Đặc biệt, nhu cầu về các giống lúa có chất lượng cao ngày càng gia tăng trong những thập kỷ gần đây, do yêu cầu của thị trường và nhu cầu của người tiêu dùng



tải về 456.13 Kb.
trang4/7
Chuyển đổi dữ liệu12.09.2016
Kích456.13 Kb.
#32068
1   2   3   4   5   6   7

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Tách chiết DNA tổng số


DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Cheng và cs (2003). Ưu điểm của phương pháp này là DNA tách chiết được khá nguyên vẹn do CTAB có khả năng tạo phức với DNA. Quy trình tách chiết được tiến hành với các bước như sau:

  1. Nghiền 1,5 - 2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng chày và cối sứ.

  2. Chuyển bột này sang ống falcon 15ml, sau đó bổ sung 6 ml đệm chiết CTAB (đã được làm nóng đến 650C).

  3. Đảo đều và ủ mẫu ở 650C trong thời gian 60 phút, 10 phút đảo đều một lần.

  4. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Bổ sung 4 ml Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều trong 10 phút.

  5. Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.

  6. Sau đó chuyển dịch trong phía trên ống falcon sang một ống mới (4ml). Bổ sung một thể tích tương đương (4ml) Isopropanol, đảo đều, giữ ở nhiệt độ - 200C trong 30 phút.

  7. Tủa DNA bằng máy ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút. Rửa tủa 2 - 3 lần (2 - 3h) mỗi lần với 1 ml Ethanol 70%.

  8. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 2 ml đệm TE và 15 µl RNase A (10 mg/ml). Ủ ở 37oC trong 3h.

  9. Chuyển dung dịch DNA vào một ống mới. Thêm 2 ml phenol - chloroform - isoamyl alcohol (25:24:1), đảo đều trong 5 - 10 phút và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút.

  10. Chuyển phần dịch phía trên vào ống mới. Thêm 750 µl NaCl 5M và 3ml Ete bão hòa hơi nước. Trộn đều và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút.

  11. Loại bỏ lớp Ete bên trên. Chuyển phần bên dưới vào ống mới

  12. Thêm 3 ml isopropanol, trộn đều và làm lạnh ở -20°C trong 30 phút. Lấy DNA ra bằng đầu pipet hoặc đũa thủy tinh.

  13. Rửa tủa 3 lần với 1.5 ml ethanol 70%.

  14. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 800 µl đệm TE để hòa tan tủa.

  15. Giữ dung dịch DNA ở - 20°C.

2.2.2. Đo độ tinh sạch của DNA


Sau khi tách chiết, độ tinh sạch và nồng độ của DNA được đánh giá bằng phương pháp điện di trên agarose 1% trong môi trường đệm TBE 0,5X và dùng DNA nồng độ (50 ng/µl) làm thang chuẩn, trong 30 phút, điện thế 100V. Sau khi chạy điện di, tiến hành nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm ethidium bromide. Việc chụp mẫu và đo nồng độ được thực hiện bằng máy Molecular imager FX.

2.2.3 Phương pháp PCR với mồi SSR


Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Mastercycler - personal. Tổng thể tích phản ứng là 10µl, bao gồm: 1,0µl DNA; 1,5µl mồi xuôi 5µM; 1,5µl mồi ngược 5µM; 1,0µl dNTPs 10mM; Đệm PCR 10X + MgCl2 25mM và 0.8µl Taq DNA polymerase 1U/µl.

Sau khi các ống eppendof đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành xếp ống vào máy và đặt chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR được đặt như sau:



Các bước

Nhiệt độ (oC)

Thời gian

Số chu kỳ

I

94

5 phút

1

II

94

1 phút

35

56

45 giây

72

1 phút

IV

72

7 phút

1

V

4

30 phút

1

Bảo quản mẫu 40C

2.2.4. Kiểm tra kết quả trên gel Polyacrylamide

Sản phẩm thu được từ phản ứng PCR được kiểm tra trên gel polyacrylamide 6%, trong môi trường đệm TAE 1X, các mẫu chạy với ladder 50 bp.


Việc kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR được tiến hành cụ thể như sau:

Chuẩn bị kính:

Kính ngắn được lau sạch bằng nước cất 3 lần, lau lại bằng ethanol 95% 3 lần, xử lý chống dính bằng dung dịch Sigma Cote sau đó loại bỏ Sigma Cote dư thừa bằng lau ethanol 95% hai lần.

Kính dài được lau sạch bằng nước cất 3 lần, lau lại bằng ethanol 95% 3 lần, rồi xử lý dính bằng Bind Silane, sau đó lau lại kính bằng ethanol 95% hai lần.

Gel polyacrylamide bao gồm các thành phần sau:

Dung dịch acrylamide 40% 14ml

10X TBE 4ml

Dung dịch APS 10%: 800µl

Dung dịch TEMED: 52µl

Nước đề ion 70ml

Trộn đều hỗn hợp các dung dịch trên và dùng xilanh bơm vào giữa hai tấm kính. Sau 30 phút gel được polyme hoá hoàn toàn.



Điện di sản phẩm:

Khi gel đông lại (sau khoảng 30 - 60 phút), rút lược ra, vệ sinh bản gel bằng TAE1X, cho khay chứa gel vào máy điện di có sẵn dung dịch đệm TAE 1X. Lấy 3µl mẫu (chứa sản phẩm của quá trình PCR), trộn đều với 3µl dung dịch loading 1,5X và tra vào các giếng. Để đo kích thước băng chúng tôi sử dụng ladder 50bp làm chuẩn. Sau đó, đặt máy điện di ở chế độ 200V trong thời gian 2h.



Nhuộm gel và ghi nhận kết quả:

Sau khi điện di, tiến hành nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromide (0,5 ng/ml) trong 2 phút. Soi và chụp ảnh băng sản phẩm điện di trên máy soi UV của hãng UVP, dựa vào đó xác định sản phẩm PCR thu được.



2.2.5. Phương pháp phân tích số liệu

Những số liệu thống kê bao gồm số allele trên locus, tần số allele phổ biến nhất, số allele độc nhất, chỉ số PIC (Polymorphism Information Content) được tính toán sử dụng phần mềm Excel, trong đó:

- Chỉ số Tần số allele phổ biến nhất được tính bằng tỷ lệ % của số cá thể xuất hiện allele phổ biến nhất trên tổng số allele xuất hiện ở từng locus nghiên cứu

- Allele độc nhất của từng chỉ thị SSR được xác định là allele xuất hiện duy nhất ở 1 giống trong toàn bộ các giống lúa nghiên cứu.

- Đa dạng di truyền allele của các chỉ thị SSR được đánh giá thông qua hệ số PIC (Botstein,1980) và được tính theo phương trình:

Trong đó: Pij:là tần số xuất hiện của allele thứ j tương ứng với mồi i.

Giá trị PIC càng lớn tức là mức độ đa hình của locus do mồi i khuếch đại càng lớn, càng nhiều allele được sinh ra.

Sự có mặt hay vắng mặt của các allele của từng chỉ thị SSR được ghi nhận cho tất cả các giống lúa nghiên cứu, trong đó 0 là không có băng DNA và 1 là có băng DNA ở cùng một vị trí. Số liệu được tổng hợp và xử lý thông qua chương trình NTSYS-pc v. 2.1 (Rohlf, 1997), xây dựng ma trận tương đồng di truyền sử dụng hệ số Dice (Dice, 1945; Nei and Li, 1979), tiếp theo là sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu được xây dựng bằng phương pháp phân nhóm UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages).

III. KẾT QUẢ


Каталог: phenotype -> upload -> article
article -> MỤc lục báo cáo kết quả thực hiện chuyêN ĐỀ nghiên cứu khoa họC (Chuyên đề 7)
article -> MỤc lụC ĐẶt vấN ĐỀ
article -> Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh LỜi cảM ƠN
article -> BÁo cáo kết quả thực hiện chuyêN ĐỀ nghiên cứu khoa họC (Chuyên đề 5)
article -> 1. 1 Vài nét sơ lược về cây lú
article -> ĐẶt vấN ĐỀ 2 I. TỔng quan nghiên cứU 3
article -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền tậP ĐOÀn giống lúa có khả NĂng chịu hạn bằng chỉ thị phân tử ssr
article -> MỤc lụC 1 Triệu chứng bệnh 4
article -> Xanthomonas oryzea pv oryze, đ
article -> ChuyêN ĐỀ 1 Tách chiết adn với số lượng cực lớn, chất lượng cao của 30 giống lúa

tải về 456.13 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
1   2   3   4   5   6   7




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương