Chuyển gen gus qua phôi non ở giống ngô lvn99 nhờ agrobacterium tumefaciens

* Liên hệ: Tel.: 0913383289; Mail.: chuhoangmau@tnu.edu.vn

Trong nghiên cứu này, quy trình chuyển gen gus qua phôi non ở ngô nhờ A. tumefaciens đã được chúng tôi đề xuất và tối ưu. Mật độ vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp ở giá trị OD_660nm=0,8 và thời gian nhiễm khuẩn tối ưu là 30 phút, bổ sung acetosyringone150M, tuổi phôi từ 10-12 ngày tuổi (kích thước 0,9– 1,3 mm) tối ưu cho khả năng tiếp nhận gen và sự tái sinh. Ngưỡng chọn lọc kháng sinh kanamycin đối với phôi chuyển gen là 50mg/l. Kết quả tái sinh và chuyển thành công gen gus ở giống ngô LVN99 là cơ sở cho việc nghiên cứu chuyển gen defensin vào giống ngô Việt Nam phục vụ tạo dòng ngô chuyển gen có khả năng kháng mọt.

Cây ngô (Zea mays L.) là cây ngũ cốc chính có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, đáp ứng nhu cầu về lương thực, thực phẩm, làm thức ăn chăn nuôi và nhiên liệu trên thế giới ngày một tăng [3]. Ở Việt Nam, cây ngô đang là một trong các cây trồng xoá đói, giảm nghèo, đặc biệt là các tỉnh miền núi phía Bắc. Tuy nhiên, tổn thất sau thu hoạch ở ngô do côn trùng rất lớn, đặc biệt trong thời gian lưu trữ tại kho, sự tổn thất có thể hơn 30% sản lượng [2]. Hiện nay có nhiều cách bảo quản ngô sau thu hoạch như xử lý nhiệt, vần đảo, trộn bụi trơ, hóa chất…các biện pháp này tốn nhiều công sức và hiệu quả thấp, gây ô nhiễm môi trường, độc hại cho con người và vật nuôi khi có dư lượng. Việc ứng dụng công nghệ sinh học để tạo ra các giống ngô chuyển gen có khả năng sâu bệnh và chống chịu điều kiện bất lợi từ ngoại cảnh đã góp phần đưa sản lượng ngô thế giới vượt lên trên lúa mì và lúa nước [1].

Gen β-glucuronidase (gus) được phân lập từ chủng E.coli RA201. β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide tạo sản phẩm phân giải có màu xanh lam đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronidase thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus là X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-gluc không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh lam. Nhờ đặc điểm này, mà các nhà khoa học đã thiết kế gen gus vào các vector chuyển gen để làm chỉ thị dễ nhận biết ở mô, tế bào thực vật mang gen chuyển [1]. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu suất chuyển gen gus vào phôi non giống ngô LVN99 nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (A.tumefaciens) làm cơ sở cho việc chuyển thành công các gen đích vào giống ngô Việt Nam.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Sử dụng phôi non của giống ngô LVN99 do Trung tâm giống cây trồng Sơn La cung cấp làm vật liệu nhận gen. Chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58/pGV2260 mang vector pCB-gusplus chứa gen chỉ thị gus do Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp. Các môi trường nuôi cấy mô được sử dụng theo Frame và cs (2002) [4] bao gồm: Môi trường lây nhiễm và đồng nuôi cấy (A1), môi trường chọn lọc lần 1 (A2), môi trường chọn lọc lần 2 (A3), môi trường phục hồi (A4), môi trường tái sinh chồi (A5) và môi trường tạo rễ (A6).

Phương pháp chuyển gen vào cây ngô thông qua A. tumefaciens được tiến hành dựa trên phương pháp của Frame và cs (2002) [4].

Dung dịch vi khuẩn A. tumefaciens CV58 chứa gen gus nuôi lỏng lần 2, ly tâm loại bỏ dịch nổi, hòa tan cặn trong môi trường MS lỏng và pha loãng dịch rồi đo mật độ vi khuẩn OD_660nm ở các giá trị: 0,4; 0,6; 0,8 và 1,0. Sau đó tiến hành nhiễm khuẩn phôi ngô 12 ngày tuổi trong 30 phút, bổ sung 100 M acetosyringone ở các mật độ vi khuẩn khác nhau, kết quả biểu hiện gen gus thể hiện ở bảng 1.

Bổ sung acetosyringone với các nồng độ khác nhau vào dịch huyền phù vi khuẩn (OD_600nm= 0,8), nhiễm khuẩn vào phôi ngô 12 ngày tuổi trong 30 phút, kết quả cho thấy acetosyringone có ảnh hưởnh lớn đến hiệu quả chuyển gen vào cây ngô LVN99 (Bảng 2). Trong trường hợp không bổ sung acetosyringone thì không tìm thấy phôi nào biểu hiện gen gus. Trong môi trường bổ sung 150 M acetosyringone thì hiệu suất chuyển gen cao nhất đạt 40,83%. Ở nồng độ 100 và 200 M acetosyringone hiệu quả chuyển gen chênh lệch không lớn (35,83% và 32,50%). Như vậy, khi bổ sung 150 M acetosyringone cho hiệu quả chuyển gen vào giống ngô LVN99 là cao nhất. Acetosyringone (AS) là một loại phenol được tiết ra từ thực vật bị tổn thương, chúng có tác dụng dẫn dụ vi khuẩn A. tumefaciens xâm nhập vào thực vật tại nơi tổn thương. Vì vậy bổ sung acetosyringone vào môi trường gây nhiễm khuẩn nhằm mục đích nâng cao hiệu quả chuyển gen. Anami và cs (2010), khi nghiên cứu chuyển hai cấu trúc pXBb7-SI-UBIL và pBbm42GW7_GUS vào phôi non của 3 dòng ngô TL26, CML216 và CML244 đã khẳng định với môi trường đồng nuôi cấy bổ sung acetosyringone thì hiệu suất chuyển gen đạt cao hơn, và nồng độ acetosyringone100-200 µM là tốt nhất [1].

Phôi của giống ngô LVN99 12 ngày tuổi được ngâm các thời gian khác nhau trong dung dịch khuẩn (OD_600nm= 0,8), bổ sung 150 µM acetosyringone. Sau nuôi tối 3 ngày trên môi trường A1, tiến hành nhuộm để kiểm tra biểu hiện của gen gus, kết quả được trình bày ở bảng 3.

Phôi 10 - 12 ngày tuổi được nhiễm A. tumefaciens CV58 chứa gen gus với mật độ OD_600nm = 0,8, trong thời gian 30 phút, bổ sung 150 µM acetosyringone (phôi chuyển gen). Các phôi sau khi nuôi trên môi trường đồng nuôi cấy A1, các phôi (chuyển gen và không chuyển gen) được nuôi trên môi trường chọn lọc A2, bổ sung kanamycin với nồng độ khác nhau (0, 25, 50, 75, 100, 150 mg/l), để xác định nồng độ cho ngưỡng chọn lọc, kết quả được trình bày ở bảng 5. Bảng 5 cho thấy, trong môi trường không bổ sung kanamycin thì các phôi không được chuyển gen có khả năng tạo mô sẹo và sống sót cao hơn so với các phôi chuyển gen, sau 7 ngày nuôi cấy tỷ lệ tạo mô sẹo của phôi không chuyển gen đạt 59,78 %, còn phôi chuyển gen đạt 54,18 %; sau 15 ngày nuôi cấy tỷ lệ sống sót và tạo chồi của phôi không chuyển gen là 56,67 %, phôi chuyển gen chỉ đạt 50,69%. Có thể sự gây tổn thương phôi và thời gian ngâm khuẩn ảnh hưởng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh của phôi. Bảng 5 cũng cho thấy, kanamycin có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tạo mô sẹo của các phôi. Khi bổ sung 25 mg/l kanamycin sau 7 ngày nuôi cấy khả năng tạo mô sẹo của phôi chuyển gen là 50,12% còn phôi không chuyển gen còn 20,16%, sau 15 ngày nuôi cấy tỷ lệ sống sót và tạo chồi của phôi không chuyển gen còn 46.28% trong khi phôi không chuyển gen còn 17,20%. Khi bổ sung 50mg/l sau 7 ngày nuôi cấy tỷ lệ tạo mô sẹo của phôi chuyển gen là 38,36%, phôi không chuyển gen là 3,18%, sau 15 ngày nuôi cấy khả năng sống sót và tạo chồi của phôi chuyển gen đạt 25,68% trong khi đó phôi không chuyển gen đã bị chọn lọc rất cao chỉ còn 0,82%. Khi nồng độ tăng lên 75mg/l phôi không chuyển gen không có khả năng tạo mô sẹo, còn phôi chuyển gen thì khả năng tạo mô sẹo và tạo chồi bị ảnh hưởng rõ rệt cụ thể tỷ lệ tạo mô sẹo chỉ còn 10,32% và khả năng sống sót và tạo chôi còn 3,86%. Nồng độ kanamycin tăng lên 100mg/ l và 150mg/ l thì cả phôi chuyển gen và không chuyển gen đều không có khả năng tạo mô sẹo. Như vậy, nồng độ kanamycin cho ngưỡng chọn lọc phôi chuyển gen là 50mg/ l.

Quy trình chuyển gen gus qua phôi non ở ngô nhờ A. tumefaciens chủng C58/pGV2260 mang vector pCB-gusplus đã được xây dựng và tối ưu. Mật độ vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp ở giá trị OD_660nm=0,8 và thời gian nhiễm khuẩn tối ưu là 30 phút, bổ sung acetosyringone150M và tuổi phôi từ 10-12 ngày tuổi, kích thước 0,9– 1,3 mm tối ưu cho khả năng tiếp nhận gen và sự tái sinh. Ngưỡng chọn lọc kháng sinh kanamycin đối với phôi chuyển gen là 50mg/l. Kết quả tái sinh và chuyển thành công gen gus ở giống ngô LVN99 là cơ sở cho việc nghiên cứu chuyển gen defensin vào giống ngô Việt Nam phục vụ tạo dòng ngô chuyển gen có khả năng kháng mọt.

A