Chương nuôi cấy tế BÀo và chọn dòng tế BÀo nuôi cấy tế bào đơn


Đột biến hay thay đổi hoạt tính gen



tải về 351.07 Kb.
trang4/7
Chuyển đổi dữ liệu07.09.2016
Kích351.07 Kb.
#31828
1   2   3   4   5   6   7

7.3.3. Đột biến hay thay đổi hoạt tính gen


Đột biến phải là kết quả rõ ràng của sự thay đổi cấu trúc bậc một của DNA có di truyền dẫn đến những biến đổi về tính trạng, đột biến phải là thay đổi lâu dài và di truyền cấu trúc bậc một của DNA dẫn đến những biến đổi tính trạng.

Thông thường trong nuôi cấy tế bào thực vật đột biến được chọn lọc thông qua thay đổi tính trạng của tế bào. Những thay đổi về tính trạng tế bào có thể là kết quả của thay đổi hoạt tính gen. Ví dụ: Dòng tế bào thuốc lá kháng cycloheximide của Maliga (1976) nếu cấy chuyển 1-2 lần sang môi trường không chứa cycloheximide thì khả năng kháng cycloheximide mất đi. Điều đó chứng tỏ tính kháng cycloheximide do một gen bình thường không thể hiện.

- Tương tự như vậy người ta cũng gặp ở dòng tế bào cà rốt chống chịu 2,4-D của Widholm (1977).

- Dòng tế bào cà rốt kháng colchicine là kết quả thay đổi tính chất màng tế bào.

Các dạng biến đổi như vậy do một cơ chế không di truyền (epigenetic mechanism) điều khiển. Thay đổi tính trạng do đột biến phải là những tính trạng chuyển qua thế hệ sau bằng sinh sản hữu tính được. Đột biến của DNA nhân sẽ phân ly theo định luật Mendel sau khi lai, còn đột biến ở DNA cơ quan tử như lục lạp và ty thể thì có thể di truyền theo đường mẹ. Cho tới lúc lai xong, tốt nhất chỉ nên gọi các dòng vừa phân lập được là các dòng tế bào (hoặc các dạng thay đổi tính trạng). Khi tái sinh cây từ một dòng tế bào cũng có thể xuất hiện những cây không di truyền tính trạng đã chọn. Điều đó có thể giải thích như sau: lúc chọn một số tế bào mẫn cảm được bảo vệ bởi các tế bào chống chịu xung quanh bằng cách cung cấp các sản phẩm trao đổi chất hoặc enzyme qua các khe tế bào, những tế bào mẫn cảm cũng có thể xuất hiện thông qua hiện tượng tách tế bào vô tính, hiện tượng tạo khảm hoặc những biến đổi di truyền (back mutation-thoái biến) và không di truyền (epigenetic).

Các dạng biến đổi chọn được trong nuôi cấy in vitro thường xuất hiện với tần số 10-5-10-8 khi không xử lý đột biến. Nếu xử lý sẽ tăng được tần số đó lên 10 lần.

Các tác nhân gây đột biến thường được sử dụng là:

- Ethylmethane sulphonate (EMS).

- N-methyl-N-nitro-N-nitroso guanidine (MNNG).

- N-ethyl-nitrosourea (ENU).

- Tia X hoặc tia UV.

Chưa có số liệu cụ thể về nồng độ, phổ và tần số đối với từng loại tác nhân bởi vì độ lớn của khối tế bào được xử lý, mật độ tế bào gieo trên đĩa petri và số nhiễm sắc thể cũng như karyotype của tế bào bị xử lý. Sử dụng protoplast thực vật bậc cao có thể là phương pháp tốt nhất để tiếp cận vấn đề này.


7.4. Nguyên tắc chọn dòng tế bào

7.4.1. Chọn trực tiếp


Thông qua ưu thế về sinh trưởng hay sự khác biệt thấy được về màu sắc có thể chọn được dòng tế bào từ quần thể tế bào. Một số dòng có khả năng kháng kháng sinh, kháng các chất đồng đẳng của amino acid hoặc chống chịu muối cũng có thể chọn trực tiếp từ quần thể tế bào. Hệ thống tế bào hay được sử dụng là các tế bào dịch huyền phù hoặc khối callus. Điều kiện chọn lọc ở đây là các độc tố với nồng độ khác nhau gây tác động trực tiếp lên sinh trưởng của tế bào. Những tế bào có khả năng phân chia trong môi trường chứa độc tố với nồng độ tăng dần từ lần cấy chuyển này đến lần cấy chuyển khác được sàng lọc dần (chọn lọc kiểu bậc thang). Hoặc có thể đưa cả quần thể tế bào vào điều kiện môi trường ức chế sinh trưởng hoàn toàn để chọn ra những tế bào sống sót, tuy nhiên ngưỡng tối đa của mức độ hoặc nồng độ tác nhân chọn lọc cần phải được thăm dò trước nếu không có thể ức chế sự phát triển của các tế bào đột biến trong quần thể tế bào nuôi cấy. Thông thường, người ta trộn tế bào vào môi trường thạch chứa dược tố và chọn những tế bào sống sót phân chia thành khuẩn lạc mô sẹo, cũng có thể cấy trực tiếp lên môi trường chọn lọc chứa độc tố. Dòng chống chịu thường xuất hiện từ một phần của khối tế bào nuôi cấy.

7.4.2. Chọn gián tiếp


Trong trường hợp này đặc điểm của dòng được chọn là kết quả biểu hiện khuyết tật của tế bào. Thí dụ điển hình là chọn dòng thiếu enzyme nitrate reductase (NR). Trên môi trường chứa những tế bào có NR sử dụng như và khử thành , tác dụng như một độc tố cho nên chỉ có những tế bào không có NR mới sống sót trên môi trường chọn lọc.

7.4.3. Chọn tổng thể


Các tế bào dị dưỡng thực vật thường được chọn bằng phương thức xử lý đột biến và nuôi trên môi trường có chứa yếu tố dinh dưỡng cần thiết có khi lại chính là yếu tố gây đột biến, ví dụ: đột biến lặn chịu được S-2-aminoethyl cysteine xuất hiện sau khi xử lý đột biến phôi nuôi cấy.

7.5. Cách chọn dòng tế bào

7.5.1. Không có tác nhân chọn lọc


Các tế bào và callus không tổ chức (unorganised), sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro ở các thời kỳ khác nhau trên môi trường không chứa tác nhân chọn lọc (độc tố hoặc các chất ức chế), được cảm ứng để phân hóa các cây hoàn chỉnh. Các cây tái sinh sẽ được trồng trên đồng ruộng để chọn lọc các biến dị. Bằng phương thức này người ta đã thu được các biến dị dòng soma của các loài cây trồng khác nhau.

7.5.1.1. Cây mía đường (Saccharum officinarum)


Cây biến dị phân lập từ nuôi cấy mô và tế bào được xác nhận đầu tiên ở mía. Công việc bắt đầu ở đảo Fiji (Nhật), phân lập các dòng phụ (subclones) ở giống mía Pindar để kháng bệnh Fiji (do virus aphid-transmitted) và bệnh mốc sương (downey mildew) (do Scelerospora sacchari). Tính kháng được duy trì ở các dòng soma qua một vài thế hệ trồng trên đồng ruộng. Ở Australia, Larkin và Scowcroft (1981), đã khai thác khả năng tạo các biến dị của nuôi cấy mô để cải thiện một số giá trị nông học của giống mía Q101 kháng bệnh đốm mắt (do Helminthosporium sacchari). Tương tự, Liu (1981) đã xác định các dòng callus mía cho cây ưu thế hơn giống (thứ) địa phương tốt nhất (F-160, Taiwan) về năng suất, hàm lượng đường và khả năng kháng bệnh than (do Ustilago scitaminea).

7.5.1.2. Cây khoai tây (Solanum tuberosum)


Shepard và cs (1980) đã tái sinh một số lớn cây từ protoplast tế bào thịt lá của giống “Russet Burbank” và thông báo các biến dị thu được trong quần thể protoclones. Một số trong chúng kháng được bệnh thối sớm (early blight-do Alternaria solani) hoặc thối muộn (late blight-do Phytophtora infestans). Các protoclone kháng virus Y và xoắn lá (leaf-roll) cũng đã xuất hiện trên đồng ruộng (Thomson và cs 1986).

Biến dị di truyền ở khoai tây phát triển từ cây tái sinh trong nuôi cấy mô có thể di truyền sang thế hệ sau thông qua sinh sản sinh dưỡng (Sree Ramulu 1986). Các biến dị phân lập trong các cây tái sinh từ callus giống Bintje, cho các dòng-sản xuất bằng phương thức sinh dưỡng-mang các tính trạng về năng suất, kháng bệnh thối muộn và nấm vảy (scab) trên đồng ruộng tốt hơn.


7.5.1.3. Cây cà chua (Lycopersicum esculentum)


Evans và cs (1987), đã phân lập các dòng soma của cà chua bằng các biến dị hình thái, là các đột biến lặn của tính bất dục đực kháng nấm Fusarium oxysporium ở mắt của cuống lá, khả năng lục hóa của lá, màu sắc của quả và hoa. Một số biến dị về hình thái nói trên là do những thay đổi về số lượng nhiễm sắc thể. Các nhà khoa học ở DNA Plant Technology Co. (USA) đã phát triển các biến dị dòng soma của cà chua cho quả có vị ngọt tăng, cấu tạo (texture) quả tốt hơn, màu và hàm lượng chất khô cao (20%). Một trong những biến dị như thế đã được đăng ký bản quyền là giống (thứ) thương mại vào năm 1986 (Marty 1988).

7.5.1.4. Cây phong lữ (geranium)


Skirvin và Janick (1976) đã phát triển một loài geranium (Pelargonium) từ các biến dị soma có mùi hương được cải thiện và đặt tên là “Velvet Rose”. Điều này cho thấy giống cây trồng thương mại (commercial crop plants) đầu tiên bắt nguồn từ các biến dị dòng soma. Giống mới này có hoa đối xứng mang các nhị hữu thụ lớn, núm nhụy chẻ 5, trồng bằng hạt. Trong khi ở giống bố mẹ thì ngược lại, hoa bất đối xứng mang các bao phấn bé và bất thụ, núm nhụy chẻ 2, và không bao giờ trồng bằng hạt.

7.5.1.5. Các loài ngũ cốc và hòa thảo (cereals and grasses)


Các cây ngũ cốc và hòa thảo có nguồn gốc callus có thể là nguồn nguyên liệu cung cấp các biến dị dòng soma. Cây của các dòng này khác nhau về chiều cao, kích thước, dạng lá, chiều dài của râu (ở đầu hạt thóc), khả năng hữu thụ của cụm hoa, hoặc màu của hạt. Các biến dị chọn lọc có giá trị thương mại là dòng bất dục đực (male sterility), điều chỉnh protein gliadin, kháng bệnh sương giá ở lúa mì (Galiba và Sutka 1988), tăng năng suất ở lúa và chín sớm ở ngô (Evans 1989), kháng bệnh cháy rụi (fireblight) ở cây lê (Pyrus communis) (Viseur 1989). Trong số các loài hòa thảo, các loài thuộc chi Lolium, Panicum và Pennisetum cũng cho nhiều hứa hẹn về tiềm năng biến dị dòng soma.


7.5.2. Có nhân tố chọn lọc (with selection pressure)


Theo phương pháp này, các dòng tế bào biến dị được sàng lọc từ nuôi cấy nhờ vào khả năng sống sót của chúng khi có mặt các độc tố/chất ức chế trong môi trường dinh dưỡng, hoặc dưới các điều kiện stress của môi trường. Các biến dị có thể thu được bằng cách chọn lọc trực tiếp, gián tiếp. Sự phân lập được tiến hành trong nuôi cấy dịch huyền phù hoặc bằng cách dàn trải tế bào đơn/protoplast.

7.5.2.1. Kháng amino acid và các đồng đẳng của amino acid


Một số amino acid trong đó có valine và threonine ức chế sinh trưởng tế bào khi đưa chúng vào môi trường dùng đường nuôi cấy, vì chúng ức chế tế bào sử dụng hoặc ngăn cản amino acid cùng nguồn gốc. Ngoài ra, nếu bổ sung các chất đồng đẳng của amino acid vào môi trường nuôi cấy chúng có thể được sử dụng như amino acid vào việc tổng hợp ra các phần tử protein, kết quả các phân tử này bị mất hoạt tính. Hiện tượng ức chế này có thể khắc phục bằng cách cung cấp cho tế bào thêm các amino acid khác hoặc các hợp chất dẫn xuất bình thường khác của chúng.

Đối với tế bào, chúng có thể tự khắc phục bằng cách tăng cường tổng hợp các amino acid thích ứng. Và đây là nguyên nhân vì sao các dòng tế bào kháng được các chất đồng đẳng của amino acid lại sản xuất dư thừa amino acid. Cơ chế của hiện tượng sản xuất dư thừa là quá trình ức chế ngược (feed-back inhibition) kém mẫn cảm hơn. Trong dòng tế bào kháng 5-methyl-tryptophan cơ chế ức chế sản phẩm ngược này kém mẫn cảm vì vậy hoạt tính của anthranilat synthetase vẫn cao và lượng Tryp được tạo ra cao gấp năm lần so với bình thường. Ở các dòng kháng p-fluorophenyl alanine cơ chế ức chế sản phẩm ngược hoạt động của enzyme chorismat mutase kém mẫn cảm với phenylalanine và tyrosine. Vì vậy lượng phenyl được tạo ra rất cao.





Sơ đồ 7.1. Cơ chế ức chế ngược đối với tryptophan

Trong thực tế hiện tượng kiểm tra lỏng lẻo các quá trình sinh tổng hợp amino acid vẫn tồn tại không cần sự có mặt các chất đồng đẳng của amino acid. Các amino acid tự do này (Phe, Tyr, Met, Lys) sẽ được tích lũy lại hoặc chuyển hóa tiếp (ví dụ: thành các hợp chất phenol). Hiện tượng thải amino acid tự do ra môi trường chỉ gặp đối với proline (Pro).

Ngoài ra, khả năng kháng các chất đồng đẳng của amino acid còn có thể do những cơ chế khác gây ra, ví dụ như:

- Tế bào hạn chế thu nhận các chất đồng đẳng của amino acid. Hoạt động thu nhận các chất đó rất yếu.

- Tế bào có khả năng chọn các amino acid bình thường để tổng hợp protein trong khi các chất đồng đẳng của amino acid bị bỏ lại.

- Trường hợp kháng threonine thì tế bào có những thay đổi trong hệ thống enzyme sử dụng .

Nghiên cứu về tính kháng các đồng đẳng của amino acid có ý nghĩa thực tiễn rất lớn. Người ta hy vọng sẽ tạo được các giống cây có giá trị dinh dưỡng cao. Chẳng hạn: Widholm (1977) đã chọn được một dòng tế bào cà rốt có thể sản xuất 27 lần tryptophan tự do nhiều hơn bình thường và tổng 25% lượng Tryp tổng số (tự do + trong protein). Ở một dòng tế bào cà rốt khác cùng một lúc kháng được 4 chất đồng đẳng của amino acid, và hàm lượng các amino acid tương ứng là Lys, Phe, Met và Tryp tăng từ 6-34 lần. Tuy nhiên, biểu hiện sự sản xuất dư thừa này có còn giữ được sau khi tái sinh cây hay không đó là điều cho đến nay vẫn chưa được kết luận.

Vấn đề tái sinh cây từ dòng tế bào kháng 5-methyltryptophan là vấn đề sinh lý khá lý thú. Kháng 5-methytryptophan sẽ sản xuất dư thừa tryptophan mà tryptophan lại là tiền chất của IAA nên tế bào sẽ sản xuất dư thừa IAA và như vậy tế bào sẽ sinh trưởng tự dưỡng auxin nghĩa là không cần auxin ngoại sinh đưa vào môi trường. Lượng IAA tăng cũng làm cho tế bào mất khả năng tạo phôi và tạo chồi. Chỉ có 10-6 tế bào có thể tạo cây, và có thể do một đột biến thứ hai xãy ra trong trao đổi chất Tryp hay IAA. Cho tới nay đã có một số kết quả như sau:

- 2 trường hợp cây tái sinh từ mô sẹo-Nicotinana tabacum kháng methionine sulfoximine và valine.

- 1 trường hợp chọn từ nuôi phôi-Hordeum vulgare và Zea mays kháng lysine + threonine, Nicotiana tabacum kháng 5-methyl tryptophan.

- 1 trường hợp chọn cả cây-Triticum kháng 5-methyl tryptophan.

Những dòng này có khả năng di truyền tính trạng này cho thế hệ sau qua sinh sản hữu tính.

Bảng 7.1. Các dòng tế bào kháng các amino acid và các đồng đẳng của nó chọn lọc được trong nuôi cấy in vitro

Tác nhân chọn lọc

Loài

Tác nhân đột biến

Tái sinh cây

S-(aminoethyl)-L-cysteine

Arabidopsis thaliana

Daucus carota

Hordeum vulgare

Nicotiana tabacum

Nicotiana tabacum

Nicotiana sylvestris

EMS

Không


Azide

EMS


UV/EMS

Không


Không


Không


Không

Không


Aminopterin

Oryza sativa

Datura innoxia (1n)

EMS

Không


Không



Azaguanine

Acer pseudoplatanus

Glycine max

Haplopappus gracilis

Medicago sativa

NTG

EMS


EMS

EMS


Không

Không


Không

Không


Azauracil

Haplopappus gracilis

Zea mays

EMS

EMS


Không

Không


Azetidine-2-carboxylic acid

Daucus carota

Không

Không

Bromodeoxy-uridine

Glycine max

Medicago sativa

Nicotiana tabacum

NG

EMS


Không

Không

Không




Ethionine

Daucus carota

Daucus carota

Medicago sativa

EMS

Không


EMS

Không

Không


Không

p-Fluorophenyl alanine

Acer pseudoplatanus

Daucus carota

Datura innoxia

Nicotiana tabacum

Nicotiana tabacum

Nicotiana tabacum

Không

Không


Không

UV/EMS


Không

Không


Không

Không


Không


Không



6-Fluorotryptophan

Petunia hybrida

NG

Không

5-Fluorouracil

Daucus carota

Không



Glycine hydroxamate

Nicotiana tabacum

Không



-Hydroxyproline

Nicotiana tabacum

Nicotiana tabacum

EMS

UV/EMS


Không

Không


Hydroxyproline

Daucus carota

Hordeum vulgare

EMS

Azide


Không



Hydroxyurea

Nicotiana tabacum

Không



Lysine plus threonine

Zea mays

Zea mays

Azide

Không




Methionine sulfoximin

Nicotiana tabacum

Không



Methyltryptophan

Catharanthus roseus

Daucus carota

Nicotiana tabacum

Nicotiana tabacum

Nicotiana tabacum

Nicotiana sylvestris

Không

Không


UV/EMS

Không


Không

Không


Không

Không


Không

Không


Không


Seleno-amino acids

Nicotiana tabacum

Không

Không

Thienylalanine

Nicotiana sylvestris

Không

Không

Threonine

Nicotiana tabacum

Không



Valine

Nicotiana tabacum (1n)

Nicotiana tabacum (1n)

UV

NG hoặc chiếu xạ



Không



Каталог: Data -> News -> 388 -> files
News -> Nghị quyết của quốc hội số 23/2003/QH11 ngàY 26 tháng 11 NĂM 2003 VỀ nhà ĐẤT DO nhà NƯỚC ĐÃ quản lý, BỐ trí SỬ DỤng trong quá trình thực hiện các chính sáCH
News -> QuyếT ĐỊnh về việc ban hành Quy định về trang phục đối với Sinh viên Trường Đại học Lạc Hồng
News -> BỘ chính trị ĐẢng cộng sản việt nam
files -> Phần nuôi cấy tế BÀo chương giới thiệu chung và LỊch sử phát triểN
files -> Chương MỘt số phưƠng pháp canh tác hiệN ĐẠI 1 Thủy canh
files -> Phần chuyển gen ở thực vật bậc cao chương MỞ ĐẦU
files -> Chương những khái niệm cơ BẢn học thuyết tế bào
files -> Chương thu nhận và nuôi cấy phôi in vitro phôi soma

tải về 351.07 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
1   2   3   4   5   6   7




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương