Ở đây có ba giống virus cúm A, b và C; chỉ các virus cúm a mới gây bệnh cho các loài chim. Các chẩn đoán là bằng phân lập hay phát hiện và phân loại cho virus

Tất cả virus cúm A đều có vỏ bao nucleocapsid và sinh chất matrix có tính kháng nguyên giống nhau. Điều này cho phép phát hiện sự có mặt của các kháng thể đối với mọi virus cúm A bằng các xét nghiệm AGID. Các chếphẩm virus cô đậm, như được nêu trên, của cả kháng nguyên vỏ bao nucleocapsid lẫn kháng nguyên sinh chất matrix của virus; kháng nguyên sinh chất matrix khuyếch tán nhanh hơn kháng nguyên vỏ bao nucleocapsid. Các xét nghiệm AGID đã được áp dụng rộng rãi thành thủ tục để phát hiện các kháng thể đặc hiệu trong các đàn gà và gà tây làm chỉ thị của bệnh nhiễm. Các xét nghiệm này thường sử dụng các chế phẩm làm giàu nucleocapsid chế tạo từ màng túi ối của phôi trứng vịt – fowl (7) mà đã được gây nhiễm lúc 10 ngày ấp, được tạo huyền phù, được đông lạnh – giải đông ba lần, và được ly tâm ở 1.000 g. Dịch phù nổi thu được đem làm bất hoạt bằng cách thêm vào formalin 0,1% hay betapropiolactone 1%, được ly tâm tiếp và đem sử dụng làm kháng nguyên. Không phải tất cả các loài chim đều có thể cho ra phản ứng ngưng kết các kháng thể sau khi bị nhiễm các virus cúm.

Các xét nghiệm thường được thực hiện bằng sử dụng các thể keo của agarose 1% (w/v) hay agar đã được tinh lọc, với 8% NaCl (w/v) trong đệm phosphate 0,1 M, pH 7,2, sau đó thể keo này được trút vào các đĩa Petri thành lớp dày 2 – 3 mm hay dàn trải trên phiến kính hiển vi. Sử dụng khuôn dập để đục các giếng trên lớp agar, đường kính mỗi giếng khoảng 5 mm, mỗi giếng cách nhau 2 – 5 mm. Mỗi mô hình các giếng phải bố trí sao cho từng giếng chứa huyết thanh đem xét nghiệm kế bên giếng có huyết thanh và giếng có kháng nguyên đã biết. Điều này tạo cho nhận thấy phản ứng liên tục giữa huyết thanh dương tính đã biết, huyết thanh đem xét nghiệm và kháng nguyên nucleocapsid. Khoảng 50 µl từng tác nhân thử này được cho vào từng giếng.

Các vạch ngưng kết có thể nhận thấy được sau khoảng 24 – 48 giờ, nhưng thời gian xuất hiện vạch ngưng kết phụ thuộc vào hàm lượng của kháng thể và kháng nguyên. Những vạch ngưng kết này quan sát tốt nhất trên nền sậm màu mà được chiếu sáng từ phía sau. Một kết quả đặc hiệu, dương tính được nhận biết khi vạch ngưng kết hiện ra ở khoảng giữa các giếng chứa huyết thanh dương tính đã biết, nối tiếp với vạch giữa giếng chứa kháng nguyên và giếng chứa huyết thanh đem xét nghiệm. Các vạch đứt đoạn được diễn giải là do huyết thanh đem xét nghiệm thiếu các kháng thể giống với kháng thể trong giếng đối chứng dương tính.

Các biến thể trong phương pháp của các xét nghiệm HA và HI được thực hiện trong các phòng thí nghiệm khác nhau. Các thí dụ dưới đây áp dụng với các phiến vi hiệu giá plastic có đáy giếng hình V, trong đó thể tích cuối cùng của cả hay dạng xét nghiệm này là 0,075 ml. Các tác nhân thử cho các xét nghiệm này là isotonic PBS (0,01 M), pH 7,0 – 7,2, và hồng cầu (red blood cells – RBCs) lấy từ tối thiểu ba con gà SPF hay SAN và được gom chung trong thể tích tương đương của dung dịch Alsever. Các tế bào phải được rửa ba lần trong PBS trước khi sử dụng, thành một dịch chứa 1% (hồng cầu v/v). Các kháng nguyên đối chứng dương tính và âm tính và kháng huyết thanh phải được kết hợp trong từng xét nghiệm.

1. 
   Chia 0,025 ml PBS vào từng giếng của phiến plastic có giếng đáy hình V.
   
2. 
   Cho 0,025 ml dịch chứa virus (tức là dịch ối đã gây nhiễm) vào giếng đầu tiên. Để xác định chính xác HA, dịch chứa này phải gần với giới hạn của một chuỗi pha loãng ban đầu, tức là 1/3, 1/4, 1/5, 1/6…
   
3. 
   Tạo các độ pha loãng gấp đôi của các thể tich,025 ml của dịch chứa virus trên phiến.
   
4. 
   Cho thêm 0,025 ml PBS vào từng giếng.
   
5. 
   Cho 0,025 ml dịch chứa hồng cầu gà 1% (v/v) vào từng giếng.
   
6. 
   Trộn bằng cách gõ nhẹ lên phiến và sau đó để hồng cầu lắng xuống trong 40 phút ở nhiệt độ phòng, tức là khoảng 20^oC, hay 60 phút ở 4^oC nếu nhiệt độ phòng quá cao, với thời gian này, hồng cầu đối chứng sẽ lắng xuống thành hình nút rõ ràng.
   
7. 
   Ngưng kết hồng cầu (HA) được xác định bằng cách nghiêng phiến và quan sát có hay không dạng giọt nước của hồng cầu chảy nghiêng. Hiệu giá sẽ được đọc đến độ pha loãng cao nhất mà cho ra ngưng kết hồng cầu hoàn toán (không chảy thành dạng giọt nước); hiệu giá này thể hiện là 1 đơn vị HA (1 unit HA hay 1 HAU) và có thể được tính toán một cách chính xác từ loạt chuỗi pha loãng ban đầu.
   

1. 
   Chia 0,025 ml PBS vào từng giếng đáy hình V của một phiến plastic.
   
2. 
   Cho 0,025 ml huyết thanh vào giếng đầu tiên của phiến.
   
3. 
   Tạo các độ pha loãng gấp đôi của các thể tích 0,025 ml của huyết thanh, trên phiến.
   
4. 
   Thêm 4 HAU virus/kháng nguyên trong 0,025 ml vào từng giếng và để tối thiểu 30 phút ở nhiệt độ phòng (tức là khoảng 20^oC) hay 60 phút ở 4^oC.
   
5. 
   Thêm 0,025 ml dịch hồng cầu gà 1% (v/v) vào từng giếng và sau khi trộn đều, để cho hồng cầu lắng xuống trong khoảng 40 phút ở nhiệt độ phòng, tức là khoảng 20^oC, hay 60 phút ở 4^oC nếu nhiệt độ phòng quá cao, trong thời gian này, hồng cầu đối chứng sẽ lắng xuống thành hình nút rõ rệt.
   
6. 
   Hiệu giá HI là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà ức chế hoàn toàn 4 HAU kháng nguyên. Quá trình ngưng kết được xác định bằng nghiêng phiến. Chỉ những giếng mà có hồng cầu chảy nghiêng giống như ở giếng hồng cầu đối chứng (chỉ chứa 0,025 ml hồng cầu và 0,05 ml PBS) thì mới được coi là thể hiện ức chế ngưng kết.
   
7. 
   Giá trị của các kết quả sẽ được so với một huyết thanh âm tính đối chứng, mà không cho ra hiệu giá > 1/4 (>2² hay >log₂2 khi được biểu diễn theo mẫu số), và một huyết thanh dương tính đối chứng với hiệu giá phải trong vòng một độ pha loãng của hiệu giá đã biết.
   

Huyết thanh gà hiếm khi cho ra các phản ứng dương tính không đặc hiệu trong xét nghiệm này, và mọi xử lý trước đối với huyết thanh là không cần thiết. Huyết thanh của các loài chim khác có thể đôi khi gây ngưng kết hồng cầu gà, do vậy đặc điểm này cần phải được xác định trước và sau đó loại trừ bằng hấp phụ huyết thanh này với hồng cầu gà. Điều này thực hiện bằng thêm 0,025 ml hồng cầu gà vào từng 0,5 ml kháng huyết thanh, lắc trộn nhẹ nhàng và để yên ít nhất 30 phút; hồng cầu này sau đó được gom lại bằng ly tâm ở 800 g trong 2 – 5 phút và huyết thanh đã hấp phụ được gạn bỏ. Cách khác, sử dụng hồng cầu của các loài chim cần điều tra.

Xét nghiệm ức chế neuraminidase đã được áp dụng để nhận diện chủng neuraminidase của virus cúm gia cầm trong dòng phân lập được, và để phân loại kháng thể trong chim bị nhiễm. Phương pháp cần có chuyên gia kinh nghiệm và các tác nhân thử; do đó xét nghiệm này thường được thực hiện trong các Phòng thí nghiệm Tham chiếu của OIE. Chiến thuật DIVA (phân biệt các con vật đã được cấp vaccin với con vật bị nhiễm virus) đã áp dụng ở Ý cũng dựa vào một xét nghiệm huyết thanh học để phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng N; phương pháp xét nghiệm này cũng đã được mô tả (12).

Các bộ kit ELISA thương mại mà phát hiện kháng thể đối với protein vỏ bao nucleocapsid của virus, cũng sẵn có. Các bộ kit với định dạng gián tiếp và cạnh tranh đã được phát triển và hiện nay được sử dụng cho phát hiện các kháng thể đặc hiệu kháng virus bệnh cúm gia cầm. Các bộ kit này phải được đánh giá về đặc hiệu theo loài sẽ được đem xét nghiệm. Một số xét nghiệm phân biệt và các phương pháp xử lý kháng nguyên đã được áp dụng. Những xét nghiệm này thường được đánh giá bởi nhà sản xuất, và điều quan trọng là các hướng dẫn phải được chỉ ra một cách cặn kẽ.

Ngày nay, các kỹ thuật tiện dùng cho phân lập và phân loại virus, để chẩn đoán bệnh cúm gia cầm, là các phương pháp tốt nhất, ít nhất là tốt đối với chẩn đoán ban đầu về bệnh nhiễm cúm gia cầm. Tuy nhiên, các phương pháp phổ biến này thường đắt tiền, công việc nặng nhọc và chậm cho kết quả. Ở đây đã có các phát triển và cải tiến lớn trong các kỷ thuật phân tử và các kỹ thuật chẩn đoán khác, nhiều kỹ thuật trong đó đã được áp dụng cho chẩn đoán bệnh nhiễm cúm gia cầm.

Ở đây hiện có một số bộ kit thương mại cho bắt giữ kháng nguyên mà có thể phát hiện sự hiện diện của virus cúm A ở gà (49). Hầu hết các bộ kit này là miễn dịch enzyme (enzyme immunoassay) và sử dụng một kháng thể đơn giá đối với nucleoprotein; các bột kit này sẽ có khả năng phát hiện mọi virus cúm A. Lợi điểm chính của những xét nghiệm này là có thể chứng minh sự hiện diện của virus cúm gia cầm trong vòng 15 phút. Bất lợi là thiếu độ nhạy, các bộ kit này có thể không được đánh giá cho các loài chim khác nhau, không thực hiện được phân chủng virus và đắt tiền. Các xét nghiệm chỉ được diễn giải kết quả trên cơ sở đàn gia cầm và không dùng làm xét nghiệm riêng cho từng cá thể. Các mẫu lấy từ hầu họng hay khí quản của chim bị nhiễm hay đã chết cho ra độ nhạy tốt nhất. Hơn nữa, sự thiếu độ nhạy là bất lợi chính đối với ứng dụng của các xét nghiệm phát hiện kháng nguyên hiện nay. Chua và cộng sự (14) đã đánh giá năm xét nghiệm phát hiện và đã cho thấy tổng thể độ nhạy từ 36,3% đến 51,4%; những tác già này chỉ ra rằng trong lĩnh vực về độ nhạy sử dụng các mẫu quét tăm bông lỗ huyệt và khí quản, các xét nghiệm này thể hiện kém với các mẫu lấy từ thủy cầm (waterflow) hay chim hoang dã, so với các mẫu lấy từ gà.

Tuy nhiên, như đã được chứng minh bằng các định nghĩa hiện tại về HPNAI, các kỹ thuật phân tử đôi khi đã được áp dụng trong các chẩn đoán bệnh cúm gia cầm, hiện nay đã được phát triển trong ứng dụng phát hiện và phân loại virus cúm gia cầm một cách trực tiếp từ các mẫu lâm sàng của chim bị nhiễm. Ở đây nhấn mạnh rằng, khi áp dụng các phương pháp phát hiện phân tử độ nhạy cao mà cho phép phát hiện nhanh chóng RNA của virus, để xác nhận các chẩn đoán phòng thí nghiệm về bệnh nhiễm cúm gia cầm, các giao thức nghiêm ngặt được đặt ra để ngăn ngừa nguy cơ về vấy nhiễm chéo giữa các mẫu lâm sàng. Ngoài ra, phương pháp luận về xét nghiệm RT-PCR phải được đánh giá theo tiêu chuẩn của OIE (xem Chương 1.1.4 Các nguyên tắc về đánh giá các xét nghiệm chẩn đoán đối với các bệnh truyền nhiễm) sử dụng chất liệu lâm sàng đối với chứng minh các xét nghiệm là “phù hợp cho áp dụng” để ứng dụng trong điều kiện chẩn đoán thực địa, mà có thể bao gồm áp dụng các tiêu chuẩn xét nghiệm nội bộ. Thí dụ, quá trình khuyếch đại PCR của một “gen lưu giữ trong phòng thí nghiệm – house-keeping gene” mà giúp chuẩn hóa các kết quả bằng cho ra thông tin về gen mục tiêu này là tương đương về chất lượng đối với sự hiện diện của mẫu lâm sàng có trong tăm bông. Việc kiểm soát các phản ứng góp phần cho ra độ tin cậy cao hơn trong tính chính xác của các phản ứng phân tử, các mẫu lâm sàng và các kết quả.

Các kỹ thuật RT-PCR trên các mẫu lâm sàng với các đoạn mồi được xác định một cách chính xác, có thể cho kết quả phát hiện nhanh chóng và nhận diện ra phân chủng (ít nhất là thuộc H5 hay H7), cộng với một sản phẩm DNA mà có thể sử dụng để phân tích kết chuỗi nucleotide (37, 54, 55). Ứng dụng thực tế của các xét nghiệm RT-PCR có thể nhanh chóng nhận diện ổ dịch tiếp theo một khi các ở dịch ban đầu đã được phát hiện và virus đã được phân loại. Kỹ thuật này đã được áp dụng thành công trong các trận dịch cùm gia cầm có khả năng gây bệnh cao vào năm 2003 ở Hà Lan. Các thử nghiệm quay vòng (ring trials) được thực hiện gần đây ở Liên minh Châu Âu đã nhận định các giao thức RT-PCR thông thường đối với H5 và H7 là có đủ độ nhạy để khuyếch đại một cách trực tiếp từ các mẫu quét tăm bông của gà bị nhiễm HPAI (51).

Các cải tiến trong áp dụng RT-PCR đã được áp dụng để giảm thời gian cho cả nhận diện phân chủng virus và phân tích kết chuỗi. Thí dụ như Spackman và cộng sự (53) áp dụng một hệ thống đoạn mồi RT-PCR một bước “thời gian thực”/đoạn thăm dò thủy phân nhuộm huỳnh quang (a ‘real time’ single-step RT-PCR primer/fluorogenic hydrolysis probe system) để cho phép phát hiện các virus cúm gia cầm và xác định phân chủng là H5 hay H7. Các tác giả kết luận rằng xét nghiệm thực hiện khá tốt để phân lập virus và cho ra lựa chọn về chẩn đoán rẻ tiền và nhanh chóng hơn (dưới 3 giờ) đối với các mẫu lâm sàng của gà. Xét nghiệm này cho ra độ nhạy và tính đặc hiệu tương đương với phân lập virus từ các mẫu quét khí quản và hầu họng của gà và gà tây, nhưng có thể thiếu độ nhạy cho phát hiện virus cúm A trong mẫu quét tăm bông có phân, mẫu phân và các mô từ một số loài chim, vì có sự hiện diện của một số yếu tố ức chế PCR dẫn đến kết quả âm tính sai (18). Việc kết hợp đối chứng dương tính nội bộ vào xét nghiệm sẽ kiểm soát được diễn tiến hoàn chỉnh trong xét nghiệm.

RT-PCR thời gian thực (real-time RT-PCR), thường dựa vào đoạn thăm dò thủy phân (hydrolysis probe) hay phương pháp “TaqMan” để tạo được dấu hiệu huỳnh quang đặc hiệu cho mục tiêu, đã trở thành phương pháp được chọn trong nhiều phòng thí nghiệm cho ít nhất là phần chẩn đoán một cách trực tiếp từ các mẫu lâm sàng. Phương pháp này nhanh chóng cho ra các kết quả, với độ nhạy và tính đặc hiệu tương đương với phân lập virus, và có chất lượng lý tưởng cho quản lý ổ dịch cúm gia cầm, khi mà tốc độ của các chẩn đoán ban đầu có thể thu được là điều cốt yếu cho Quan chức Thú y lập ra quyết định. Ngoài ra, các hệ thống RT-PCR có thể được thiết kế để thực hiện trên định dạng 96 giếng và được kết hợp với hệ thống tự động chiết xuất RNA từ các mẫu với năng suất cao (1).

Tiếp cận này đối với các chẩn đoán áp dụng RT-PCR thời gian thực đã được tích hợp trong hầu hết các phòng thí nghiệm dựa vào sơ bộ nhận diện gen di truyền của virus cúm gia cầm trong các mẫu lâm sàng, bắt đầu bằng nhắm đến gen sinh chất matrix (M), mà có đặc trưng cao cho tất cả các chủng virus cúm A, sau đó bằng xét nghiệm RT-PCR thời gian thực để phân chủng virus H5 và H7. Để nhận diện phân chủng, các đoạn mồi TaqMan được áp dụng trong các RT-PCR thời gian thực đều nhắm đến vùng HA2 vì đây là mục tiêu tương đối đặc trưng trong các gen haemagglutinin của các phân chủng H5 và H7, và vùng này đóng vai trò là vùng mục tiêu cho H5 và H7. Spackman và cộng sự (53) đã chứng minh rằng việc phát hiện đặc trưng những phân chủng này đã dẫn đến việc các kết chuỗi đoạn mồi/đoạn thăm dò của H5 và H7 được thiết kế cho phát hiện các dòng phân lập H5 và H7 Bắc Mỹ và không thích hợp với hầu hết các dòng phân lập H5 và H7 khác. Điều này đã được chứng minh. Slomka và cộng sự (52) đã mô tả biến đổi trong kết chuỗi oligonucleotide của H5 đã được sử dụng bởi Spackman và cộng sự (53) để cho phép phát hiện nhánh virus HPAI H5N1 ở Châu Á (Asian lineage HPAI H5N1 AI virus) và các virus cúm gia cầm H5 khác ở Châu Âu mà đã được phân lập trong thập kỷ qua ở cả gia cầm và chim hoang dã. RT-PCR thời gian thực cho xét nghiệm virus H5 nhánh Âu Á đã được đánh giá, chứng minh rằng có giá trị trong điều tra nhiều mẫu lâm sàng H5N1 HPAI được gởi đến Phòng thí nghiệm Tham chiếu Quốc tế, từ Châu Âu, Châu Phi và Châu Á, từ mùa thu 2005 (52).

Một trong những vấn đề trong việc đưa ra nhanh chóng các xét nghiệm mới, là các phương pháp và các giao thức có thể được phát triển và được báo cáo mà xét nghiệm không được đánh giá đầy đủ. Điều này đã liên quan đến một số giao thức RT-PCR thời gian thực (52, 56). Trong Liên minh Châu Âu, các Phòng thí nghiệm Tham chiếu Quốc gia đã được kếp hợp để nhận định và đánh giá các giao thức mà có thể được khuyến cáo cho áp dụng trong Liên minh Châu Âu (51, 52).

Các giao thức RT-PCR thời gian thực đã được mô tả về khuyếch đại các vùng qua vị trí phân cắt của gen HA0. Điều này có thể dẫn đến các xét nghiệm có ích về đặc trưng của virus. Thí dụ, Hoffman và cộng sự (27) đã mô tả một xét nghiệm RT-PCR thời gian thực đặc hiệu cho các virus Asian HPAI H5N1 Quinghai clade 2.2 mà cho ra các phương cách nhanh chóng để phát hiện chủng gây bệnh đối với phân nhóm của các virus H5N1 HPAI mà không cần phân tích kết chuỗi.

Các cải tiến cho phương pháp RT-PCR đơn giản về phát hiện RNA của virus đã được thiết kế để giảm tác động của các chất ức chế trong mẫu đem xét nghiệm, giảm khả năng vấy nhiễm các acid nucleic và giảm thời gian cần thiết cho ra kết quả. Thí dụ, phân tích kết chuỗi acdi nucleic dựa vào khuyếch đại (nucleic acid sequence-based amplification – NASBA) với phát hiện hóa phát quang điện tử (electrochemiluminescent detection) (NASBA/ECL) là phản ứng cách nhiệt liên tục (isothermal reaction), trong đó không cần đến thiết bị chuyên dụng gia nhiệt theo chu kỳ. Các xét nghiệm NASBA đã được phát triển để phát hiện virus cúm gia cầm thuộc các phân chủng H7 và H5 trong các mẫu lâm sàng trong vòng 6 giờ (15, 29). Hệ thống khuyếch đại lặp lại qua trung gian cách nhiệt (loop-mediated isothermal amplification – LAMP) cho phát hiện H5 đã thể hiện có độ nhạy cao và có tính đặc hiệu tin cậy (28).

Cho thấy rằng trong thời gian rất ngắn, kỹ thuật phân tử sẽ phát triển đủ để cho phép xét nghiệm nhanh chóng trên cơ sở “số đông – flock side” để phát hiện sự hiện diện của virus cúm gia cầm, phân chủng đặc trưng và các yếu tố độc lực. Sự phát triển rộng rãi những xét nghiệm này trong chẩn đoán bệnh cúm gia cầm tùy thuộc rất nhiều vào việc chấp thuận cho ban hành các định nghĩa của luật lệ đối với bệnh nhiễm cho các mục đích kiểm soát và giao thương.

Điều quan trọng là chỉ áp dụng vaccin không thôi thì không được coi là giải pháp cho kiểm soát các phân chủng NAI hay LPAI, nếu muốn có kết quả thanh toán bệnh dịch. Không có các hệ thống theo dõi, an toàn sinh học nghiêm ngặt và tiêu hủy khi đối mặt với bệnh nhiễm, thì có khả năng rằng các virus này sẽ trở nên thành dịch trong các quần thể gia cầm đã được cấp vaccin. Sự lưu hành lâu dài của virus trong một quần thể đã sử dụng vaccin có thể dẫn đến cả các biến đổi về tính kháng nguyên lẫn biến đổi về di truyền trong virus và điều này đã được báo cáo là xảy ra ở Mexico (31).

Thực nghiệm đã cho thấy, đối với cả NAI lẫn LPAI, việc áp dụng vaccin tạo được bảo hộ cho cả các dấu hiệu lâm sàng lẫn tỷ lệ tử vong, giảm thải tiết virus và gia tăng đề kháng đối với bệnh nhiễm, bảo hộ đối với các virus thực địa khác nhau cùng thuộc phân chủng haemagglutinin, bảo hộ đối với thử thách phơi nhiễm thấp lẫn cao (13, 19, 59, 65). Tuy nhiên, virus vẫn có khả năng nhiễm vào và sinh sôi trong các loài chim khỏe mạnh về lâm sàng mà đã được cấp vaccin. Hầu hết các công việc đánh giá vaccin đều được thực hiện trên gà và gà tây và một số lưu ý cần được quan tâm trong việc ngoại suy các kết quả thu được trên các loài khác. Thí dụ, trong một thực nghiệm sử dụng HPAI H7N7 làm virus thử thách trên gà và vịt cổ khoang (ringed teal duck), Callonetta leucophrys, việc áp dụng vaccin đủ làm giảm thải tiết và làm gia tăng liều gây nhiễm, mà sự truyền lây giữa các con chim này đã giảm đi rõ rệt, nhưng đối với gà lôi vàng (golden pheasant), Chrysolophus pictus, thì sự bảo hộ về lâm sàng không ảnh hưởng đến thải tiết virus thử thách và không ảnh hưởng đến sự truyền lây (69,70). Trong một số quốc gia, các vaccin được thiết kế có chứa hay ngăn ngừa NAI đều đặc biệt bị cấm hay không khuyến khích bởi quan chức chính phủ, vì cho rằng các vaccin này có thể làm cản trở các chính sách tiêu hủy. Tuy nhiên, hầu hết các luật lệ về kiểm soát bệnh cúm gia cầm thường cho phép sử dụng vaccin trong các tình trạng khẩn cấp.

Các vaccin sống phòng bệnh cúm bình thường đối với mọi phân chủng đều không được khuyến cáo.

Thông thường, các vaccin được sử dụng phòng ngừa NAI hay LPAI được chế tạo từ dịch ối gây nhiễm và đã làm bất hoạt bằng beta-propiolactone hay formaline và được tạo huyền phù với dầu khoáng.

Sự hiện diện của số lượng lớn các phân chủng virus, cùng với sự biến thể của các dòng khác nhau trong một phân chủng virus, đã tạo nên vấn đề lớn khi chọn lựa các dòng để chế tạo vaccin cúm, nhất là với LPAI. Ngoài ra, một số dòng phân lập không phát triển đầy đủ đến hiệu giá cao để tạo được các vaccin có đủ hiệu lực mà không phải chi phí cao trước khi cô đậm. Trong khi một số chiến dịch áp dụng vaccin tự sinh (autogenous vaccines), như vaccin được chế tạo từ các dòng phân lập tham gia đặc trưng trong một ổ dịch, thì các dòng phân lập khác đã được sử dụng để chế tạo vaccin từ các virus có cùng phân chủng haemagglutinin mà thu được hàm lượng kháng nguyên cao. Thí dụ, ở Mỹ, một số chuẩn hóa của vaccin từ phân chủng haemagglutinin đã được thực hiện trong Trung tâm Sinh học Thú y, là nơi nhân giống và lưu giữ các virus cúm thuộc một số phân chủng để sử dụng làm virus giống gốc trong chế tạo các vaccin bất hoạt (6).

Từ những năm 1970, ở Mỹ đã có một số ứng dụng của vaccin bất hoạt được chế tạo theo giấy phép đặc biệt trên cơ sở thương mại (25, 35, 43). Những vaccin này đã được sử dụng chủ yếu cho gà tây để phòng ngừa các virus không có khả năng gây bệnh cao, nhưng gây ra các vấn đề nghiệm trọng, đặc biệt trong các hoàn cảnh có phụ nhiễm. Các số lượng lớn vaccin đã được sử dụng (26, 35). Trong những năm gần đây, ở Mỹ, hầu hết vaccin được cấp phép đặc biệt được sử dụng trong chăn nuôi gà tây giống để tạo bảo hộ đối với các virus cúm heo H1 và H3 (58). Việc áp dụng phổ biến vaccin đối với dòng chiếm ưu thế của LPAI cũng đã được thực hiện ở Ý trong nhiều năm (17). Việc sử dụng vaccin đối với bệnh nhiễm H9N2 cũng đã được thực hiện ở Pakistan (39), Iran (72) và Trung Quốc (32) và một số quốc gia ở Trung Đông.

Vaccin bất hoạt chế tạo từ virus LPNAI của phân chủng H7N3 vốn là phân chủng chịu trách nhiệm trong một chuỗi các ổ dịch ở gà tây ở Utah vào 1995, và việc sử dụng vaccin này, cùng với các biện pháp khác, đã kiểm soát được các ổ dịch (26). Tương tự ở Connecticut vào năm 2003, việc áp dụng vaccin cho gà mái đẻ khỏi bệnh và thay thế gà mái tơ với vaccin H7N2 hay H7N3 đã được thực hiện sau một ổ dịch LPNAI do virus H7N2 (61).

Việc áp dụng vaccin phòng bệnh HPNAI do phân chủng H5N2 đã được tiến hành ở Mexico sau các ổ dịch năm 1994 – 1995 (21, 22, 31), và bệnh do phân chủng H7N3 ở Pakistan (38) sau các ổ dịch năm 1995. Ở Mexico, virus HPNAI thể hiện đã bị thanh toán, nhưng virus LPNAI của phân chủng H5N2 vẫn tiếp tục lưu hành, trong khi ở Pakistan, các virus bệnh cúm gia cầm có khả năng gây bệnh cao về gen di truyền có nguồn gốc gần với virus cúm gia cầm có khả năng gây bệnh cao vẫn phân lập được vào năm 2001 (66) và 2004. Sau các ổ dịch HPNAI do virus H5N1 ở Hồng Kông vào năm 2002 (48), một chính sách áp dụng vaccin đã được ban hành về sử dụng vaccin H5N2. Vào năm 2004, các ổ dịch lan tràn của virus AI H5N1 trong một số quốc gia thuộc Đông Nam Á đã dẫn đến phát sinh việc áp dụng vaccin và phòng ngừa bằng vaccin ở Trung Quốc, Indonesia và Việt Nam. Vaccin AI bất hoạt H7N7 đã được sử dụng ở Bắc Triều Tiên trong năm 2005 để kiểm soát một ổ dịch HPAI. Áp dụng vaccin để phòng ngừa (prophylactic vaccinnation)cũng đã được thực hiện trong các khu vực giới hạn ở Ý để giúp kiểm soát các virus LPNAI thuộc phân chủng H5 và H7. Tương tự, việc áp dụng vaccin để ngăn chặn (preventive vaccination) đã được phép thực hiện trong nuôi gà thả vườn và cho chim trong vườn thú ở một số quốc gia thuộc Liên minh Châu Âu trong những năm gần đây.

Các vaccin tái tổ hợp đối với virus AI đã được chế tạo bằng cách chèn một gen mã hóa cho haemagglutinin của virus cúm vào một virus sống làm trung gian mang và sử dụng virus tái tổ hợp này để tạo miễn dịch cho gà chống lại bệnh AI (60). Các vaccin virus sống làm trung gian mang có một số lợi điểm: 1) là vaccin sống, có khả năng kích thích cả miễn dịch dịch thể lẫn miễn dịch tế bào; 2) có thể cấp được cho các loài chim ở lứa tuổi còn non và tạo được bảo hộ sớm, thí dụ vaccin virus đậu gia cầm (fowl poxvirus) có thể được cấp lúc 1 ngày tuổi, tương thích với vaccin bệnh Marek, và cho ra bảo hộ rõ rệt lúc 1 tuần sau; 3) cho phép phân biệt giữa gia cầm đã được cấp vaccin với gia cầm bị nhiễm bệnh, do vaccin không kích thích tạo các kháng thể đối với các kháng nguyên nucleoprotein hay kháng nguyên sinh chất matrix, vốn thường có ở tất cả các virus cúm gia cầm. Do đó, chỉ các gia cầm bị nhiễm virus thực địa mới thể hiện các kháng thể trong các xét nghiệm AGID hay ELISA hướng trực tiếp đến phát hiện các kháng thể của bệnh cúm gia cầm nhóm A (kháng nucleoprotein và/hoặc matrix). Tuy nhiên, những vaccin virus tái tổ hợp hiện tại có hạn chế là virus vaccin sẽ sinh sôi kém và chỉ khiến tạo được một phần miễn dịch trong những con gia cầm mà bị phơi nhiễm với virus thực địa, hay những con gia cầm mà đã có sử dụng vaccin virus làm trung gian mang, như virus đậu gia cầm hay virus bệnh viêm hầu khí quản truyền nhiễm (infectious laryngotracheitis virus) (34, 62). Nếu sử dụng trên gia cầm 1 ngày tuổi hay gia cầm non, tác động của các kháng thể mẹ truyền đối với virus trung gian mang làm cho hiệu quả của vaccin có thể khác nhau theo chủng của trung gian mang. Trong trường hợp vaccin tái tổ hợp trong virus đậu gia cầm, đã có báo cáo rằng miễn dịch hiệu quả đã đạt được khi cấp cho gia cầm 1 ngày tuổi mà có các mức độ miễn dịch mẹ truyền khác nhau (4). Tuy nhiên, khi các mức độ rất cao của các kháng thể mẹ truyền có được do bị nhiễm hay do vaccin, hiệu quả của vaccin có trung gian mang là virus đậu gia cầm trên các gia cầm một ngày tuổi cần được xem xét lại. Ngoài ra, do các trung gian mang là các virus sống mà có thể có giới hạn về phổ ký chủ (thí dụ virus bệnh viêm hầu khí quản truyền nhiễm không sinh sôi trong gà tây), việc sử dụng những vaccin này phải được giới hạn đến những loài mà hiệu quả của vaccin đã được chứng minh.

Việc sử dụng các vaccin tái tổ hợp đã giới hạn ở những quốc gia mà luật lệ cho phép. Vaccin tái tổ hợp đậu gia cầm – AI – H5 (fowlpox-AI-H5) đã được cho phép ở El Salvador, Guatemala, Mexico, Trung Quốc và Mỹ (59, 82). Các vaccin tái tổ hợp trong virus đậu gia cầm chứa HA của virus H5 đã được chế tạo và đã được đánh giá trên thực địa (8, 23, 44, 63), nhưng chỉ áp dụng thực địa được thực hiện với vaccin này ở Mexico, El Salvador, Guatemala và Trung Quốc trong chiến dịch chống các virus LPAI H5N2 và HPAI H5N1. Giữa các năm 1995 và 2006, Mexico đã sử dụng trên 1,788 tỷ liều vaccin H5N2 bất hoạt trong chương trình kiểm soát H5N2 của họ (73, 74). Ngoài ra, Mexico, Guatemala và El Salvador đã sử dụng trên 1,6 tỷ liều vaccin tái tổ hợp đậu gia cầm – AI – H5 để kiểm soát bệnh LPNAI do virus H5N2 từ những năm 1997 đến 2005 và Trung Quốc đã sử dụng 606 triệu liều vào năm 2005 (82).

Virus bệnh Tân thành (Newcastle disease virus) cũng đã được sử dụng làm trung gian mang để thể hiện các gen HA của virus cúm (40). Một vaccin virus bệnh Tân thành tái tổ hợp (ghép vô tính 30 – clone 30) có chứa và thể hiện một gen HA của virus H5 đã thể hiện bảo hộ cho gà đối với thử thách cả về virus bệnh Tân thành lẫn virus H5N2 gây bệnh HPAI (71). Một virus tái tổ hợp tương tự dựa vào virus dùng chế tạo vaccin bệnh Tân thành thuộc chủng La Sota và thể hiện gen HA của phân chủng H5 thuộc nhánh virus cúm gia cầm Châu Á, đã được chế tạo tại Trung Quốc (24) và đã được báo cáo là có hiệu quả bảo hộ trong các nghiên cứu với cả hai loại virus. Virus tái tổ hợp dùng làm vaccin này đã được cấp phép ở Trung Quốc và đã được sử dụng rộng rãi thành một trong bốn loại vaccin H5 đã được cho phép dưới chính sách bắt buộc sử dụng vaccin hiện tại, dẫn đến việc cấp vaccin cho 8,2 tỷ gia cầm từ tháng Giêng đến tháng Chín năm 2006 (36). Giống như các vaccin tái tổ hợp khác, vaccin này có nghi ngờ rằng chỉ thích hợp sử dụng cho những gia cầm già tuổi hơn mà đã có miễn dịch tốt đối với bệnh Tân thành, và chưa rõ là hiệu lực sẽ bị ảnh hưởng đến mức nào bởi sự có mặt của miễn dịch mẹ truyền đối với cả virus trung gian mang lẫn đối với HA của virus cúm gia cầm, trên gà con. Một hệ thống baculovirus thể hiện đã được sử dụng để tạo ra các kháng nguyên tái tổ hợp H5 và H7 để kết hợp vào thành các vaccin (75). DNA mã hóa cho haemagglutinin của virus H5 đã được đánh giá là một vaccin có tiềm năng trên gà (30).