1. MỞ ĐẦu tính cấp thiết của đề tài



tải về 0.49 Mb.
trang6/7
Chuyển đổi dữ liệu07.07.2016
Kích0.49 Mb.
1   2   3   4   5   6   7

4.4. Kết quả sàng lọc cây bông vi tiêm mang chuyển bằng kanamycin

4.4.1. Xác định nồng độ kanamycin cây bông mẫn cảm


Do trong cả 2 vectơ chuyển gen đều có chứa gen nptII (kháng kháng sinh kanamycin) đi kèm để phát hiện gen kháng sâu CryIAc và VIP3, vì vậy, có thể dùng kanamycin để sàng lọc sơ bộ cây mang gen chuyển. Tuy nhiên, giống bông khác nhau mẫn cảm với kanamycin ở nồng độ khác nhau. Để xác định nồng độ này, 3 giống bông (C118, LRA5166 và TM1) được gieo trong nhà lưới, khi cây bông được 15 ngày tuổi, tiến hành phun trực tiếp dung dịch kanamycin ở các nồng độ khác nhau lên toàn cây, sau đó tiến hành quan sát triệu chứng và đếm số cây mẫn cảm ở các giai đoạn 4, 8 và 12 ngày sau phun.

Bảng 7. Tỷ (%) lệ cây bông trong nhà lưới mẫn cảm với kanamycin



Giống

Nồng độ kanamycin (mg/l) sau 4, 8 và 12 ngày phun

0

2.500

5.000

7.500

10.000

4

8

12

4

8

12

4

8

12

4

8

12

4

8

12

D97-5

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

C118

0

0

0

30

80

100

78

100

100

100

100

100

100

100

100

LRA5166

0

0

0

64

64

91

75

100

100

100

100

100

100

100

100

TM1

0

0

0

100

100

100

20

100

100

100

100

100

100

100

100

Kết quả quan sát cho thấy, 4 ngày sau phun, xuất hiện các đốm màu vàng nhạt trên phiến lá, 12 ngày sau phun, các vết đốm này lan rộng ra (ảnh 5), đây chính là biểu hiện của cây bông mẫn cảm với kanamycin. Số liệu thu được trong bảng 7 cho thấy, 3 giống C118, LRA5166 và TM1 đều bị mẫn cảm (hay phản ứng dương tính) với kanamycin rất rõ rệt ở hầu hết các nồng độ kanamycin với tỷ lệ 100%. Cụ thể, ở nồng độ 2.500mg/l kanamycin, 4 ngày sau phun, giống TM1 biểu hiện dương tính 100%, 12 ngày sau phun giống C118 biểu hiện dương tính 100%. Giống LRA5166 biểu hiện 100% dương tính ở nồng độ cao hơn 5.000mg/l kanamycin (8 ngày sau phun). Từ kết quả này, chúng tôi kết luận, trong điều kiện nhà lưới, nên phun kanamycin với nồng độ 2.500-5.000mg/l để sàng lọc cây mamg gen cho 3 giống bông.

4.4.2. Kết quả sàng lọc cây mang gen chuyển

Sau khi xác định được triệu chứng cây bông mẫn cảm với kanamycin và nồng độ kanamycin mẫn cảm của 3 giống bông, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc cây mang gen chuyển.



4.4.2.1. Kết quả sàng lọc cây mang gen chuyển đối với gen VIP3

Kết quả sàng lọc cây mang gen chuyển đối với gen VIP3 (bảng 8) cho thấy, hạt vi tiêm có tỷ lệ mọc kém (50,6%); sau khi sàng lọc thu được 483 cây kháng kanamycin (ảnh 6b-6d) từ 41.853 hạt thu được từ vi tiêm gen VIP3, đạt tỷ lệ 2,27% (so với số cây mọc) và 1,15% (so với tổng số hạt gieo). Trong quá trình sàng lọc chúng tôi còn nhận thấy, giống V2 (LRA 5166) có tỷ lệ hạt mọc kém hơn hai giống C118 và TM1.

Bảng 8. Kết quả sàng lọc gen VIP3 (G1) bằng kanamycin

TT

Công thức

Hạt gieo

Tỷ lệ

Mọc (%)


Cây + tính

Cây - tính

Tỷ lệ cây - tính (%)

1

G1V1C1

5.523

74,1

4.058

33

0,81

2

G1V1C2

4.564

47,7

2.419

30

1,38

3

G1V1C3

4.506

50,3

2.748

19

0,69

4

G1V2C1

4.355

36,5

1.581

9

0,57

5

G1V2C2

7.055

50,3

3.490

62

1,75

6

G1V2C3

6.824

44,3

2.926

98

3,24

7

G1V3C1

3.144

57,6

1.742

68

3,76

8

G1V3C2

2.428

43,4

1.005

49

4.65

9

G1V3C3

2.454

50,1

1.136

115

9.19

Tổng

41.853

-

20.835

483

-

Trung bình

-

50,6

-

-

2,27

Ghi chú: V1-C118; V2-LRA5166; V3-TM1

C1-10µg/ml; C2-20µg/ml; C3-30µg/ml

Công thức 6-9 phun kháng sinh 2 lần

4.4.2.2. Kết quả sàng lọc cây mang gen chuyển đối với gen CryIAc

Bảng 9. Kết quả sàng lọc gen CryIAc (G2) bằng kanamycin



TT

Công thức

Hạt gieo

Tỷ lệ

mọc (%)


Cây + tính

Cây - tính

Tỷ lệ cây -tính (%)

1

G2V1C1

6.651

65,6

4.283

78

1,79

2

G2V1C2

6.200

60,4

3.642

104

2,78

3

G2V1C3

8.640

55,8

4.415

408

8,46

4

G2V2C1

5.415

30,6

1.541

118

7,11

5

G2V2C2

9.960

35,1

3.335

159

4,77

6

G2V2C3

8.945

44,2

4.541

415

11,72

7

G2V3C1

3.525

58,1

1.751

297

16,96

8

G2V3C2

4.462

62,5

2.433

356

14,63

9

G2V3C3

5.024

64,3

2.908

322

11,07

Tổng

58.822

-

28.849

2.257

-

Trung bình




52,9







-

Ghi chú: V1-C118; V2-LRA5166; V3-TM1

C1-10µg/ml; C2-20µg/ml; C3-30µg/ml

Công thức 6-9 phun kháng sinh 2 lần

Tương tự, kết quả sàng lọc cây mang gen chuyển đối với gen CryIAc (bảng 9) cũng cho thấy, hạt vi tiêm có tỷ lệ mọc kém, trung bình đạt 52,9%; sau khi sàng lọc thu được tới 2.257 cây kháng kanamycin (ảnh 6b-6d) từ 58.822, cao hơn nhiều so với khi sàng gen VIP3. Sở dĩ khi sàng lọc cây mang gen ở gen CryIAc thu được số cây âm tính cao như vậy, theo chúng tôi ngoài yếu tố hiệu quả chuyển gen cao còn do sau khi phun kháng sinh thì gặp mưa, nên hiệu quả của kháng sinh không cao như mong muốn.

Số cây phản ứng âm tính thu được ở cả 2 gen sau đó được chăm sóc, tự thụ và thu quả riêng từng cây để tiếp tục cung cấp hạt cho sàng lọc ở các thế hệ tiếp theo và đánh giá gen bằng các kỹ thuật sinh học phân tử.

1   2   3   4   5   6   7


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2016
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương