau giải đông và tăng tổn thương acrosom. Một nghiên cứu khác của Abbas và Andrabi (2002) về ảnh hưởng của các nồng độ glycerol khác nhau trong môi trường pha loãng tinh trâu (2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 10% hoặc 12%) cho biết, ở nồng độ 7% glycerol tinh trùng trâu sau giải đông có hoạt lực, tỷ lệ sống và tính toàn vẹn màng tế bào tốt hơn so với các nồng độ glycerol khác. Tác giả Singh và cs. (2006) cho biết, phương pháp pha loãng glycerol một bước (glycerolization procedure one step) vào môi trường giúp cho hoạt lực tinh trùng sau giải đông cao hơn so với phương pháp pha loãng glycerol 2 bước (glycerolization procedure two steps).

Ngoài glycerol, các chất bảo vệ lạnh như ethylene glycol, propylene glycol, dimethyl sulfoxide (DMSO), polyethylene glycol (PEG) cũng được một số tác giả nghiên cứu. Các nhóm tác giả Valdez và cs. (2003) và Rohilla và cs. (2005) đã thử nghiệm ethylene glycol hoặc propylene glycol trong đông lạnh tinh trùng trâu, kết quả sơ bộ cho thấy ethylene glycol có tác dụng tốt. Rasul và cs. (2007) nghiên cứu so sánh glycerol và DMSO bảo vệ lạnh cho tinh trùng trâu, kết quả cho thấy DMSO không cải thiện được chất lượng tinh trùng sau giải đông. Polyethylene glycol (PEG) là một chất có tác dụng làm giảm quá trình tạo tinh thể băng nhờ khả năng liên kết với nước, làm giảm nhiệt độ đóng băng của nước, qua đó giúp bảo vệ màng tế bào trong đông lạnh tinh trùng, việc bổ sung PEG 20 trong môi trường pha loãng tinh dịch trâu giúp cải thiện chất lượng tinh sau giải đông (Cheshmedjieva và cs., 1996).

Lòng đỏ trứng gà là một thành phần phổ biến trong các môi trường đông lạnh tinh dịch cho hầu hết các loài vật nuôi, bao gồm cả trâu (Sansone và cs., 2000). Thành phần lipoprotein (low density lipoproteins - LDL) có trong lòng đỏ trứng là yếu tố quan trọng bảo vệ tinh trùng trong quá trình đông lạnh (Pace và Graham, 1974; Watson, 1976). LDL bảo đảm tính ổn định của màng tinh trùng, các phospholipid có trong LDL tạo một lớp màng bảo vệ bề mặt tinh trùng hoặc thay thế các màng phospholipid của tinh trùng bị tổn thương trong quá trình đông lạnh (Foulkes và cs., 1980; Graham và Foote, 1987). Ngoài ra, LDL còn có tác dụng bắt giữ những protein có hại trong bào tương của tinh trùng, do vậy nâng cao khả năng chịu lạnh của tinh trùng (Bergeron và Manjunath, 2006). Nồng độ lòng đỏ trứng cho đông lạnh tinh dịch trâu cần đạt 20% lượng môi trường pha loãng tinh dịch (Sansone và cs., 2000; Andrabi và cs., 2008b). Gần đây, Andrabi và cs. (2008a) đã nghiên cứu sử dụng lòng đỏ trứng vịt, lòng đỏ trứng gà Ghinê và lòng đỏ trứng gà bản địa của Ấn Độ (Desi) bổ sung trong môi trường pha loãng tinh dịch trâu, kết quả cho thấy lòng đỏ trứng vịt cũng có tác dụng bảo vệ tinh trùng trâu trong quá trình đông lạnh. Kết quả này tương tự với công bố của Waheed và cs. (2012), lòng đỏ trứng vịt có tác dụng tốt trong bảo quản lạnh tinh trùng trâu Nili-Ravi. Ngoài ra, có thể sử dụng 25% sữa đậu nành thay cho lòng đỏ trứng gà trong bảo quản tinh dịch trâu (Singh và cs., 2014).

Các loại đường đa phân tử không có khả năng khuếch tán qua màng tế bào như lactose, fructose, sucrose, raffinose, trehalose hoặc dextrans là thành phần bảo vệ lạnh trong môi trường pha loãng. Đường tạo ra một áp suất thẩm thấu, gây mất nước trong tế bào, do vậy giảm tỷ lệ nước đóng băng trong tế bào. Các loại đường cũng tương tác với các phospholipid trong màng tế bào giúp cho màng tế bào ít bị tác động xấu trong quá trình đông lạnh (Molinia và cs., 1994). Tác giả Ahmad và Chaudhry (1980) cho biết, môi trường pha loãng tinh dịch có 11% lactose và 6% fructose giúp cho hoạt lực tinh trùng sau giải đông đạt kết quả tốt nhất. Ala-Ud và cs. (1981) tiến hành so sánh hoạt lực tinh trùng sau giải đông khi đông lạnh tinh trâu với 4 môi trường pha loãng tinh dịch (sữa nguyên kem, Laiciphos (IMV), lactose và citrate) và thấy rằng môi trường lactose cho kết quả tốt nhất.

Trong tinh dịch trâu có các loại vi sinh vật khác nhau như một số loại vi khuẩn Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, nấm men … (Ramaswamy và cs., 2002; Kapoor, 2003), chúng làm giảm khả năng vận động của tinh trùng (Panangala và cs., 1981), tổn thương acrosome (El- Mulla và cs., 1996), tiết độc tố gây hại tinh trùng (Morrell, 2006), do vậy các loại kháng sinh được bổ sung vào môi trường pha loãng tinh dịch để tiêu diệt các vi khuẩn có trong tinh dịch nhưng không ảnh hưởng xấu đến chất lượng tinh trùng. Sandeep và cs. (2000) thấy rằng, penicillin (500 IU), streptomycin (500mg) và gentamicin hoặc chloramphenicol (500mg) làm giảm số lượng vi khuẩn trong tinh dịch đến mức gần như không đáng kể. Tác giả Ramaswamy và cs. (2002) kiểm tra thấy các loại vi sinh vật có trong tinh dịch trâu đều mẫn cảm với chloramphenicol, ciprofloxacin, gentamicin và neomycin. Ahmed và Greesh (2002) sử dụng gentamicin, amikacin, norfloxacin thấy đạt hiệu quả tốt trong xử lý tinh dịch trâu. Kapoor (2003) cho rằng ciprofloxacin hoặc amikacin có thể được sử dụng như chất phụ gia pha loãng tinh dịch để kiểm soát nhiễm khuẩn của mẫu tinh trùng đông lạnh. Theo Alavi-Shoushtari và cs. (2007) thấy rằng trong các loại kháng sinh tiamulin, neomycin, tetracyclin, fluorophenicol, penicillin G, linco-spectin, erythromycin và oxytetracycline bổ sung vào tinh dịch trâu nhằm chống lại sự nhiễm khuẩn thì chỉ có penicillin G là đem lại hiểu quả cao mà không làm ảnh hưởng tới sức sống của tinh trùng trâu. Sansone và cs. (2000) cũng cho biết rằng, các môi trường pha loãng tinh dịch gia súc thường bổ sung penicilin (1.000 UI/ml) và streptomycin (100mg/ml).

Kết quả bảo tồn tinh dịch phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố mang tính đặc trưng của giống và chế độ đông lạnh cho từng loại tinh dịch mà ta bảo tồn. Một số tác giả cho rằng sức đề kháng thấp của các tế bào tinh trùng trâu như là một yếu tố nội tại và có sự khác nhau về nồng độ của acid citric, Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, bicarbonate, fructose, vô cơ phốt pho (Pi) và các chất tổng số chất chống oxy hóa trong tinh dịch trâu so với bò (Singh và cs., 1969; Bhoreskar, 1993). Khả năng duy trì hoạt lực và khả năng sống của tinh trùng trâu trong đường sinh dục con cái ngắn hơn so với bò (6,2 giờ so với 9,11 giờ). Do màng lipid của tinh trùng trâu có tính nhạy cảm cao và dễ bị hư hỏng vì có hàm lượng acid béo không no cao. Quá trình đông lạnh tinh dịch làm tăng khả năng mẫn cảm của tinh trùng với quá trình oxy hoá lipid màng và là nguyên nhân làm tăng các gốc tự do, làm giảm hoạt tính các emzym chống oxy hoá. Vì vậy tinh trùng trâu dễ tổn thương trong đông lạnh hơn tinh trùng bò (Tatham, 2000; Fabbrocini và cs., 2000; Sukhato và cs., 2001; Herold và cs., 2004).

Để hạn chế các hiện tượng nêu trên, có thể bổ sung chất chống oxy hoá vào tinh dịch nhằm làm tăng chức năng của tinh trùng trâu như enzym glutathione peroxidase (El-Sisy và cs., 2007), superoxide dismutase (SOD) (Stefanov và cs., 2011), catalase (Kumar và Atreja, 2012) .... Tuy nhiên việc sử dụng các chất chống oxy hoá là enzym sẽ khiến việc triển khai sản xuất đại trà tinh trâu đông lạnh gặp khó khăn do giá thành cao. Do vậy, việc bổ sung các chất chống oxy hóa với giá thành rẻ hơn như vitamin E, vitamin C … được nhiều tác giả nghiên cứu. Vitamin C (Ascorbic acid) có thể hoạt động như một chất oxy hóa ở nồng độ thấp và là một chất chống oxy hóa ở nồng độ cao (Affranchino và cs., 1991). Vitamin C ở nồng độ 5mM trong đóng băng hoạt động như một chất pha loãng chất chống oxy hóa trong quá trình đóng băng và tan băng của tinh trùng (Beconi và cs., 1993). Raina và cs. (2002) cho biết bổ sung Vitamin E trong môi trường pha loãng tinh dịch giúp cải thiện chất lượng tinh trùng trâu sau giải đông.

Một số tác giả nghiên cứu bổ sung các chất khác nhau vào môi trường pha loãng tinh dịch trâu nhằm tăng chất lượng tinh trùng trong quá trình đông lạnh như sữa bò (Kumar và cs., 1993b), huyết tương gia súc (Singh và Raina, 1999), pentoxifylline và heparin (Ramesha và cs., 2000), dịch nang trứng trâu (Kumar và cs., 2001), Insulin và huyết thanh thai bê (Shabd và cs., 2003), protein của ống dẫn trứng (Kumaresan và cs., 2006), Bradykinin (Shukla và Misra, 2007), nước dừa (Vale, 2010), sữa ong chúa và heparin (Abd-Allah, 2012), các axit amin glutamine, glycine, alanine và cysteine (El-Sheshtawy và cs., 2008), taurine, trehalose, 4-bromophenacyl bromide (Kumar và Atreja, 2012; Singh và cs., 2014).

Một số tác giả còn nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex nhằm tăng chất lượng tinh trâu. Sử dụng Sephadex lọc tinh dịch giúp tăng hoạt lực sau giải đông và giảm tỷ lệ acrosom biến dạng sau giải đông (Rana và cs., 2003). Maurya và cs. (2003) thấy rằng, sử dụng Sephadex có chiều cao 1cm lọc tinh trùng trâu tốt hơn và acrosom bị biến dạng ít hơn.