Các tác giả Chương 1 Các đại phân tử sinh học I. Nucleic acid

Không phải tất cả các đoạn DNA trong genome đều tương ứng với các gen (mã hóa cho protein hoặc một sản phẩm cần thiết cho hoạt động sống của tế bào). Từ những năm 1970, bằng các thí nghiệm gây bão hòa đột biến người ta đã có thể xác định được số gen nằm trên một đoạn nhiễm sắc thể. Ngày nay, nhờ các kỹ thuật phân tích DNA và RNA hiện đại (Southern blot, Northern blot, microarray...) các nhà khoa học có thể xác định số gen hoạt động trong một tế bào. Ví dụ: ở tế bào nấm men S. cerevisiae (sinh vật eukaryote bậc thấp) có khoảng 4.000 gen hoạt động, còn tế bào động vật có vú khoảng 10.000-15.000 gen. Như vậy, nếu độ dài trung bình của một gen khoảng 10 kb thì tổng số chiều dài các gen hoạt động trong một tế bào cũng chỉ chiếm 1-2% genome. Hay nói cách khác, chỉ một phần rất nhỏ genome mang thông tin di truyền cần thiết cho hoạt động sống của tế bào. Vậy phần genome còn lại có vai trò gì, và tính phức tạp của loài có liên quan gì với kích thước genome hay không?

Để làm sáng tỏ vấn đề trên, chúng ta cần xem xét kích thước genome của một số loài gần nhau trong bậc thang tiến hóa (có độ phức tạp loài tương tự nhau) cũng như genome của những loài xa nhau (có tính phức tạp khác nhau). Chẳng hạn:

- Genome của người có kích thước khoảng 3,310⁹ bp, trong khi đó genome của những loài lưỡng cư dài khoảng 3,110⁹ bp hoặc thực vật có thể lên đến 10¹¹ bp. Như vậy, có phải là các loài lưỡng cư có tính phức tạp tương tự cơ thể chúng ta?

- Hay là ngay trong cùng một loại, chúng ta cũng nhận thấy có sự mâu thuẫn về kích thước genome? Ví dụ: ruồi nhà (Musca domestica) có genome khoảng 8,610⁸ bp, lớn gấp sáu lần kích thước genome của ruồi giấm khoảng 1,410⁸bp. Ngoài ra, trong các loài lưỡng cư kích thước genome của chúng cũng thay đổi khá lớn từ 10⁹-10¹¹ bp. Vì sao ngay trong cùng một loại mà kích thước genome lại biến thiên nhiều như vậy, có phải ruồi nhà có cấu tạo phức tạp hơn nhiều so với ruồi giấm?

Từ những dữ liệu trên, chúng ta có thể nhận định rằng tính phức tạp của loài không liên quan đến kích thước của genome. Tuy nhiên, vai trò của phần genome còn lại (phần không mã hóa) đến nay vẫn chưa được biết nhiều.

Có 6.000 gen ở nấm men S. cerevisiae, 18.500 gen ở giun tròn, 13.600 gen ở ruồi giấm, 25.000 gen ở Arabidopsis, và có khả năng 30.000 gen ở chuột và < 30.000 gen ở người.

Như chúng ta đã biết, mối quan hệ giữa kích thước genome và số lượng gen đã không còn nữa. Genome của các sinh vật eukaryote đơn bào có cùng phạm vi kích thước với genome của vi khuẩn lớn nhất. Các eukaryote bậc cao có nhiều gen hơn, nhưng số lượng không tương quan với kích thước genome.

Hình 2.4 cho thấy genome của loài nấm men S. cerevisiae dài 13.500 kb và loài nấm men S. pombe là 12.500 kb, có khoảng 6.000 gen và 5.000 gen tương ứng. Khung đọc mở trung bình khoảng 1,4 kb, vì thế khoảng 70% genome được chiếm giữ bởi các vùng mã hóa. Sự khác nhau chủ yếu giữa chúng là chỉ 5% gen của S. cerevisiae có intron, so với 43% của S. pombe.

Genome của giun tròn có khoảng 18.500 gen. Mặc dù genome của ruồi giấm lớn hơn genome của giun tròn, nhưng chúng lại có số gen ít hơn. Đến nay, chúng ta chưa hiểu tại sao ruồi giấm-một cơ thể phức tạp hơn nhiều-chỉ có 70% số gen so với giun tròn. Điều này đã cho thấy không có một mối quan hệ chính xác giữa số gen và tính phức tạp của cơ quan.


Hình 2.4. Số lượng gen của sinh vật eukaryote rất khác nhau. Thay đổi từ 6.000-40.000 nhưng không tương quan với kích thước genome hoặc độ phức tạp của cơ thể.

Cây Arabidopsis có kích thước genome trung gian giữa giun tròn và ruồi giấm, nhưng lại có số gen lớn hơn cả hai (25.000). Điều này một lần nữa cho thấy không có một quan hệ rõ ràng, và cũng nhấn mạnh nét đặc biệt của thực vật, là có thể có nhiều gen hơn (do sự nhân đôi của ông bà tổ tiên truyền lại) các tế bào động vật. Đa số genome Arabidopsis được tìm thấy trong các đoạn được nhân đôi, gợi ý rằng có một sự nhân đôi xa xưa trong genome (tạo ra một dạng tứ bội). Chỉ 35% các gen của Arabidopsis hiện diện như các bản sao đơn.

Genome của lúa lớn hơn Arabidopsis khoảng 4 lần, nhưng số gen chỉ lớn hơn khoảng 50%, có khả năng khoảng 40.000 gen. DNA lặp lại chiếm khoảng 42-45% genome. Hơn 80% gen tìm thấy trong Arabidopsis được hiện diện trong lúa. Trong số những gen chung này, khoảng 8.000 có trong Arabidopsis và lúa nhưng không thấy ở bất kỳ genome động vật hoặc vi khuẩn nào (những gen đã được phân tích trình tự). Có khả năng đây là tập hợp các gen mã hóa cho các chức năng đặc trưng của thực vật, chẳng hạn như quang hợp.


II. Tính phức tạp của genome

Kết quả nghiên cứu động học của các phản ứng lai được tiến hành giữa genomic DNA với cDNA (complementary DNA-DNA bổ sung), giữa DNA với mRNA… cho thấy hầu hết các gen hoạt động đều nằm trong thành phần DNA không lặp lại. Như vậy, thành phần này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc đánh giá tính phức tạp của genome. Hay nói cách khác, dựa vào thành phần DNA không lặp lại có thể biết được kích thước genome cũng như mức độ tiến hóa của loài. Nếu như kích thước genome (ở trạng thái đơn bội) được coi là một thông số động học (ký hiệu C), thì giá trị này đặc trưng cho từng loài và không phải luôn luôn tỷ lệ thuận với tính phức tạp của loài. Ngược lại, giá trị C phản ánh các đặc điểm sau:

- Số lượng DNA mã hóa cho các sản phẩm cần thiết đối với hoạt động sống của cơ thể rất nhỏ so với số lượng DNA có trong genome.

- Có sự biến đổi rất lớn của giá trị C giữa một số loài mà tính phức tạp của chúng không khác nhau nhiều.

Genome vi khuẩn được xem là chỉ chứa các đoạn DNA không lặp lại và các gen thường tồn tại bản sao đơn. Ngược lại, genome của eukaryote thường chứa các gen có hai hoặc nhiều bản sao. Hơn nữa, trình tự nucleotide của các bản sao này có thể không giống nhau hoàn toàn mặc dù sản phẩm protein mà chúng mã hóa có cùng một chức năng. Các bản sao tương đồng của một gen được xếp chung vào một nhóm gọi là một họ gen (gene family). Như vậy, ngoài các gen có một bản sao giống như ở vi khuẩn, genome của eukaryote còn chứa các họ gen. Hầu hết các gen mã hóa cho protein đã được phân lập đều nằm trong các họ gen khác nhau. Các gen trong một họ thường hoạt động theo thời gian và không gian. Điều đó có nghĩa, mỗi thành viên trong họ thường hoạt động ở một thời điểm nhất định trong quá trình hình thành và phát triển cá thể hoặc hoạt động trong các mô chuyên biệt. Khi một thành viên trong họ bị đột biến (bất hoạt) thì thành viên khác có thể hoạt động thay thế.

Khái niệm về gen được hình thành khi các nhà di truyền học cổ điển nghiên cứu biểu hiện các tính trạng mới do gây đột biến DNA của genome vi khuẩn hay thực khuẩn thể (bacteriophage). Một gen được xem là một đoạn DNA mà bất cứ đột biến nào xảy ra trên đó đều dẫn đến xuất hiện tính trạng mới. Điều này dễ hiểu đối với những genome chỉ chứa các gen có một bản sao (như genome của prokaryote). Tuy nhiên, ở genome của eukaryote, khi có nhiều gen cùng qui định một tính trạng hoặc các gen tương đồng trong một họ có thể hoạt động hỗ trợ thay thế nhau thì đột biến trên một gen không phải lúc nào cũng quan sát được ở mức độ phenotype. Mặt khác, các đoạn DNA tương ứng với trình tự mã hóa (coding sequence, exon) cho một protein thường bị ngắt quãng bởi các đoạn DNA không chứa thông tin di truyền (non-coding sequence, intervening sequence, intron). Các intron được phiên mã cùng với các exon sang phân tử RNA gọi là phân tử tiền thân mRNA (pre-mature mRNA hay pre-mRNA) nhưng sau đó chúng bị loại bỏ và các exon được nối lại với nhau tạo thành phân tử mRNA hoàn chỉnh (mature mRNA hay mRNA) được dùng cho quá trình sinh tổng hợp protein. Quá trình cắt các intron, nối exon không tuân theo một trật tự bắt buộc mà biến hóa đa dạng tạo ra các phân tử mRNA khác nhau từ một phân tử pre-mRNA (Hình 2.5). Bên cạnh mRNA, các phân tử rRNA và tRNA cũng được hình thành từ các phân tử tiền thân chứa intron. Ngoài ra, còn có hiện tượng mã di truyền của gen này nằm xen kẽ với các mã di truyền của gen khác (các gen nằm gối lên nhau-overlapping) hoặc trường hợp dịch chuyển khung đọc ngay trên một đoạn DNA.

Chúng ta đã biết đến chức năng của các phân tử RNA trong hoạt động sống của tế bào. Bên cạnh ba loại RNA đã được nghiên cứu khá kỹ (mRNA, rRNA và tRNA), vai trò của một số loại RNA khác mới được phát hiện vào những năm cuối thế kỷ 20. Chúng kiểm soát sự hoạt động của gen (hiện tượng bất hoạt gen-gene silencing), tham gia phản ứng đọc sửa thông tin di truyền trên phân tử mRNA (hiện tượng RNA editing) hay quyết định tính bền vững của mRNA (các ribonuclease)… Thậm chí có những phân tử pre-mRNA được tổng hợp không phải mã hóa cho protein mà với mục đích phân cắt tạo ra những phân tử RNA có kích thước nhỏ hơn tham gia quá trình kiểm soát hoạt động của các gen khác. Đột biến ở những đoạn DNA mã hóa cho tất cả các loại RNA này thường gắn liền với việc xuất hiện tính trạng mới. Do đó, cần xem xét các đoạn nucleotide đó như các gen mặc dù chúng không mã hóa cho protein.



Hình 2.5. Các gen bị gián đoạn được biểu hiện thông qua RNA tiền thân. Các intron được loại bỏ, trong khi đó các exon được nối lại với nhau. mRNA chỉ có các trình tự của exon được dịch mã thành chuỗi polypeptide.

Ngày nay, theo quan điểm của sinh học phân tử, một gen được xem là một đoạn DNA mã hóa cho một sản phẩm cần thiết đối với hoạt động sống của tế bào. Rõ ràng rằng không phải chỉ có DNA mã hóa cho protein mà cả các DNA mã hóa cho rRNA, tRNA và các loại RNA khác tham gia vào những phương thức kiểm soát hoạt động của genome cũng được xác định là gen.

1. Sự thay đổi trật tự của các đoạn DNA trong genome

Như đã biết kích thước và cấu trúc genome của các loài rất khác nhau. Nguyên nhân của sự đa dạng này là do: 1) trao đổi chéo giữa các cặp nhiễm sắc thể tương đồng xảy ra trong phân bào giảm nhiễm đã dẫn đến sự đa dạng trong loài; 2) trong genome trật tự các đoạn DNA cũng như cấu trúc các gen được sắp xếp lại, đặc trưng cho từng cá thể. Chính các yếu tố di truyền có khả năng di chuyển giữa các vị trí trong một genome hoặc giữa các genome khác nhau đã góp phần làm đa dạng di truyền giữa các cá thể trong loài.

Các yếu tố di truyền có khả năng di chuyển được xếp vào ba nhóm chính tùy thuộc vào tính độc lập của chúng:

- Nhóm thứ nhất gồm các yếu tố có khả năng di chuyển giữa các vị trí khác nhau trong genome.

- Nhóm thứ hai gồm các yếu tố có khả năng ghép vào và tách ra khỏi genome để tồn tại độc lập trong tế bào (các episome như plasmid F, bacteriophage).

- Nhóm thứ ba chỉ di chuyển dưới sự kiểm soát của tế bào ở những giai đoạn sinh trưởng phát triển nhất định để sắp xếp khởi động một số gen đặc biệt (hình thành cassette hoạt động ở nấm men S. cerevisiae, ký sinh trùng đơn bào Trypanosome).

Sự di chuyển của các yếu tố ở nhóm thứ hai và thứ ba liên quan tới tái tổ hợp tương đồng hoặc tái tổ hợp ở các vị trí đặc hiệu. Mặc dù không có khả năng tồn tại độc lập bên ngoài genome, nhóm thứ nhất tự kiểm soát sự di chuyển của chúng trong genome và không đòi hỏi sự tương đồng giữa chúng với vị trí ghép vào. Do đó, có thể nói chúng di chuyển một cách tự do trong genome và được gọi tên chung là các yếu tố di chuyển (transposable elements, transposons). Trong khi thực khuẩn thể  được xem là episome, thì thực khuẩn thể Mu và một số retrovirus ở eukaryote được xem là transposable elements.

2. Các transposon

Các yếu tố di chuyển có thể được chia làm hai loại dựa vào cách thức di chuyển của chúng:

- Loại thứ nhất được gọi là retroelement, chúng phải trải qua hình thức trung gian RNA trong quá trình di chuyển (RNA genome được sao chép nhờ reverse transcriptase tạo ra cDNA để ghép vào vị trí mới) (Hình 2.6).

- Loại thứ hai là các đoạn DNA hoặc bị tách ra hoặc được tái bản tạo thêm bản sao để ghép vào vị trí mới. Thông thường, loại thứ hai này được gọi là transposon.



Hình 2.6. Retroelement

Sự tồn tại của các transposon (còn gọi là gen nhảy) là nét đặc trưng của tế bào thực vật. Ở sinh vật eukaryote, các transposon còn được gọi là yếu tố kiểm soát (controlling elements). Transposon có thể di chuyển từ nhiễm sắc thể này sang nhiễm sắc thể khác hoặc ở các vị trí khác nhau trên cùng một nhiễm sắc thể. Chúng có thể “nhảy” vào giữa dãy mã của một gen đang hoạt động làm cho gen này bất hoạt hoặc ngược lại. Ở cây ngô, người ta đã phát hiện 10 nhóm transposon và một số trong chúng đã được giải mã. Tất cả chúng đều có kích thước khoảng 4.200 nucleotide và khác nhau chủ yếu ở đoạn mã tận cùng của gen.

Khi di chuyển, các transposon gây ra việc sắp xếp và tổ chức lại genome của từng cá thể như tạo các đoạn DNA mới ở vị trí chúng ghép vào và tách ra. Chúng có thể di chuyển tới vị trí bất kỳ và hoàn toàn không cần một mối quan hệ nào giữa hai vị trí mới và cũ. Khi tách ra transposon có thể mang theo các đoạn DNA bên cạnh, gây ra sự mất đoạn tại vị trí cũ. Ngược lại, khi ghép vào vị trí mới, chúng gây ra hiện tượng thêm đoạn hoặc chuyển đoạn ở vị trí mới. Do đó, transposon giống như các vector chuyên chở DNA từ nơi này sang nơi khác trong một genome hoặc từ genome này sang genome khác.

Ngoài ra, trao đổi chéo giữa các transposon tương đồng ở hai vị trí khác nhau trên một hoặc trên hai nhiễm sắc thể cũng tạo ra những biến đổi tương tự. Những biến đổi đó dẫn đến việc sắp xếp lại genome, tạo ra tính đa dạng giữa chúng và tính đặc thù riêng của từng cá thể. Đặc biệt, sự thay đổi vị trí của các transposon còn có thể ảnh hưởng đến hoạt động của các gen phân bố xung quanh ngay khi chúng không làm thay đổi trật tự nucleotide ở những gen này. Tần số ghép của các transposon vào genome khoảng 10^-5-10^-7 sau mỗi thế hệ. Ngược lại, tần số tách ra khoảng 10^-6 đến 10^-10.

Các transposon có thể chia làm hai nhóm dựa vào khả năng di chuyển độc lập hay phải phụ thuộc vào sự có mặt của transposon khác:

- Nhóm thứ nhất gồm các đoạn DNA có khả năng di chuyển độc lập. Chúng chứa gen mã hóa cho các protein điều khiển quá trình đó, ví dụ như enzyme nhận biết hai đầu transposon để tách chúng ra khỏi vị trí cũ và ghép vào vị trí mới. Do đó, quá trình này được thực hiện hoàn toàn độc lập. Nhờ khả năng này, chúng tạo ra các đột biến không bền vững.

- Nhóm thứ hai gồm các transposon không có khả năng tự hoạt động, tức là chúng không có khả năng di chuyển do không mang đủ thông tin di truyền mã hóa cho các enzyme cần thiết. Vì vậy, các transposon loại này tạo ra những đột biến gen một cách tự phát nhưng là đột biến bền vững. Việc di chuyển của transposon ở nhóm này phụ thuộc vào sự có mặt của transposon có khả năng hoạt động độc lập cùng nhóm. Hai transposon có thể xếp vào cùng nhóm khi chúng có cấu trúc tương đồng nhau, đặc biệt là các đoạn oligonucleotide phân bố ở hai đầu transposon. Đây là vị trí để enzyme nhận biết và cắt nối transposon ở vị trí đi và đến.

Các transposon đơn giản nhất ở vi khuẩn được gọi là IS (insertion sequences). Chúng có thể nằm trên chromosome hoặc trên các plasmid. Transposon vi khuẩn không giữ một chức năng nào trong tế bào. Trình tự nucleotide ở một đầu IS thường lặp lại nhưng ngược chiều so với đầu kia (inverted repeat). Ví dụ như GGTAT-X­_n-ATACC. Do đó, khi sợi đôi IS tách thành hai sợi đơn thì mỗi sợi này có khả năng hình thành liên kết bổ sung tại hai đầu của IS tạo cấu trúc thân-quai/cán-thòng lọng (stem-loop).

Transposon thường mã hóa cho các enzyme transposase làm nhiệm vụ nhận biết chuỗi nucleotide lặp lại ngược chiều (inverted repeat) để cắt transposon và di chuyển. Khi một IS được ghép vào vị trí bất kỳ của genome thì một đoạn ngắn DNA tại vị trí này được nhân đôi, tức là hai đầu của IS được chặn bởi các nucleotide giống nhau, sắp xếp theo cùng một chiều. Vì vậy, đoạn ngắn DNA này được gọi là “lặp lại xuôi chiều” (direct repeat). Chiều dài của chúng thường khoảng 9 bp (Hình 2.7). Dựa vào sự có mặt của các đoạn cùng chiều và ngược chiều có thể xác định được vị trí transposon ghép vào hoặc chuyển đi.

Ngoài các IS, ở vi khuẩn còn có các đoạn DNA có khả năng di chuyển với kích thước dài hơn, gọi là T_n. Các T_n thường phân bố trên plasmid (phân tử DNA dạng vòng, kích thước thường không lớn) và có khả năng chèn vào bất kỳ vị trí nào trong genome. Chúng thường mang thông tin di truyền mã hóa cho các protein kháng kháng sinh. Giữa IS và T_n có mối quan hệ về trình tự các nucleotide. Các T_n thường được giới hạn ở hai đầu bởi một loại IS nào đó.

Quá trình di chuyển của một transposon từ vị trí cũ (vị trí cho, donor) sang vị trí mới (vị trí nhận, recipient) xảy ra theo hai cơ chế khác nhau:

- Cơ chế sao y bản chính (transposon có mặt ở cả hai vị trí). Theo cơ chế này, phiên bản sau khi được sao chép từ vị trí cho sẽ được ghép vào vị trí nhận. Như vậy, mỗi lần di chuyển thì số lượng bản sao được tăng lên. Quá trình này liên quan đến hai loại enzyme: transposase (tác động vào hai đầu bản gốc transposon) và resolvase (tác động lên bản sao).

- Cơ chế tách ra khỏi vị trí cũ di chuyển đến vị trí mới. Theo cơ chế này, một transposon có thể tách ra khỏi vị trí cũ và ghép vào vị trí mới. Như vậy, số lượng transposon không thay đổi. Kiểu di chuyển này chỉ cần enzyme transposase. Khi transposon chuyển đi, vị trí cũ bị gãy và nó được nối lại nhờ cơ chế sửa chữa DNA trong tế bào.



Hình 2.7. Một transposon có đoạn lặp lại ngược chiều gồm 9 nucleotide (123456789) gắn vào vị trí có 5 nucleotide (ATGCA). Đoạn ngắn ATGCA có mặt ở cả hai đầu của IS và có trình tự nucleotide sắp xếp theo cùng một chiều.

Khi transposon ghép vào vị trí mới, một đoạn nucleotide ngắn ở đó được sao thành hai bản, mỗi bản nằm ở một đầu của transposon (direct repeat). Tại vị trí nhận, mỗi sợi đơn DNA bị cắt lệch nhau vài nucleotide. Transposon nối vào các đầu cắt, tạo ra hai khoảng trống (gaps). Chúng được sửa chữa theo nguyên tắc tạo cặp bổ sung. Do đó, đoạn nucleotide nằm giữa hai vết cắt được sao chép thành hai bản, mỗi bản ở một đầu và trình tự sắp xếp các nucleotide giống nhau. Vì vậy, chúng được gọi là lặp lại xuôi chiều.

Sự di chuyển DNA từ genome vi khuẩn sang genome thực vật được nghiên cứu khá kỹ đối với tương tác giữa Argobacterium tumefaciens hoặc A. rhizogenes với hầu hết các cây hai lá mầm. Hiện tượng di chuyển DNA này gây những biến đổi về mặt di truyền, biểu hiện ở việc xuất hiện các khối u trên thân cây (A. tumefaciens) hoặc mọc rất nhiều rễ tơ (A. rhizogenes) tại nơi bị nhiễm vi khuẩn.

Các gen vi khuẩn có khả năng di chuyển và hoạt động trong tế bào thực vật nằm trên Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) của A. tumefaciens hoặc trên Ri-plasmid (hairy-root inducing plasmid) của A. rhizogenes. Cũng như các khối u động vật, các tế bào thực vật có DNA vi khuẩn ghép vào genome bị chuyển sang trạng thái mới, ở đó sự phát triển và biệt hóa của chúng hoàn toàn khác với các tế bào bình thường. Đó là do hoạt động của các gen vi khuẩn trong genome của thực vật. Bình thường, những gen này có mặt trong genome vi khuẩn nhưng chúng chỉ được hoạt động (mở) sau khi hợp nhất vào genome thực vật và chịu sự kiểm soát của tế bào cây chủ. Quá trình này có tính chất đặc hiệu vật chủ, tức là một loại vi khuẩn chỉ có khả năng gây khối u trên một số loại cây chủ này mà không tương tác được với các loại cây khác.

Việc tạo khối u hay thực hiện quá trình chuyển gen từ vi khuẩn sang genome thực vật dẫn đến biến đổi trạng thái sinh lý của tế bào thực vật đòi hỏi các điều kiện sau:

- Phải có hoạt động của các gen trên ba vùng chvA, chvB, pscA nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn để khởi động việc bám dính vi khuẩn vào thân cây.

- Ti-plasmid hoặc Ri-plasmid phải mang vùng vir (nằm ngoài vùng T-DNA). Vùng này mang các gen cần thiết cho việc tách và vận chuyển T-DNA sang tế bào thực vật.

- Các gen trên vùng T-DNA của Ti-plasmid hoặc Ri-plasmid được ghép vào genome thực vật gây biến đổi trạng thái các tế bào này.

Plasmid là các vòng DNA tự sinh sản độc lập ở bên ngoài nhân. Ở vi khuẩn và động-thực vật, plasmid liên quan tới yếu tố giới tính của tế bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng sinh... Đặc điểm quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập.

Các plasmid của Agrobacterium mang các vùng T-DNA, vir (virulence region), gen chuyển hóa opine, và vùng ori khởi đầu sao chép trong tế bào vật chủ.

Sự khác nhau giữa Ti-plasmid và Ri-plasmid ở chỗ, vùng T-DNA của Ti-plasmid chứa các gen tổng hợp auxin, cytokinin và opine. Trong khi đó, vùng T-DNA của Ri-plasmid chỉ mang gen tổng hợp auxin và opine. Đây là điểm khác nhau gây ra hiệu quả tác động khác nhau lên thực vật. Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, làm rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u (trường hợp A. tumefaciens) hoặc rễ tơ (trường hợp A. rhizogenes). Khả năng chuyển các gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn.

Vùng T-DNA được nghiên cứu rất kỹ. Đó là một đoạn DNA có kích thước 25 kb trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin và opine (trường hợp Ti-plasmid) hoặc auxin và opine (trường hợp Ri-plasmid). Trong plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng biên phải (right border-RB) và biên trái (left border-LB), mỗi biên có chiều dài 25 bp.

Trong các vùng DNA của Ti-plasmid và Ri-plasmid, ngoài T-DNA, được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir (virulence). Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virA, virE2, virB, virD, virD2, virC1... Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với genome của cây chủ một cách an toàn.

Quá trình cắt đoạn T-DNA ra khỏi plasmid và vận chuyển nó vào tế bào thực vật trước hết phụ thuộc vào sản phẩm của các gen vir. Vi khuẩn xâm nhiễm tại bất kỳ vị trí tổn thương nào trên thân cây. Cây có vết thương do sự hỏng ngẫu nhiên của màng tế bào thực vật hoặc do vi khuẩn tiết ra hỗn hợp những chất được mã hóa bởi các gen vir. Hoạt động của các gen này được hoạt hóa bởi hợp chất phenolic của cây (ví dụ như acetosyringone, catechol, các dẫn xuất của chalcone...). Ngoài ra, các monosaccharide như glucose, arabinose có mặt trong môi trường cũng làm tăng khả năng gây cảm ứng nhóm gen vir.

Protein VirA đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định loại cây chủ bị nhiễm bởi Agrobacterium. Trong thực tế, Agrobacterium không có khả năng xâm nhập vào cây một lá mầm, có thể protein VirA không nhận biết các tín hiệu do cây một lá mầm tiết ra. Nói chung, Agrobacterium chỉ gây hại ở cây hai lá mầm, vì vậy người ta cho rằng chúng chỉ có thể đưa T-DNA vào hệ gen các cây hai lá mầm. Tuy nhiên, gần đây nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn, các cây một lá mầm cũng có thể sản xuất opine và vì thế có thể khai thác khả năng biến nạp gen của Agrobacterium vào cây một lá mầm. Hiện nay, người ta cũng đã thành công trong việc chuyển gen vào một số cây một lá mầm như lúa, mía... qua trung gian A. tumefaciens.

Khi cây nhiễm A. tumefaciens, do T-DNA hợp nhất vào trong genome của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản xuất ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại “thức ăn” nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmid. Cơ chế lây nhiễm của A. rhizogenes đối với cây hai lá mầm cũng tương tự, nhưng trong vùng T-DNA của A. rhizogenes chỉ có gen sản sinh ra auxin, vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tơ khi bị nhiễm bệnh.

Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. tumefaciens phải tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được thực hiện nhờ các gen chvA và chvB. Gen chvB mã hóa một protein liên quan đến hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β-1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA.

Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào genome của cây chủ.

Thực chất, chỉ riêng T-DNA của plasmid được chuyển vào genome tế bào thực vật, mà không còn phần nào khác. Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen vir và gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA. Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, đặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật. Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền. Trước hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir được phosphoryl hóa nhờ tác động của các hợp chất phenol như acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật tổn thương. Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE. Trước đó, khi gen virD được hoạt hóa, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB và LB của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của plasmid thành các sợi đơn. Đồng thời, quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi thẩm suất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng. Các sợi đơn T-DNA được gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn. Ngay sau đó, sợi T-DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính là sự tiếp hợp (conjugation) giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T-DNA đã được chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng hợp nhất vào genome tế bào thực vật được ổn định và di truyền như các gen bình thường khác.