1. MỞ ĐẦu tính cấp thiết của đề tài



tải về 196.89 Kb.
trang2/2
Chuyển đổi dữ liệu21.08.2016
Kích196.89 Kb.
#24957
1   2

PHỤ LỤC


Phụ lục 1. Các hóa chất và thiết bị

  1. Hóa chất dùng cho tách chiết ARN tổng số: Trizol reagent, CH3COONa, Chloroform, Isoamyl alcohol, Isopropanol, LiCl, NaCl, SDS, Tris-HCl, EDTA, Sarchosyl, NaOH, Ethanol 100%, Nitơ lỏng.

  2. Hóa chất dùng cho điện di: Agarose, Tris-base, Acide boric, EDTA, MOPS, formADNehyl, formamide.

  3. Hóa chất dùng cho phản ứng tổng hợp cADN: Bộ kít tổng hợp cADN của hãng Bio-Rad.

  4. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Buffer 10X, dNTPs 2,5mM, Primer 10pM, MgCl2 25mM, Taq 5u/l.

  5. Hóa chất dùng cho phản ứng lai: Bộ kit lai (vector pCR 2.1, Buffer 10X).

  6. Hóa chất dùng cho biến nạp: Bactor Agar, NaCl, Tripton, cao nấm men, Glycerol, Kanamycine, X-gal, IPTG, vi khuẩn E.coli khả biến.

  7. Hóa chất dùng cho tách dòng: Tris-base, EDTA, Isopropanol, cồn 100%, LiCl, Triton X, Kali acetate, Lysozyme, ARNase, enzyme cắt giới hạn E.coRI, các dung dịch đệm.

  8. Tủ lạnh (-840C, -200C và tủ thường), tủ cấy vô trùng, tủ nuôi vi sinh, tủ nuôi lắc vi sinh, nồi cách thủy, máy lắc, bộ điện di gel agarose, máy làm khô ADN, máy li tâm, máy làm khô ADN, máy soi và chụp ảnh gel, máy PCR, máy xác định trình tự ADN, máy voltex.

  9. Ống eppendoft các loại (2ml, 1,5ml, 2ml), đầu tip (10/l, 200/l, 1000/l), bình nuôi khuẩn, ống giữ chủng, ống corning, cột tinh sạch ADN, pipetman và pipet tip các loại, que cấy vi sinh, đĩa petri, giấy nhôm, đèn cồn, cối chày sứ....

  10. TE (Tris-EDTA): 10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA, pH 8.0.

  11. MOPS : 0,4M MOPS, 100mM Sodium Acetate, 10mM EDTA, pH 7.0.

  12. TELT : 0,5M Tris-HCL, 0,5M EDTA, 1M LiCl, 0,4%Triton X

  13. Môi trường LB (Luria Bertani)

TT

Tên hóa chất

Lượng (g/l)

Ghi chú

1

Cao nấm men

5




2

Bacto Triptone

10




3

NaCl

10




4

Bacto Agar

16

(Môi trường LB agar)

Phụ lục 2. Quy trình tách chiết ADN tổng số từ lá bông (Li và cs, 2001)

  1. Mẫu lá được nghiền nhanh, kỹ bằng đũa thuỷ tinh trong nitơ lỏng.

  2. Bổ sung 0,8ml WB, vortex trong 40-60 giây.

  3. Ly tâm 13.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi.

  4. Có thể lặp lại bước 2 và 3.

  5. Bổ sung 200l WB, vortex trong khoảng 40-60 giây, sau đó bổ sung thêm 2.4l RNase (nồng độ 10mg/ml).

  6. Bổ sung thêm 720l EB, đảo ống eppendorf khoảng 20-40 lần.

  7. Ủ ở 65 0C trong 1,5.2 giờ.

  8. Bổ sung 600l CIA (v/v 1:1) và lắc mạnh mẫu từ 10-15 phút.

  9. Ly tâm 13.000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút, nhẹ nhàng hút và chuyển dịch chiết sang ống eppendorf 1,5ml mới.

  10. Có thể lặp lại các bước 8 và 9 nếu dịch chiết không trong.

  11. Bổ sung 700l Isopropanol lạnh (1:1 v/v), giữ dịch chiết ở-200C trong 30 phút.

  12. Ly tâm 10.000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút.

  13. Rửa cặn ADN trong Ethanol 70%.

  14. Làm khô và hoà tan cặn ADN với 30-50l TE hoặc nước khử ion.

  15. Điện di kiểm tra ADN với agarose 0,1%, nhuộm với Ethidium Bromide 5l/1ml.

  16. Soi ADN dưới đèn tử ngoại và chụp ảnh ADN bằng máy Geldoc 2000.

Phụ lục 3. Các quy trình tách chiết ARN

3.1. Phương pháp tách chiết ARN theo phương pháp chiết Phenol

  1. Thu khoảng 250mg lá mỗi loại mẫu, loại bỏ gân lá cho vào ống effpendoft, để ngay vào nitơ lỏng (nếu chưa sử dụng ngay thì bảo quản ở -80oC) cho đến khi đông hoàn toàn. Sử dụng cối chày sứ nghiền thành bột.

  2. Thêm 0,5ml EB và 0,5ml phenol bão hoà trong TE, ủ ở 80oC trong 1 phút, sau đó mix mạnh trong 30 giây, tiếp tục ủ ở 80oC trong 2 phút và mix thêm lần nữa.

  3. Thêm 0,5ml hỗn hợp Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1), Chloroform được giữ lạnh trước khi sử dụng. Lắc mạnh trong 30 giây.

  4. Li tâm ở 14.000v/p trong 5 phút, chuyển pha trên sang ống mới và thêm vào 1 vol 4M LiCl. Mix kỹ và để qua đêm ở 4o C.

  5. Li tâm ở 14.000v/p trong 5 phút, loại pha trên. Thêm vào 100l dH2O để hoà tan tủa. Chuyển sang ống mới, giữ trên đá, thêm vào 0,1 vol 3M sodiume acetate và 2 vol cồn tuyệt đối. Mix kỹ và giữ qua đêm ở -20o C hoặc -70o C trong 30 phút.

  6. Li tâm ở 14.000v/p trong 15 phút, đổ bỏ phần dịch. Rửa cặn bằng 200l cồn 70%. Li tâm ở 14.000v/p trong 5 phút, đổ bỏ phần dịch.

  7. Làm khô cặn trên máy Speed- vaccum. Hoà tan cặn bằng 50l (hoặc hơn) Tris-SDS. Thêm vào 2vol cồn tuyệt đối và 0,1 vol 3M sodiume acetate, pH 5.8 để tính toán nồng độ ARN bằng máy đo quang phổ và trữ ở -20o C.

  8. Lấy 1 g ARN để kiểm tra chất lượng trên gel agarose 1,2%.

3.2. Phương pháp tách chiết ARN sử dụng Trizol reagent (Invitrogen)

  1. Lá bông của 3 loại mẫu nói trên được thu vào các ống corning, bảo quản ở tủ -800C cho đến khi sử dụng.

  2. Lấy mẫu lá bông từ tủ -800C và nghiền nhanh trong nitơ lỏng (hoặc nghiền trong dung dịch EB2), chuyển bột mịn vào trong ống effpendoft 2ml. Thêm 1ml dung dịch EB2, đảo đều.

  3. Bổ sung 600l Trizol reagent, đảo đều, ủ trên đá trong 10 phút.

  4. Li tâm 10.000v/p trong 10 phút. Hút dịch nổi sang ống effpendoft 2ml mới.

  5. Bổ sung tỉ lệ 1:1 giữa thể tích dịch nổi với Chloroform, Isoamyl (24:1). Thêm 200l CH3COONa. Lắc mạnh, ủ trên đá trong 10 phút.

  6. Li tâm 10.000v/p trong 10 phút. Hút dịch nổi sang ống effpendoft 2ml mới. Bổ sung Isopropanol với tỉ lệ 1:1 so với dịch nổi.

  7. Ủ mẫu ở -200C 2-3 giờ. Li tâm 10.000v/p trong 10 phút. Đổ bỏ dịch nổi thu phần cặn phía dưới.

  8. Rửa cặn với cồn 70%. Làm khô cặn bằng máy Speedvac. Hòa tan cặn trong nước DEPC 0,01%. Bảo quản mẫu trong tủ -20oC.

  9. Lấy 1g ARN để kiểm tra chất lượng trên gel agarose 1,2%.

3.3. Quy trình điện di ARN bằng gel agarose chứa Formandehyde

  1. Rửa sạch dụng cụ của bộ điện di bằng giaven, rửa kỹ bằng nước và tráng bằng nước cất vô trùng. Lau khô bằng cồn 70%.

  2. Đặt bộ điện di vào tủ hood, lắp ghộp...

  3. Nấu tan 0.5g agarose trong 30ml dH2O vô trùng. Làm nguội đến 55-60oC, thờm 5ml 10X MOPS buffer và 3.75ml dung dịch 37% formADNehyde. Cho thờm dH2O vô trùng đến 50ml.

  4. Trút gel vào khay, để khoảng 30 phút.

  5. Mix mẫu RNA với đệm theo tỷ lệ 1:3 (v/v): 67 phần Formamide khử ion, 20 phần dung dịch FormADNehyde và 13 phần 10X MOPS (và 100g/l ethydium bromide). Làm núng ở 60oC trong 5 phút, sau đó để ngay lên đá. Spin, bổ sung 0.2 vol loading dye.

  6. Chuyển lược ra khỏi gel, load toàn bộ mẫu vào giếng, đổ vừa ngập đệm 1X MOPS. Chạy khoảng 45 phút, cường độ dũng điện 80mA.

  7. Lấy gel ra khỏi đệm, ngâm bằng nước cất có bổ sung 1% (w/v) Glycine trong 60 phút, sau đó nhuộm với 10mg/ml ethydium bromide (nếu không cho trong quá trình điện di), rửa lại bằng nước và soi trên đèn UV.

Phụ lục 4. Quy trình biến nạp bằng sốc nhiệt

  1. Lấy tế bào khả biến (60l) từ tủ -800C, để tan trên đá.

  2. Bổ sung 3l sản phẩm lai. Để trên đá 30 phút.

  3. Sốc nhiệt ở 420C trong 1 phút.

  4. Bổ sung 400l môi trường LB lỏng.

  5. Nuôi lắc 200 vòng/phút, ở 370C, trong 1 giờ.

  6. Cấy trải lên môi trường LB đặc có bổ sung 50mg/l Kanamycin, 40 mg/l X-gal và IPTG nuôi ở 370C qua đêm.

Phụ lục 5. Quy trình tách chiết và tinh sạch plasmid

* Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

  1. Nuôi 1-5 ml dịch khuẩn (lấy 1 khuẩn lạc cho vào môi trường LB hoặc LBG) qua đêm hoặc 16 h hoặc 10-12 OD (nếu vượt quá sẽ nhiễm RNA, DNA của khuẩn).

  2. Chuyển dịch khuẩn sang ống 2 ml. Ly tâm 1 phút, thu lấy cặn.

  3. Thêm 250 µl dung dịch resuspension, vortex hoặc dùng pippet hút lên, xuống cho đến khi cặn tan hoàn toàn.

  4. Thêm 250 µl dung dịch lysis, đảo 6-8 lần cho đồng nhất (không được vortex hoặc shake để tránh nhiễm ADN của vi khuẩn), để 5 phút ở nhiệt độ phòng.

  5. Thêm 350 µl dịch neutralization, đảo 6-8 lần (không được vortex hoặc shake).

  6. Ly tâm 5 phút cho lắng cặn màu trắng (dịch nổi – phần chứa ADN plasmid).

* Tinh sạch ADN plasmid

  1. Chuyển dịch nổi sang cột spin (chèn cột lênn ống loại 2 ml - có cung cấp theo kit).

  2. Ly tâm 1 phút để đẩy ADN plasmid gắn chặt vào màng cột tinh sạch.

  3. Thêm 750 µl dịch rửa 1X (thêm 4 vol cồn tuyệt đối vào dịch rửa có nồng độ 5X trước khi dùng) và ly tâm 1 phút.

  4. Ly ly tâm 1 phút để loại bỏ hết dịch rửa, thay cột sang ống rửa mới. Ly ly tâm 1 phút loại bỏ hoàn toàn dịch rửa.

* Thu thập mẫu tinh sạch

  1. Chuyển cột tinh sạch sang ống eppendorft mới (loại 1,5-2,0 ml).

  2. Bổ sung 50 µl dịch hòa tan ADN plasmid lên màng cột, cố định 1 phút để nó hòa tan và tách khỏi màng. Ly tâm 1 phút thu lấy dịch plasmid.

  3. Loại bỏ cột, ADN plasmid tinh sạch có thể được dùng để đọc trình tự ngay hoặc được giữ ở 40C (kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%).

Phụ lục 6. Trình tự đoạn gen 770 nt

AACTCTCAAAGTTTCTCTTCGTACTGATTGCTCTGGTTTCGACTGGAGTGTAGCCGACTGGATGCTTCACGCCTCACGGTACAGAACAATTTACTGACGAGGCGCCTTCGAGCCTGCTGGCTCAGGTGCATATCTAACTCAGTTCTGTGCCTTTCAGACGGAACGCTGCTAACCCAACGAGTGGCTGGAGTGCAAAAGAGCGGTAGTTACAACACCAGCTCCTCCAACAGCAGAATCCGCGTTATGAAAGCTTACCATTGTGGAGCCTCATGGGCGATGGCCATGGGCGATGATGCCCTTGAATCAGTGGACACGGACCTATCCGTGTATAAACAATTAGGTTTTAAAGTCGAGGTGTCAGGAGAACTGGAGTTCTGTTCTCATATCTTTCTTTCCCCTACCCTCGCCGTCCCGGTGAATAGAGCCAAGGTGCTCTACAAGCTCATACATGGGTATAACCCGGGATCAGGAAATCTGGAGGTTATCTCCAACTACCTGAACGCCTGTTTCAGCGTTTTAAACGAGTTGCGTTCAGACCCAGATTTCGTAGCTCTCCTCTACTCGTGGCTCGTCACTCCAGTCTTGCCACAAAAGAACGATACAGAGGATTGATGTCATTGCAACAGGCTTAAGCGAGCTTAATTTACGGCTATAATCATGAACTGATTTACCGCATATGCCGCTCTTTTCTTCATGTTCTCCCTTTGCTCAACTGCAAAAGAGGCAGGATTGATGAGATGGAGGTCCGGAACCTCCTCTTCTCCTGCAGC



TÀI LIỆU THAM KHẢO


  1. Cauquil J, Vaissayre M (1971) La “maladie bleue” du cotonnier en Afrique: transmission de cotonnier a` cotonnier par Aphis gossypii glover. Cot Fib Trop 26: 463–466.

  2. Cauquil J (1977) Etudes sur une maladie d’origine virale du cotonnier: la maladie bleue. Cot Fib Trop 32: 259–278.

  3. Chomczynski P ADN Sacchi N (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guani- dinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162: 156.

  4. Church GM, Gilbert W (1984) Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci 81: 1991–1995.

  5. Corpet F (1988) Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res 16: 10881–10890.

  6. CORRÊA, Régis Lopes; T. F. Silva ; Bonis, MArcos de; Barroso, Paulo A.V.; Vidal, M. S.; Vaslin, M.F.S. . Identificação e caracterização do agente causal da doença azul do algodoeiro. In: V Congresso Brasileiro do Algodão, 2005, Salvador. Anais do V Congresso Brasileiro do Algodão, 2005.

  7. CORRÊA, Régis Lopes; T. F. Silva; J.L Simões -Araujo; Vidal, M. S.; Barroso, Paulo A.V.; M.F.S. Vaslin. Molecular characterization of a virus from de family Luteoviridae associated with cotton blue disease. Archives of Virology, v. 150, p. 1357-1367, 2005.

  8. D’Arcy, C. J., Domier, L. L. & Mayo, M. A. (2000). Family Luteoviridae. In Virus Taxonomy: Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses , pp. 775-784. Edited by M. H. V. van Regenmortel, C. M. Fauquet, D. H. L. Bishop, E. B. Carstens, M. K. Estes, S. M. Lemon, J. Maniloff, M. A. Mayo, D. J. McGeoch, C. R. Pringle & R. B. Wickner. San Diego:Academic Press.

  9. Domier LL, Mccoppin NK, Larsen RC, D’arcy CJ (2002) Nucleotide sequence shows that Bean leafroll virus has a luteovirus-like genome organization. J Gen Virol 83: 1791–1798.

  10. Gibbs, M. J., Armstrong, J. S. & Gibbs, A. J. (2000). Sister-scanning: a Monte Carlo procedure for assessing signals in recombinant sequences. Bioinformatics 16, 573-582.

  11. Guilley H, Richards KE, Jonard G (1995) Nucleotide sequence of beet mild yellowing virus RNA. Arch Virol 140: 1109–1118.

  12. Kumar S, Tamura K, Jakobsen IB, Nei M (2001) Mega2. Molecular evolutionary genetics analysis software. Bioinformatics 17: 1244–1245.

  13. Maia IG, Goncalves MC, Arruda P, Vega J (2000) Molecular evidence that Sugarcane yellow leaf virus (SCYLV) is a member of the luteoviridae family. Arch Virol 145: 1009–1019.

  14. Maniatis T, Fritsch EF, ADN Sambrook J (1982) Gel electrophoresis of RNA. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp 199-203, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

  15. Mayo MA, Ziegler-Graff V (1996) Molecular biology of luteoviruses. Adv Virus Res 46: 413–460.

  16. Moonan F, Molina J, Mirkov TE (2000) Sugarcane yellow leaf virus: an emerging virus that has evolved by recombination between luteoviral ADN poleroviral ancestors. Virology 269: 156–171.

  17. Naidu RA, Mayo MA, Reddy SV, Jolly CA, Torrance L (1997). Diversity among the coat proteins of luteoviruses associated with chickpea stunt disease in India. Ann Appl Biol 130: 37–47.

  18. Nguyễn Thị Thanh Bình, 1999. Nghiên cứu bệnh xanh lùn bông ở phía nam và một số biện pháp phòng trừ. Luận án tiến sĩ Nông nghiệp, Hà Nội.

  19. O.M. Royo ADN et al. Screening of Cotton Germplasm for "Blue Disease" under Natural Field infestation. Argentina.

  20. Invitrogen 2006. Protocol extraction RNA. TRIZOL® Reagent. Cat. No. 15596-026.

  21. Invitrogen 2007. Protocol using TA-cloning kit.

  22. Rathjen, J. P., Karageorgos, L. E., Habili, N., Waterhouse, P. M. & Symons, R. H. (1994). Soybean dwarf luteovirus contains the third variant genome type in the luteovirus group. Virology 198, 671-679.

  23. Reddy SV, Kumar PL (2004) Transmission ADN properties of a new luteovirus associated with chickpea stunt disease in India. Cur Sci 86: 1157–1161.

  24. Sambrook J, Fritsch EF ADN Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York.

  25. Schneiderbauer A, SADNermann jr. H ADN Ernst D (1991) Isolation of functional RNA from plant tissues rich in phenolic compounds. Anal Biochem 197: 91-95.

  26. Schultz DJ, Craig R, Cox-Foster DL, Mumma RO ADN Medford JI (1994) RNA isolation from recalcitrant plant tissue. Plant Mol Biol Reptr 12: 310-316.

  27. Smith, G. R., Borg, Z., Lockhart, B. E. L., Braithwaite, K. S. & Gibbs, M. J. (2000). Sugarcane yellow leaf virus: a novel member of the Luteoviridae that probably arose by inter-species recombination. Journal of General Virology 81, 1865-1869.

  28. Terauchi, H., Kanematsu, S., Honda, K., Mikoshiba, Y., Ishiguro, K. & Hidaka, S. (2001). Comparison of complete nucleotide sequences of genomic RNAs of four Soybean dwarf virus strains that differ in their vector specificity ADN symptom production. Archives of Virology 146, 1885-1898.

  29. Terradot L, Souchet M, Tran V, Ducray-bourdin DG (2001) Analysis of a three- dimensional structure of Potato leafroll virus coat protein obtained by homology modeling. Virology 286: 72–82.

  30. Van Regenmortel MH, Bishop DH, Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Calisher CH (1997) Guidelines to the demarcation of virus species. Arch Virol 142: 1505–1518.

mỤC LỤC

2.3.1. Kỹ thuật PCR và RT-PCR 5

PHỤ LỤC 14

TÀI LIỆU THAM KHẢO 18







tải về 196.89 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
1   2




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương