VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Vật liệu nghiên cứu

Ba giống bông được nghiên cứu chuyển gen là C118, LRA5166 và TM1.

3.1.2. Gen kháng sâu

3.3. Phương pháp nghiên cứu

* Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

- Nuôi 1-5ml dịch khuẩn (lấy 1 khuẩn lạc cho vào môi trường LB hoặc LBG) qua đêm hoặc 16 h hoặc 10-12 OD (nếu vượt quá sẽ nhiễm RNA, DNA của khuẩn).

- Chuyển dịch khuẩn sang ống 2ml. Ly tâm 1 phút, thu lấy cặn.

- Thêm 250µl dung dịch resuspension, vortex hoặc dùng pippet hút lên, xuống cho đến khi cặn tan hoàn toàn.

- Thêm 250µl dung dịch lysis, đảo 6-8 lần cho đồng nhất (không được vortex hoặc shake để tránh nhiễm ADN của vi khuẩn), để 5 phút ở nhiệt độ phòng.

- Thêm 350µl dịch neutralization, đảo 6-8 lần (không được vortex hoặc shake).

- Ly tâm 5 phút cho lắng cặn màu trắng (dịch nổi-phần chứa ADN plasmid).

* Tinh sạch ADN plasmid

- Chuyển dịch nổi sang cột spin (chèn cột lênn ống loại 2ml-có cung cấp theo kit).

- Ly tâm 1 phút để đẩy ADN plasmid gắn chặt vào màng cột tinh sạch.

- Thêm 750µl dịch rửa 1X (thêm 4 vol cồn tuyệt đối vào dịch rửa có nồng độ 5X trước khi dùng) và ly tâm 1 phút.

- Ly ly tâm 1 phút để loại bỏ hết dịch rửa, thay cột sang ống rửa mới. Ly ly tâm 1 phút loại bỏ hoàn toàn dịch rửa.

* Thu thập mẫu tinh sạch

- Chuyển cột tinh sạch sang ống eppendorft mới (loại 1,5-2,0ml).

- Bổ sung 50µl dịch hòa tan ADN plasmid lên màng cột, cố định 1 phút để nó hàa tan và tách khỏi màng. Ly tâm 1 phút thu lấy dịch plasmid.

- Loại bỏ cột, ADN plasmid tinh sạch có thể được dùng ngay hoặc được giữ ở 4⁰C (kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%).

* Bảo quản ADN plasmid

ADN plasmid sau khi được tách chiết và tinh sạch sẽ được pha loãng bằng nước khử ion thành dung dịch mẹ có nồng độ 100g/ml và bảo quản ở tủ -20⁰C.

3.3.2. Nghiên cứu thời điểm nở hoa và kích thước bầu nhụy

- Xác định thời gian nở rộ hoa trong ngày: khi cây bông bắt đầu nở hoa, tiến hành đếm số hoa nở ở 3 khoảng thời gian (1): trước 6h ; (2): 7-9h; và (3): sau 10h.

- Xác định kích thước của bầu nhụy và chiều dài của trụ noãn: chọn các hoa nở bình thường ở vị trí thứ nhất và 2 trên các cành quả từ 1 đến 6, ở giai đoạn sau nở hoa 24 tiếng để đo đến các chỉ tiêu chiều dài, rộng của bầu. Cắt đôi bầu nhụy để xác định chiều dài của trụ noãn.

3.3.3. Chuẩn bị vi tiêm

- Tự thụ phấn trước khi hoa nở: vào chiều ngày trước khi hoa nở (ngày thứ nhất), chọn các nụ ở vị trí thứ nhất và 2 trên cành quả từ thứ nhất đến thứ 7, có cánh hoa đã nhô dài ra, chấm sơn vào đầu nụ hoặc dùng dây buộc chặt đầu nụ để cho hoa tự thụ phấn.

- Thời điểm vi tiêm: sáng ngày hôm sau (ngày thứ 2), các nụ chọn tự thụ sẽ nở hoa và thụ phấn (khoảng 6-9 h). Thời gian từ nở hoa, thụ phấn đến thụ tinh kép khoảng 24-28 tiếng, nên thời điển thuận lợi cho vi tiêm là sau khi nở hoa và thụ phấn 20-24 tiếng, tức từ 6 đến 9 h buổi sáng ngày thứ 3.

- Chuẩn bị trước khi vi tiêm

+ Chuẩn bị vi kim tiêm: sử dụng vi kim tiêm loại dung tích 10µl. Trước khi vi tiêm cần lau chùi sạch sẽ bằng cồn tuyệt đối, sau đó ngâm vào nước cất khử trùng trước và sau khi sử dụng.

+ Chuẩn bị dung dịch ADN plasmid: trước khi vi tiêm, lấy dung dịch mẹ (nồng độ 100µg/ml) pha loãng bằng nước khử ion thành các dung dịch làm việc có nồng độ 10, 20 và 30µg/ml. Thể tích dịch mỗi lần vi tiêm là 10µl.

+ Lấy dung dịch vi tiêm: Dùng 3 ngón giữa, áp út và út của tay phải giữ chặt thân xi lanh, dùng ngón trỏ và cái điều khiển pít tông. Trước khi hút dung dịch, cần đảm bảo pít tông khít với đáy xi lanh. Rút pít tông chậm và đều cho đến khi thể tích dung dịch đã vào xi lanh đủ (10µl). Chú ý, không để có bọt khí trong dịch hút.

3.3.4. Tiến hành vi tiêm

- Cắt bỏ cánh hoa hoặc đè bẹp chúng ra các bên. Cắt bỏ vòi nhụy đến sát với bầu hoa (chú ý tránh làm tổn thương các tế bào nhu mô của bầu nhụy khi cắt bỏ cánh hoa, các hoa chấm sơn bị bung ra phải bỏ đi).

- Dùng 2 ngón áp út và út của tay trái kẹp lấy cuống hoa, dùng 3 ngón còn lại giữ bầu nhụy thẳng đứng vuông góc với mặt đất. Dùng 3 ngón cái, trỏ và giữa của tay phải giữ xi lanh. Ấn thẳng đứng mũi kim tiêm vào điểm giữa của vòi nhụy, đẩy từ từ đến 2/3 chiều dài bầu nhụy, sau đó kéo lùi lại 1/3 để tạo khoảng trống, dùng ngón cái bơm nhẹ nhàng dịch tiêm vào bầu và cuối cùng rút từ từ kim tiêm ra.

- Sau khi rút kim ra, để giảm sự rụng quả, cần bôi lên vết tiêm dung dịch khử trùng và đầu cuối cuống hoa dung dịch gibberellin nồng độ 40ppm.

- Đeo thẻ để đánh dấu quả vi tiêm.

- Chăm sóc sau vi tiêm: chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh triệt để cho cây sinh trưởng phát triển tốt. Cần cắt ngọn của cành quả để tập trung dinh dưỡng nuôi quả và hạt bông quả vi tiêm.

- Thu hoạch: các quả bông vi tiêm được thu hoạch và tách lấy hạt để phục vụ cho sàng lọc cây chuyển gen sau này.

3.3.5. Phương pháp sàng lọc cây chuyển gen bằng kanamycin

3.4. Chỉ tiêu theo dõi

2- Thời điểm nở hoa, kích thước bầu nhụy và chiều dài trụ noãn.

3- Số hoa tiêm, quả đậu, quả dị dạng, số hạt.

4- Tỷ lệ cây và triệu trứng lá cây bông mẫn cảm với kanamycin.

5- Số lượng, tỷ lệ cây âm tính ở mỗi công thức.