Animal feeding stuffs Determination of content of tylosin by high performance liquid chromatographic method

Animal feeding stuffs - Determination of content of tylosin by high - performance liquid chromatographic method

Tiêu chuẩn này áp dụng để phân tích hàm lượng kháng sinh tylosin trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,12mg/kg.

Các tài liệu viện dẫn sau đây rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi:

TCVN 4851 (ISO 3696). Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

ISO 6497:2002 (E). Animal feeding stuffs - Sampling.

Tylosin trong mẫu thức ăn chăn nuôi được chiết bằng metanol. Dịch chiết được làm sạch bằng cột SPE cyano-propyl và cột nhôm oxit, sau đó tylosin được tách và định lượng trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV ở bước sóng 280nm.

4.1. Máy nghiền mẫu phòng thí nghiệm.

4.2. Sàng phòng thí nghiệm, có kích thước lỗ sàng 1,00 mm và 3,00 mm.

4.3. Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g.

4.4. Cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01 g.

4.5. Máy ly tâm lạnh có tốc độ 2000 - 4000 vòng/phút, sử dụng ống ly tâm dung tích 50 ml.

4.6. ống ly tâm, dung tích 50 ml bằng polypropylen hoặc bằng thuỷ tinh, có nắp đậy.

4.7. Máy nghiền đồng thể (Homogenizer).

4.8. Máy lắc tròn hoặc máy lắc ngang có thể đạt tốc độ 250 vòng/phút.

4.9. Máy đo pH có độ chính xác đến 0,05 đơn vị.

4.10. Bình định mức dung tích 10, 25, 100, 1000 ml.

4.11. Pipet tự động điều chỉnh được từ 1ml đến 10 ml.

4.12. Micropipet dung tích từ 10 l đến 100 l.

4.13. Hút dung môi tự động 2 ml, 10 ml, 20 ml.

4.14. Máy lắc ống nghiệm (Vortex mixer).

4.15. Syranh nhựa 1ml.

4.16. Cột chiết pha rắn cycano-propyl, 6ml, 500 mg.

4.17. Bình chiết pha rắn (SPE).

4.18. Bể siêu âm.

4.19. Bơm hút chân không.

4.20. Màng lọc syranh có kích thước 0,45 m.

4.21. Lọ nhỏ dựng dịch mẫu chuyên dụng cho HPLC, có nắp vặn PTFE .

4.22. Thiết bị trộn mẫu phòng thí nghiệm loại Hobart Model C 100 T hoặc tương đương.

4.23. Thiết bị chia mẫu:

Thiết bị chia đôi hoặc chia tư mẫu: ví dụ như thiết bị chia tư hình nón, thiết bị chia nhiều ngăn có hệ thống phân hạt hoặc các thiết bị chia khác đảm bảo phân chia mẫu thí nghiệm thành mẫu thử đồng nhất

4.24. Hộp đựng mẫu có nắp kín.

4.25. Hệ thống HPLC gồm có:

4.25.1. Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao, bình chứa dung môi, hệ thống bơm mẫu, detector UV đặt được ở bước sóng 350nm, máy ghi hoặc bộ tích phân.

4.25.2. Cột phân tích HPLC pha đảo có kèm cột bảo vệ

Chiều dài 250mm

Đường kính trong 4,6mm

Hạt nhồi C 18, 5m hoặc tương đương

CHÚ Ý: có thể sử dụng cột ngắn hơn, ví dụ có chiều dài 120mm-150mm

5. Hóa chất và thuốc thử

5.1. Hoá chất

Chỉ sử dụng hoá chất được công nhận đạt chất lượng tinh khiết phân tích và nước cất cấp hạng 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696). Các dung môi phải đạt chất lượng để dùng cho phân tích HPLC.

5.1.1. Nhôm oxit 90, hoạt hoá.

5.1.2. Acetonitrile.

5.1.3. Diethylamine

5.1.4. N-hexan.

5.1.5. Metanol.

5.1.6. Acid phosphoric (85%).

5.1.7. Acid clohydric.

5.1.8. Natri acetat.

5.1.9. Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄).

5.1.10. Kali hydrophosphat (K₂HPO₄).

5.1.11. Natri hydrophosphat ngậm 2 phân tử nước (Na₂HPO₄.2H₂O).

5.1.12. Chất chuẩn tylosin: loại tinh khiết, có kèm theo giấy chứng nhận hàm lượng.

5.2.1. Dung dịch đệm acetat 0,15M, pH 5,5

Cân 12,30 g natri acetate vào ống đong 1000ml. Thêm 900 ml nước cất đến khi hòa tan hết. Điều chỉnh pH đến 5,5 bằng dung dịch axit clohydric 1N. Thêm nước đến 1000 ml.

5.2.2. Dung dịch đệm phosphat 0,06M, pH 8,0

Hòa tan 9,08 g kali dihydrophosphat bằng nước cất vào bình định mức 1000ml và thêm nước cất đến vạch mức, trộn đều (dung dịch I).

Hòa tan 11,88 g natri hydrophosphat ngậm 2 phân tử nước bằng nước cất vào bình định mức 1000ml và thêm nước cất đến vạch mức, trộn đều (dung dịch II).

Trộn 5,5 ml dung dịch I và 94,5 ml dung dịch II để được 100 ml dung dịch đệm phosphat 0,06 M, pH 8,0.

5.2.3. Pha động A

Hòa tan 8,71 g kali dihydrophosphat bằng 900 ml nước cất. Điều chỉnh pH đến 2,5 bằng dung dịch acid phosphoric 85%. Thêm nước vừa đủ 1000 ml. Pha động A được chuẩn bị bằng cách trộn dung dịch này với acetonitrile theo tỷ lệ thể tích 80:20. Sau đó lọc hỗn hợp dung dịch thu được qua phễu hút chân không với màng lọc có kích thước lỗ 0,45 m, siêu âm đuổi khí ở nhiệt độ thường trong 30 phút.

5.2.4. Dung dịch chuẩn

5.2.4.1. Dung dịch chuẩn gốc 1000g/ml: Cân 28,25 mg chính xác đến 0,1mg chất chuẩn tylosin vào bình định mức 25ml (lượng cân được điều chỉnh theo hàm lượng tylosin ghi trong giấy chứng nhận), hòa tan và định mức bằng metanol. Các dung dịch chuẩn gốc bảo quản ở 4⁰C có thể sử dụng được trong vòng 1 tháng.

5.2.4.2. Dung dịch chuẩn làm việc 10g/ml: Lấy 0,1ml dung dịch chuẩn gốc (5.2.4.1) vào bình định mức 10ml, định mức tới vạch bằng metanol, lắc đều để được các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ tương ứng là 10g/ml. Pha dung dịch chuẩn làm việc trước khi phân tích mẫu.

5.2.4.3. Dãy dung dịch chuẩn phân tích sắc ký: 0,625; 1,250; 2,50; và 5,00 g/ml

Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc 10g/ml (5.2.4.2) bằng cách pha loãng với metanol (tỉ lệ thể tích 1:1) vào bình định mức dung tích 10 ml để được các dung dịch có nồng độ tương ứng là 5,00; 2,50; 1,25; 0,625 g/ ml. Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh, dung dịch này bền trong 1 tuần.

5.2.4.4. Cột nhồi nhôm oxit:

Chuẩn bị cột làm sạch bằng như sau: hoạt hóa nhôm oxit ở 500^o C trong 12 giờ. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm. Lót một lớp bông thủy tinh vào syranh nhựa 1ml (4.9), nhồi 0,5ml nhôm oxit, lót lớp trên bằng một ít bông thủy tinh. Cột được chuẩn bị khi tiến hành làm sạch mẫu (7.4).

Phương pháp lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo ISO 6497:2002. Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thí nghiệm phải là mẫu trung thực và có tính đại diện, không bị hư hại hoặc bị biến đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Khối lượng mẫu phân tích phải không được ít hơn 500 gam.

6.2.1. Mẫu ở dạng bột mịn

Nếu mẫu thí nghiệm ở dạng bột lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm thì trộn thật đều mẫu (500 gam) bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút. Sau đó chia hỗn hợp bằng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam. Cho toàn bộ mẫu thử vào hộp đựng mẫu và đậy nắp cẩn thận.

6.2.2. Mẫu có kích thước hạt vừa

6.2.2.1. Nếu mẫu thí nghiệm không lọt hết qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm nhưng lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ 3,00 mm thì trộn thật đều mẫu (không ít hơn 500 gam) bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút.

6.2.2.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫu đã trộn đều (6.2.2.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam. Nghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máy nghiền (4.1) cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm.

6.2.3. Mẫu có kích thước hạt to như dạng viên

6.2.3.1. Nếu mẫu không lọt qua sàng có kích thước lỗ sàng 3,00 mm thì cần nghiền mẫu (không ít hơn 500 gam) trên máy nghiền (4.1) cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 3,00 mm, sau đó trộn thật đều mẫu bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút.

6.2.3.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫu đã trộn đều (6.2.3.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam. Nghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máy nghiền (4.1) cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm.

Mẫu thử được bảo quản trong các lọ đựng mẫu (4.25) ở điều kiện nhiệt độ 2 - 25⁰C, nơi khô ráo.

Chú ý: Nên nghiền, trộn mẫu trong các phòng có thông gió, nên đeo kính, khẩu trang và găng tay bảo vệ.

7. Cách tiến hành

7.1. Chiết xuất mẫu

7.1.1. Cân chính xác đến 0,01g từ 1 - 5 gam mẫu đã được nghiền mịn theo mục 6 (tuỳ theo hàm lượng kháng sinh có trong mẫu) cho vào ống ly tâm dung tích 50 ml, thêm tiếp 10 ml metanol. Đậy nắp ống ly tâm và lắc ống trong 15 phút ở tốc độ cao. Chuyển ống vào máy ly tâm lạnh, ly tâm trong 15 phút ở tốc độ 4000 vòng/phút. Thu lấy dịch trong vào bình cô quay chân không. Chiết lại lần 2 như trên. Gộp toàn bộ dịch chiết vào bình cô quay.

7.1.2. Cô quay đến khô ở 35^oC, thêm 200 l metanol và lắc nhẹ. Sau đó thêm tiếp 3,8 ml đệm acetate (2.5.1). Lắc đều và chuyển toàn bộ dung dịch vào ống ly tâm 50ml. Tráng rửa bình bằng 1 ml đệm acetate, chuyển dịch rửa vào ống ly tâm.

7.1.3. Loại chất béo bằng cách thêm 5ml n-hexan vào ống ly tâm chứa dịch mẫu (7.1.2), lắc nhẹ bằng tay. Sau đó lắc mạnh ống ly tâm trên máy lắc trong 30 giây để phần chất lỏng phân lớp. Ly tâm lạnh ở 15^oC với tốc độ 2000v/ph trong 5 phút. Dùng pipet loại bỏ nhanh phần hữu cơ. Thu lấy lớp acetat (có thể tích khoảng 5ml) để làm sạch qua cột SPE và oxit nhôm.

Mẫu trắng là mẫu thức ăn chăn nuôi được xác định là không có tylosin. Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự như mẫu thử theo 7.1.

Mẫu này được bổ sung một lượng tylosin xấp xỉ dung dịch chuẩn gốc. Ví dụ, chuẩn bị dịch mẫu thu hồi có hàm lượng tylosin là 1,25 mg/kg: dùng pipet hút 0,625 ml dung dịch chuẩn làm việc 10 g/ml (5.2.4.2) cho vào 5 gam mẫu trắng (7.2) mẫu được để yên trong 30 phút trước khi tiến hành chiết xuất. Sau đó tiếp tục quá trình chiết mẫu tương tự như đối với mẫu thử (7.1)

7.4.1. Làm sạch bằng SPE:

7.4.1.1. Hoạt hóa cột: 3 ml methanol, sau đó 5 ml nước cất

7.4.1.2. Chuyển toàn bộ dịch chiết qua cột SPE (7.1.4)

Lần lượt cho các dung dịch chiết thu được từ 7.1.3, 7.2 và 7.3 qua syranh vào cột SPE - C18 đã được chuẩn bị ở trên, dùng bơm hút chân không và điều chỉnh tốc độ chảy không quá 1ml/phút. KHÔNG ĐỂ CỘT BỊ KHÔ TRONG GIAI ĐOẠN NÀY, tráng ống li tâm và rửa cột bằng rửa cột bằng 3 ml nước cất (tốc độ 1ml/phút), sau đó bằng 3 ml metanol (1ml/ phút).

7.4.1.3. Thổi khô cột SPE. Rửa giải bằng 5 ml metanol chứa 1% diethylamine với tốc độ 1,5ml/phút. Thổi khô dịch rửa giải bằng khí nitơ. Hoà tan bằng 1 ml đệm phosphate (6.2).

7.4.2. Làm sạch qua cột nhôm oxit: Đặt cột nhôm oxit đã hoạt hóa (5.2.4.4) vào giá và giữ theo hướng thẳng đứng. Chuyển 1ml dịch làm sạch qua SPE ở trên (7.4.1.3) qua cột oxit nhôm. Để dịch chảy ra tự nhiên, bỏ 0,1ml dịch đầu tiên. Thu 0,5 ml dịch chảy ra tiếp theo, lọc qua màng 0,45 m vào lọ nhỏ chuyên dụng cho HPLC (4.22) để phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng.

7.5. Phân tích trên HPLC

7.5.1. Điều kiện sắc ký: Nhiệt độ cột 30^oC; detector UV 280nm; Tốc độ dòng 0,7ml/phút; Thể tích bơm 50l. Dung môi pha động A (5.2.3) và pha động B (acetonitrile 100%). Chương trình dung môi gradient như sau:

Thời gian (phút)	% A	% B
0	100	0
0,01	100	0
0,5	60	40
12,5	60	40
14,5	100	0
20	100	0

7.5.2.1. Nên sử dụng bảo vệ cột, việc sử dụng bảo vệ cột không có bất cứ ảnh hưởng nào đến kết quả phân tích.

7.5.2.2. Cân bằng hệ thống sắc ký bằng pha động 30 phút trước khi bơm mẫu.

7.5.2.3. Quy trình bơm mẫu theo thứ tự như sau: dịch mẫu trắng, các dung dịch chuẩn, dịch mẫu thu hồi, dịch mẫu thử, các dung dịch chuẩn.

Chú ý: Cần bơm các dịch chuẩn trước và sau mỗi đợt phân tích, không nên để quá 20 lần bơm mẫu cho mỗi đợt phân tích. Nếu quá 20 lần thì phải bơm các dung dịch chuẩn thêm lần nữa vào khoảng giữa đợt bơm mẫu.

7.5.2.4. Xác định diện tích (hoặc chiều cao) pic đối với các dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử tương ứng.

7.5.2.5. Sau khi chạy máy phải làm sạch hệ thống HPLC bằng hỗn hợp gồm nước cất : axetonnitril theo tỷ lệ thể tích 40:60 trong 30 phút để loại hết đệm trong hệ thống trước khi tắt máy.

8. Tính toán kết quả

8.1. Đường chuẩn

8.1.1. Phải đảm bảo rằng các diện tích pic của mẫu thử đều nằm trong phạm vi của đường chuẩn. Nếu mẫu thử nào có diện tích pic vượt quá diện tích của đường chuẩn ở nồng độ cao nhất thì sẽ bị loại và phải tiến hành thử lại với sự pha loãng.

8.1.2. Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn với nồng độ của tylosin theo quan hệ tuyến tính bậc 1:

y = ax + b

Trong đó: y là diện tích pic (hoặc chiều cao pic)

x là nồng độ của kháng sinh

a là hệ số góc

b là hằng số

8.2.1. Hàm lượng tylosin có trong mẫu thử được tính toán dựa vào đường chuẩn hồi qui tuyến tính (8.1.2) theo công thức sau:

Trong đó: X là hàm lượng tylosin có trong mẫu thử, tính bằng mg/kg

Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết mẫu thử và diện tích pic của mẫu trắng

a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b

V là thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch (7.4.1.4), tính bằng ml

m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam

8.2.2. Kết quả cuối cùng là giá trung bình của hai lần phân tích nhắc lại. Trong quá trình tính toán luôn phải lấy 2 số sau dấu phẩy. Giá trị trung bình được làm tròn đến một chữ số thập phân.

8.2.3. Xác định độ thu hồi (R) theo công thức sau:

Trong đó:

C₁ là hàm lượng tylosin xác định được theo quy trình phân tích (tính bằng mg/kg)

C là hàm lượng tylosin được nạp thêm vào mẫu (1,25 mg/kg)

Độ thu hồi được xác định cho mỗi lần chạy mẫu ít nhất phải đạt 80%.

9. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo kết quả phải bao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:

- Mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu thử.

- Viện dẫn của tiêu chuẩn này hoặc phương pháp thử.

- Kết quả và đơn vị biểu thị kết quả.

- Ngày tháng lấy mẫu và kiểu loại lấy mẫu (nếu có).

- Ngày tháng thử nghiệm.

- Các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm.