ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên khoa môi trưỜng trần Thị Thúy nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩM ĐƠn dòng nấM ĐỐi kháng trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thốI Đen quả ca cao luận văn thạc sỹ khoa
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
tải về 0.74 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
- 2.2. Phương pháp nghiên cứu
- 2.2.2. Phương pháp thực nghiệm trong phòng thí nghiệm
- 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
CHƯƠNG 2ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu2.1.1. Đối tượng nghiên cứuĐối tượng được nghiên cứu là nấm đối kháng Trichoderma được phân lập từ mẫu đất trồng ca cao được thu thập từ 3 tỉnh Đăk Lăk, Đăk Nông và Bình Phước, có khả năng phòng trừ bệnh thối đen quả cao cao. 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu- Nghiên cứu khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đã phân lập về hình thái, điều kiện phân lập và tuyển chọn đối với nấm Phytophthora gây bệnh thối đen ở quả ca cao - Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ nấm Phytophthora palmivora. 2.2. Phương pháp nghiên cứu2.2.1. Phương pháp lấy mẫu+ Thu thập mẫu đất ở các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông:
+ Thu thập mẫu bệnh thối đen ở các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông:
+ Ngày, địa điểm thu mẫu, tên của chủ ruộng lấy mẫu. + Cây trồng (giống, tuổi cây, lịch sử của cây, những cây trồng cùng) + Bộ phận cây bị hại + Đất đai (đất đỏ, đất đồi, đồng bằng, thung lũng…), quản lý (phân bón, thuốc trừ sâu bệnh, vệ sinh đồng ruộng…) 2.2.2. Phương pháp thực nghiệm trong phòng thí nghiệm2.2.2.1. Phương pháp phân lập nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao - Phương pháp phân lập Phytophthora: Sử dụng mồi bẫy Phytophthora (Sử dụng một số loại quả như: đu đủ, ca cao, táo, lê …thường phải xanh làm mồi bẫy) từ đất quanh vùng rễ cây bị bệnh hoặc từ mô cây bệnh (Erwin and Riberrio, 1996). - Bẫy Phytophthora từ đất quanh vùng rễ cây bị bệnh. + Chọn đất ẩm trên bề mặt 5 cm của lớp đất dưới lớp rác lá, trong đó có rễ cây. + Đục những lỗ nhỏ bán kính 2 cm trên vỏ trái ca cao xanh hoặc các trái cây khác. + Nhét đất ẩm vào các lỗ vừa đục trên quả dùng làm mỗi bẫy. + Bọc quả trong túi nilon và đặt trong điều kiện phòng. + Kiểm tra quả hàng ngày nếu là bệnh do nấm Phytophthora gây ra thì phần thương tổn màu nâu lan rộng nhưng không thối nhũn. + Cắt khúc nhỏ ở rìa thương tổn, cho vào đĩa agar đã chuẩn bị sẵn để phân lập - Bẫy Phytophthora từ mô cây bị bệnh thối đen quả ca cao. + Chọn mô nằm ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ. + Thanh trùng bề mặt bằng ethanol 70% hoặc HgCl2 (1%) khoảng 30 - 60 giây. Rửa sạch với nước cất và lau khô bằng giấy đã được khử trùng. + Cắt mô thành miếng nhỏ (< 5 mm). + Thanh trùng bề mặt quả trái cây, rạch quả và chèn mô bệnh đã thanh trùng vào. + Bọc trái mồi bẫy vào trong túi ni lon để trong nhiệt độ phòng. + Kiểm tra túi ủ hàng ngày, sau 2 - 3 ngày thấy vết thương tổn màu nâu lan rộng chứng tỏ có bị nhiễm Phytophthora. + Cắt khúc nhỏ ở rìa thương tổn, cho vào đĩa agar đã chuẩn bị sẵn để phân lập
- Phân lập nấm Trichoderma theo phương pháp của Samuels (2004). Các mẫu rễ và đất vùng rễ của ca cao thu thập trên đồng ruộng được rửa sạch qua vòi nước và khử trùng bề mặt bằng cồn 950 trong 30 giây sau đó rửa bằng cồn 750 trong 2 phút, cuối cùng rửa sạch lại 3 lần bằng nước cất khử trùng và cấy vào môi trường TME, CMA và PRBA. Mẫu đất được pha loãng và cấy trên môi trường TME và PRBA. Các mẫu cấy được ủ ở 250C sau đó được tách thuần trên môi trường PDA.
Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp. với nấm Phytophthora sp. được đánh giá theo phương pháp của Seiketov (1982), Bradshaw-Smith và cộng sự (1991). + Môi trường thí nghiệm: PDA + Phương pháp tiến hành: Cấy đối xứng hai bên + Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính ức chế của tản nấm Trichoderma sp. đối với Phytophthora sp. K Tìm hiểu khả năng ức chế của nấm Trichoderma sp. đối với nấm gây bệnh bằng chất kháng sinh bay hơi: dựng 2 đĩa có đường kính bằng nhau, trên môi trường PDA, một đĩa cấy nấm gây bệnh, một đĩa cấy nấm Trichoderma sp., úp 2 đĩa vào nhau và giữ kín hộp đĩa. Đối chứng là cặp Petri cấy nấm gây bệnh. Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của từng loại nấm và khả năng ức chế nấm gây bệnh bởi chất kháng sinh bay hơi do nấm Trichoderma sinh ra.
+ Thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, để nuôi cấy nấm Trichoderma có thể sử dụng các môi trường dinh dưỡng tổng hợp lỏng hoặc rắn (có agar) hoặc các nguồn tự nhiên khác từ thực vật (các hạt ngũ cốc phế thải, kho dầu củ cải đường). Có thể nuôi cấy nấm Trichoderma bằng phương pháp cấy chìm hoặc cấy trên bề mặt môi trường. Các nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành theo phương pháp cấy nấm trên bề mặt môi trường có agar. Nấm Trichoderma sp. được cấy trên một số môi trường nuôi cấy thích hợp với nấm đối kháng như PDA, CMA, Chapek. Sau đó được đặt ở điều kiện nhiệt độ: 250C. + Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng khác nhau đến sinh trưởng phát triển của nấm đối kháng: thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Seketov (1982). Thí nghiệm bao gồm các công thức: tối liên tục, sáng liên tục, 12 giờ sáng và 12 giờ tối. + Nghiên cứu ảnh hưởng của các độ pH môi trường nuôi cấy đến khả năng phát triển của nấm Trichoderma sp.: các giá trị pH của môi trường nuôi cấy được thí nghiệm là 4, 5, 6, 7, 8. + Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ: Nấm được cấy trên môi trường PDA có độ pH thích hợp (pH = 5 – 6) và đặt ở nhiệt độ: 20, 25, 30, 35, 400C. Chỉ tiêu theo dõi (cho cả 4 thí nghiệm trên): Đường kính khuẩn lạc sau 1, 2, 3 và 4 ngày (cm). + Phương pháp định tính hoạt độ enzym chitinase, β-glucanase và cellulase của nấm Trichoderma. Hoạt độ các enzym chitanase, ß-glucanase và cellulase của nấm Trichoderma được định tính bằng cách đo đường kính vòng phân giải trên môi trường cảm ứng tổng hợp của từng loại enzym (Vi sinh vật học, Nguyễn Đức Lượng, 2004). Môi trường cảm ứng tổng hợp enzym chitinase và β-glucanase : Urê 0,3g (NH4)2SO4 1,4g MgSO4.7H2O 0,3g CaCl2.6H2O 0,3g Glucose 0,5g β- Glucan 2g hoặc huyền phù chitin 10g Fe2+, Mn2+, Zn2+, Co2+ 0,1% (v/v) Nước cất 1000 ml Môi trường cảm ứng tổng hợp enzym cellulase: K2HPO4 2 g (NH4)2SO4 2 g NaCl 2 g MgSO4. 7H2O 2 g Agar 15g CMC (cacboxyl methyl cellulose) 10 g Nước cất 1000 ml pH = 7,0 - 7,2. - Phương pháp tiến hành: đổ môi trường vào đĩa Petri, cấy vi khuẩn mới hoạt hoá trên môi trường, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1- 4 tuần và quan sát vòng phân giải được tạo ra bằng dung dịch thuốc thử Lugol.
Phương pháp tiến hành: Áp dụng phương pháp nhân sinh khối nấm Trichoderma của Papavizas và cộng sự (1984) có cải tiến (mỗi công thức làm nhắc lại 3 lần). Nấm Trichoderma được nuôi cấy trên môi trường PDA 5 - 7 ngày. Môi trường nhân sinh khối được hấp khử trùng trong 45 phút ở 1210C. Cấy nấm Trichoderma vào môi trường nhân sinh khối đặt ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 15 ngày.
Công thức thí nghiệm CT1: 250g gạo CT2: 250g bột ngô CT3: 125g gạo + 125g bột ngô CT4: 250g thóc Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy) b) Nghiên cứu lượng nước trong môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp.
Công thức thí nghiệm CT5: 250g gạo + 50ml nước CT6: 250g gạo + 100ml nước CT7: 250g gạo + 150ml nước CT8: 250g gạo + 200ml nước Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)
Công thức thí nghiệm CT9: 250g ngô + 50ml nước CT10: 250g ngô + 100ml nước CT11: 250g ngô + 150ml nước CT12: 250g ngô + 200ml nước CT13: 250g ngô + 250ml nước Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)
Công thức thí nghiệm CT14: 200g thóc + 100ml nước CT15: 200g thóc + 150ml nước CT16: 200g thóc + 200ml nước CT17: 200g thóc + 250ml nước CT18: 200g thóc + 300ml nước Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)
Công thức thí nghiệm CT19: Đối chứng (Đậy nút kín không đảo) CT20: Đậy nút kín + đảo trộn 1 ngày/1 lần CT21: Đậy nút kín + đảo trộn 2 ngày/1 lần CT22: Đậy nút kín + đảo trộn 3 ngày/1 lần Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)
Công thức thí nghiệm
Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)
Công thức thí nghiệm. CT29: Sáng liên tục CT30: 12 giờ sáng + 12 giờ tối CT31: Tối liên tục Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)
Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 0.74 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|
ẻ một đường ở giữa đĩa petri (phần đáy). Cấy nấm Trichoderma và nấm